RNAi技术及其应用

收稿日期:2007-02-06 基金项目:校人才基金(04WD10) 作者简介:伍林涛(1977-),男,硕士研究生,研究方向:作物细胞工程与基因工程 通讯作者:刘春林,教授,博士生导师,liucl@hunau.edu.cn RNA干扰[1]是指一些小的双链 RNA可以高效、 特异地阻断体内与之同源基因的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达,诱使细胞表 现出特定基因缺失的表型。RNAi作为关闭特定基 因功能的新技术,为基因功能的研究提供了一个快 速、简便的方法,RNAi正在功能基因组学领域掀起 一场革命,并最终加速这个领域的研究步伐。由于 RNAi潜在的重要意义和近几年来的研究进展, Science杂志在 2001年将其列为 10大科学成就之 一,2002年又将其列为当年 10大科学成就之首, Nature杂志也将小 RNA评为 2002年重大科技成 果之一。 1 RNAi的发现 早在 1990年,jorgenson和同事将一个能产生色 素的基因置于一个强启动子后导入矮牵牛中,试图 加深花朵的颜色,结果没有得到期待中的深紫色花 朵,多数花成了花斑的甚至白色的,这是因为导入的 基因及与其相似的内源基因同时都被抑制所致[2]。 发现双链 RNA(doublestrandRNA,dsRNA)能够导 致基因沉默的线索来源于对线虫的研究,1995年 康乃尔大学的 Guo[2]博士在实验中想通过反义 RNA 阻断美丽线的 par-1基因表达,试图破坏线虫卵裂 的不对称性,同时她还用正义 RNA做了一个对照, 试图观察到对照试验组基因表达增强的现象,但结 果却发现反义和正义 RNA都阻断了该基因的表 达,这种现象很难解释,因为与反义 RNA技术的 传统机制完全违背。1998年华盛顿卡耐基研究院 的 AndrewFire[3]和马萨诸塞大学癌症中心的 Crnaig mello将 T4和 T7RNA聚合酶体外转录制备的单链 RNA电泳纯化后再注射于线虫,结果发现只有微 弱的基因抑制作用,而将纯化后的 dsRNA或正义 RNAi技术及其应用 伍林涛 1 阮颖 2 彭琦 1 张源 1 刘春林 2 (1湖南农业大学农学院,长沙 410128;2作物基因工程湖南省重点实验室,长沙 410128) 摘 要: RNA干扰是指外源双链RNA进入细胞以后引起的与其同源mRNA特异性降解的现象,它参与真核生物 抵抗病毒侵染,阻断转座子的异常活动,调控基因表达。RNAi已成为一种进行基因功能分析的强有力的工具,并有望成为 最有潜力的基因干预治疗方法。 关键词: RNA干扰 基因沉默 mRNA 基因治疗 RNAinterferenceTechniqueandtheUsing WuLintao1 RuanYing2 PengQi1 ZhangYuan1 LiuChunlin2 (1CollegeofAgronomