RNA干扰的研究进展

60 生 ；TIE 物 R 技 B10T 术 ECH L0G 讯 Y v 01．15 N0_1 Jan，2004LE RS IN 10 HN0L0 Vo ： !： 竺： 3Eim~：1009——0002(2004)01——0060——03 RNA干扰的研究进展 董艳珍 ，李关荣 西南农业大学 农学与生命科学学院，重庆 400716 综 述 摘要：RNA干扰是指外源双链RNA进入细胞后引起与其同源的mRNA特异性降解的现象，它是真核生物在长期进化中形 成的一种保守 的防御机制，对 真核生物有着重要的意义，它参 与真核 生物抵御病毒侵 染、阻断转座子 的异常活动 ，调控基因 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达 。RNA干扰 已成 为一种进行基 因功能分析的强有力 的工具 ，并有望成为最有潜力的基因干预 治疗 方法。 关键词：RNA 干扰 ；双链 RNA；基 因沉默；mRNA；基 因治疗 中图分类号：Q78 文献标识码：A Advances in RNA interference DONG Yan-zhen，LI Guan—rong College of Agronomy and Life Sciences，Southwest Agricultural University，Chongqing 4007 1 6，China Abstract： RNA interference(RNAi)is an evolutionarily conserved eukaryotic adaptive response that leads to the specific degradation of target mRNA species in response to cellular exposure to homologous double—stranded RNA molecules．RNAi is to eukaryote important in that it mediates resistance to both endogenous parasitic and exogenous pathogenic nucleic acids。 and regulates the expression of protein—coding genes． RNAi is now a powerful instrument for functional genomic analyses and will be a potentially useful method in highly specific dsRNA based gene—silencing therapeutics． Key words：RNA interference；dsRNA；gene silence；mRNA；gene therapy 一 些 小的双链 RNA可以高效 、特异地阻断体 内特定基因的 表达，促使 mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型， 这种现 象被称为 RNA干扰 (RNA interference，RNAi)。RNAi现 象广泛存 在于线虫 、果 蝇 、斑 马鱼 、真菌及植 物等大 多数真核 生 物 中，这些真核生物利 用 RNAi来 抵御病毒 的感 染 ，阻断转座 子 的作用。RNAi能高效特异地阻断基因的表达 ，在线虫 、果蝇体 内，RNAi都能达到基因敲除的效果；在小鼠和人的体外培养细 胞 中 RNAi技术也成功地阻断了基因的表达 ，实 现了细胞 水平 的 基因敲除；而最近研究则在自身免疫性肝炎小鼠模型中预防了 肝衰竭和肝硬化。由于 RNAi潜在的重要意义和近几年来的研究 进展，Sc／ence杂志在 20o1年将其列为十大科学成就之一，2002 年又将其列为当年十大科学成就之首；Nature杂志也将小 RNA 评 为 20o2年重大科技成果之一 。 1 RNAi的发现与探索 1995年康乃尔大学的 GuoI 】博士在实验中想通过反义 RNA 阻 断美 丽线虫 (C．elegans)的 par一』基 因表达 ，同 时她 还用 正义 RNA做了一个对照，试图观察到对照试验组基因表达增强的现 象，但结果却发现了反义和正义 RNA都阻断了该基因的表达。 Guo等人一直不能解释该现象。直到 1998年 FireI 1等才发现这是 收稿 日期 ：2003—05—20 作者简介：董艳珍(1977一 )，女，硕士研究生。 E—mail：dongxy2002@yahoo．corn．cn 由于 Guo博士在试验中污染了双链 RNA而引起的；他们还证明 转录得到 的单 链 RNA经 纯化后注 射线虫所 引起 的阻断作用 十 分微弱 ，而经纯化 的双链 RNA则 能高效特异地阻断相应 基因的 表达 ，他们将此称 为 RNA干扰。RNAi潜在 的作用促使 Fire和 Timmons继续实 验 ，将能够表达 出与 C．elegans UlZC一22基 因同源 的双链 RNA的细菌喂食线虫 ，结果 线虫 表现出类似 U／ZC一22缺 失的表型【31。后继的实验表明将线虫浸在 RNA中同样可诱使基 因沉默。这种技术使得大规模筛选线虫 RNAi诱导的功能缺失突 变体成为可能 ，并引发出随后大量针对这种模式生物基因敲除 的研究。目前正在应用 RNAi技术对线虫中几乎所有的在基因组 中预测的约 19 000个基因的功能进行研究 。 RNAi也存在于植物和真菌中。早在 1990年，Jorgensen和同 事将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后导入矮牵牛 中 ，试 图加深花朵 的颜 色 ，结 果没有得到 期待 中的深 紫色花朵 ， 多数花成 了花斑 的甚至 白的。这种现象被命名 为协 同抑 制(CO— suppression) ，因其发生在基因转录后水平 ，所以又被称为转录 后基 因沉 默 (post—transcriptional gene silencing，PTGS)。在 真菌 中也发现了类似的现象，称为“quelling”。科学家们发现PTGS和 RNAi在本质上是一致的，同属一类被称为“转录后 RNA沉寂” 的机制。在果蝇的研究中同样发现了 RNAi，通过显微注射或基 因枪将双链 RNA注入果蝇胚胎中或将带有反向重复序列的 DNA导人果蝇 中能够引发基因沉默。在过去几年中 ，RNAi技 术 在果蝇 的研究中成为一种反向遗传工具。在哺乳动 物细 胞中寻 找 RNAi则费 了一番工 夫 ，这是 因 为大于 30个 核苷 酸的双链 维普资讯 http://www.cqvip.com 董艳珍等：RNA干扰的研究进展 RNA进 入哺乳 动物成体细胞后 ，会 非特异性 阻断基 因的表达 。长 的双链 RNA进入哺乳动物成体细胞后 ，细胞内的病毒防御机制 被激活，细胞内干扰素生成增加，蛋白激酶PKP被激活，使转录 因子 eIF2a被抑制 ，非特异地阻断基 因的转 录 ；另一方面 ，RNA 酶 L被激活 ，产生非特异性 mRNA降解 ，而在未分化的胚胎细胞 中，此防御病毒的机制存在缺陷，双链 RNA能特异阻断基因的 表达。将 727个碱基对的双链 RNA转入小鼠的畸胎瘤细胞 ，诱 发 了细胞 内的 RNAi机制 ，并抑 制了报告基 因的表达 。TuschlI61 等 人的研 究工作克服 了 RNAi在 哺乳 动物成 体细胞 中应 用的限 制，他们发现 21个核苷酸的双链 RNA能诱发哺乳动物细胞内 的RNAi机制，同时不会激活细胞内的干扰素。他们合成了以荧 光素酶的 mRNA为靶分子的21个核苷酸的双链 RNA，将它和 荧光 素酶 的表达 质粒 用脂质 体共 转 染到 NIH3T3、COS一7、 HeLaS3、293细胞中，报告基因的表达被抑制了 90％ 他们又合 成了以细胞 内源性 基因 LaminA／C为靶 目标 的双链 RNA，这个 双链 RNA也特异地抑制 了 LaminA ／C的表 达 ，抑制率达 90％以 上。近来 的研究 表明 ，在人细 胞 中 RNAi是 发 生在细胞 质 中 ， mRNA在由核向细胞质的转运过程中也会受到特异性降解 ，但 细胞核中的mRNA却不会被降解。 RNAi现象存在于除酵母以外的几乎所有真核生物中，而在 古细菌和原核生物中没有发现。从遗传和生化的角度分别进行 研究指出PrCS具有进化的保守性 ，可能在生命的早期就存在， 推测这种机制是真核生物所特有 的一种古 老的调控基 因表达及 防范病毒入侵或转座子诱导基因组 DNA突变的手段 。 2 RNAi的作用机制 RNAi的作用机制主要是在线虫 、果蝇等生物体内被阐明 的。生物体内的双链 RNA可来 自 RNA病毒感染、转座子的转录 产物 、外 源导人 的基因 。这些来源 的双链 RNA诱发 了 RNAi机 制 ，结果在 病毒被清 除 、转 座子 的表 达被阻断 、外源 导人的基 因 被阻断的同时，与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。 Dicer酶是 RNaseⅢ家族 中特异 识别 双链 RNA的一员 ，广泛 存在于蠕虫 、果蝇 、真菌植物及哺乳动物中，它参与 RNAi的发 生。Dicer酶能以一种ATP依赖的方式逐步切割外源导人或由转 基因 、病毒感染 等各 种方式 引入的双 链 RNA，切割将 双链 RNA 降解成 21~23个核苷酸的siRNA(short interference RNA)，它启 动了细胞 内的 RNAi反应 。siRNA具有 特征性 的结 构 ：5 末端 为磷 酸基 ，3 末 端为羟基 ，并且 有两个 突出的单链 核苷酸 ，这种 结构对 RNAi是十分必要 的 ，研究表 明平末端 的 siRNA或失去 5 末 端磷 酸基 团的 siRNA不具有 RNAi功能191。另外，参与 RNAi 的酶还有 RNA指导 的 RNA 聚合 酶 (RNA directed RNA poly— morase，RdRP)。RdRP可使进入细胞内的双链 RNA通过类似于 PCR的反 应过程呈指数级的数量扩增 ，从而使 RNAi效应得 以放 大，少量的双链 RNA就能使大量的靶 mRNA沉默。 双链 RNA进入细胞后 ，一方面在 Dicer酶作用下被裂解成 siRNA，另 一方 面在 RdRP作用 下 自身扩增 后再被 Dicer酶裂 解 成 siRNA。siRNA的双链解开成为单链 ，并 和某些 蛋白形成 复合 物 ，Argonaute2是 目前唯一 已知参与 复合物形成的蛋 白ll0J。此 复 合物同与 siRNA互补的 mRNA结合 ，使 mRNA被酶降解，同时 又以 siRNA作 为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 ，在 RdRP用下合成 mRNA的互补链 ，¨结 果 mRNA也变成了双链 RNA，它在 Dicer酶的作用下也被切割 成 siRNA。这些新生成的 siRNA也具有诱发 RNAi的作用 ，通过 这个聚合酶链式反应，细胞内的 siRNA大大增加，显著增加了对 基因表达 的抑 制。从 21—23个核苷酸 的 siRNA到 几百 个核苷酸 的 RNA都能诱发 RNAi，但 长的双链 RNA阻断基因表达 的效果 明显 强于短的双链 RNA。 3 RNAi对生物的功能意义 双链 RNA介导的 RNAi对生物体具有重要 意义 ，主要体现 在以下几个方面 ：①防御病毒感染：在植物细胞中，细胞能抑制 侵入病毒的复制和传播所必需 的基 因，这 种抑制是通 过病 毒 自 身产生的双链 RNA诱导进行 的 ；但病毒感染的动物 RNAi是通 过诱 导 I型干扰 素、激活 蛋白激酶 PKP和激活 RNaseL而起防御 作用的；②维持基因组中转座子的稳定：多种模式生物的研究表 明 ，剔除 RNAi相关的基因会导致异 常的转座子 运动 ，说 明 RNAi 具有防止转座子在基 因组 中异常转位 的功能 ；⑧参 与胚胎发育 ： 线虫的 EGO一1既参与 RNAi作用 ，又为线虫 生殖 细胞 发育所必 需 ；( 参与发育的调控：破坏 RNAi相关的基因常导致严重的发 育缺陷。拟南芥中的AGO1突变体在表现为协同抑制缺陷的同 时也表现为叶发育缺陷。 4 RNAi的应用 4．1 RNAi在功能基因组 中的应 用 在功能基 因组 的研究 中，需要 对特 定基 因进行功能丧 失或 降低的突变以确定其功能。RNAi具有高度的序列专一性，可以 特异地使特定基因沉默 ，获得功能丧失或降低的突变，因此 RNAi可作为功能基因组研究的强有力的手段，可以大大加快研 究进程 ，如 原来要 花费 6个月 至 1年的时间才能 明确 一个哺乳 动物细胞基因如何关闭，现在只需一个星期就能明确 10个基因 的关闭。将功能未知的基因的编码区(外显子)或启动子区以反 向重复的方式由同一启动子控制，这样在转基因个体内转录出 的 RNA可形成双链 RNA，产生 RNA干扰 ，使 目的基因沉默，从 而可 以进一步研究基因的功能 。 最初的 RNAi技术是通过浸泡或注射等方法将双链 RNA直 接导人细胞或胚胎 中以关 闭基 因的表达 ，但 由此产生 的表 型变 化不能遗传 ，因此 RNAi局限于研究与胚 胎发育有关 的基 因的功 能，而在研究成体基因功能时则受到限制。另外由于 RNA容易 被 RNA酶降解，在体外无论以生物或化学的方法合成，成本都 较高 ，而且 哺乳 动物 中缺 乏 siRNA 自我 增殖 机制 ，所以用这种方 法介导的 RNAi在哺乳动物细胞中持续 时间较短 ，这在 一定程度 上限制了 RNAi技术在哺乳动物中的应用。多个研究小组尝试在 细胞合成siRNA的RNAi技术，从而大大降低了实验的成本，增 加了RNAi技术的可操作性。Miyagishi等『l21建立了U6启动子介 导的 siRNA体内合成方式 ，成功地抑制 了靶基因在哺乳动物 中 的表达。他们构建了两个 U6启动子分别介导合成 l9个核苷酸 的正义和反 义 RNA，这两段 RNA能够在体内 自动形成双链 RNA：U6启动子是 RNA聚合酶Ⅲ家族启动子，在体内能够很好 地介导 siRNA两条链的合成 。Shi等．13 用 Bluescript载体 ，U6作为 启动子 ，从绿色荧光 蛋白(GFP)的基 因上选择 了一 个 21个核苷 维普资讯 http://www.cqvip.com 62 生 物 技 术 通 讯 LETrERS IN BIOTECHNOLOGY Vo1．15 No．1 Jan．2004 酸的片段(片段 1)，将其插入到 Bluescript载体中．然后台成出片 段 1的反向重复序列 ，并在其后加 了 5个胸腺嘧啶 ．称 为片段 2 他 们将 片段 2接到 Bluescript载体中片段 1的后面 ，将载 体转 到 细胞 中后 ，转 录出的 RNA由于具 有 回文序 列 ，会形 成一 个发卡 结 构，从而得到双链 RNA。片段后面加 了 5个胸腺嘧啶 ，RNA转 到这个位置就会终止 ，而且转 录出的 RNA形 成发卡结 构后 ，会 在 3 端形成 2个突 出的尿嘧啶 ，这类似 于天然的 siRNA，因而有 利于双链 RNA诱发 RNAi。Tavemarakisi’ 等将 目的基 因的靶序列 以反向重复的方式，由热激启动子控制在转基因生物中表达。反 向重复的序列的转录产物会形成具发夹环结构的双链 RNA，诱 导 RNAi的产生 ，使 目的基因沉默 。这种 RNAi技术有 明显的优 点：转基因可遗传给后代，有利于突变的分析；双链 RNA可以被 诱导产生，RNAi能在发育的特定阶段出现，从而使研究发育早 期必需基因在发育晚期的功能成为可能；当用细胞特异性启动 子控制双链 RNA的表达时可以研究特定基因在不同器官中的 功能。含有启动子区的双链 RNA在植物体内同样被切割成 2l～ 23个核苷酸的片段 ，这种双链 RNA可使 内源相应的 DNA序列 甲基化 ，使启动子失去 功能 ，沉默其下游基 因。采用启 动子 区 RNAi技术有望将多基因家族内高度同源的各个成员区分开来 研究。综合编码 区 RNAi技术和启动子区 RNAi技术 的信息可更 全面地了解 多基因家族 各成员的功能 。 4，2 RNAi在基 因治疗中的应 用 目前 抑制基 因表达常用 反义 RNA技 术或转入 没有功 能 的 突变体与该基因竞争 ，这两种方法对基因表达的抑制都不如 RNAi高效 、特异 、持久 。作为基因治疗 的工具 ，RNAi既高效特异 又简便易行 。RNAi在某个基因表达异常增 高引起 的疾病中会非 常有用 ，如病毒感染 、肿瘤 等。CDK一2是调控细胞周期的一个关 键基因 ，用 以 CD 一2为靶 目标 的双链 RNA能 阻断 99．7％细胞中 CD 一2的表达 ，而在对照 中只有 0，2％的细胞中 CD 一2基 因的 表达降低【l引，因而以 CDK一2为靶 RNA能治疗细胞异常增殖的相 关 疾病 。将 HIV一1的 rev的基 因和与它同源的双链 RNA共转 染 到293细胞，rev基因的表达被显著抑制I】51。许多肝病表现为肝细 胞 死亡 ，而肝 细胞的死亡往 往是由 Fas蛋 白所致 ，如能逆转或 阻 止这种细胞死亡，将能治疗许多种肝病如自身免疫性肝炎、病毒 性肝炎、移植排斥性肝炎等。通过 RNAi技术使 Fas受体沉默，成 功地在自身免疫性肝炎小鼠模型中预防了肝衰竭和肝硬化，研 究发现未接受 RNAi治疗的小鼠有 40％在 3天内死亡，而40只 RNAi治疗的小 鼠有 33只存 活 ，l0天后检查 发现这些小 鼠的肝 脏完全正常I 。 4．3 基 因表达的调控 RNAi在 Epigenetics中发挥重要作用 。Epigenetics是指至少 一 代的基因表达 的改变 ，而基因的编码并未改变 ；染色体形状 的 改变是其 中一种类型 。通过染色体形状的改变(更紧或更 松)，能 够决定哪一个基因表达。siRNA在染色体形状的改变中起 着非常 重要 的作用 ，这样 RNAi能永久地关 闭基因的表达 ，而不 仅仅是 短期抑制它。通过在发育中关闭或开放基因的表达，siRNA在染 色体形状的改变中起着非常重要的作用。通过在发育中关闭或 开放基因的表达，siRNA可能指导着细胞的定向分化。RNAi已被 证实能引导植物干细胞的分化 ，因而研 究者认 为 RNAi可能 参与 指导人 的干细胞的分化。由于 RNAi在基因表达调控中发挥重要 作用，RNAi微小的干扰就可能会导致肿瘤的发生。 目前 RNAi在线虫 、果蝇以及植物中的应用 已取得 了很多成 果，在哺乳动物中的研究和应用也已取得不少进展。RNAi在疾 病治疗中的应用前景是研究者以及大众关注的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ，一些生物 制药公司 已经 获得 了巨额风险投 资用于 RNAi药物 的开发和研 究。有理由相信 RNAi技术将会在我们的生活中产生巨大的作 用 ，不过在取得最终 的成 功之前 尚有一 些问题需要克 服：一是在 哺乳动物细胞中 ，RNAi还不能完全阻断基 因的表达特别是表达 异常高 的基 因 ；另外如何 使双链 RNA高效 、特异 且安全 地进入 人体是 RNAi治疗亟待解 决的一个难题 。目前 已能用腺病毒作为 裁体在体内实现 RNAi，但仍需寻找更为安全有效的载体。 参考文献 [1] Guo S， Kempheus KJ． Par一1，a gene required for establishing polaring in Celegans embryos， enkinase that asymmetrically distributed[J]．Cel1．1995．81：611 [2] Fire A， Xu S， Mello CC， ei nf． Potent and specific genetic interference by double—stranded RNA in C．elegans[J]．Nature，1998， 391：806 [3] Timmons L， Court D， Fire A． Ingestion of bacterially expressed dsRNA can produce specific interference in Celegans『J]， Gene， 2001．263：1O3 Napoli C， Lemieux C， Jorgensen RA． Introduction of a chalcone synthase gene into Petunia result suppression of homologous genes in trans[J] P1ant Cel1．1 990．2，279 【5] Simmer ST．Fire A．On the role of RNA amplification in dsRNA— triggered gene silencing[J]，Cell，2001，107：465 【6] Elbashir SM，Lendeckel W usehl el nf，Duplexes of 21一nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells【J]， Nature．20o1．41 1：428 [7] Sharp PA．RNA Interference-2001『J]．Genes Dev，2001，15：485 【818 Bemstein E， Hammond SM， Hannon GJ． Role of bidentate riboniclease in the initiation step of RNA interference[J1’ Nature， 2()02-409：363 【9] Nykanen A，Haley B， Zamore PD， el ArrP Requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway fJ] Cel1．2001．107：309 【10】Hammond SM，Kobayashi R，Hannon GJ，et nf．Argonaute2，a link between genetic and biochemical analyses of RNAi【JJ． Science， 2001．293：1146 【l1】 Lipardi C， Wei Q， Paterson BM， RNAi as random degradative PCR：siRNA primers convert mRNA into dsRNA that ale degraded to generate new siRNAs[J]．Cel1．2001．107：297 【12]Miyagishi M，Taira K．U6 promoter—driven siRNA with four uridine 3 overhangs efficiently suppress targeted gene expression in manll'nalian cells[J]．Nat Biotech，2002，20：497 [1 3】 Sui GH， Soohoo C， Shi Y， et o1． A DNA vector—based RN technology to suppress gene expression in mam malian cells ． Proc Natl Acid Sci USA．2002．99：5515 [14] Tavemarakis N， Wang SL， Dorovkov I， et o1． Heritable and inducible genetic interference by double—stran ded RNA encod ed bv transgenes ．Nature Genetics，2000，24：180 【15]Lee NS，Bauer G，Rossi J．Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cellsⅡ】． Nat Biotech．20o2．2O：50o [16】Song E，Lee SK，Wang J，et nf．RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis ． Nature Medicine，2003．9： 347 维普资讯 http://www.cqvip.com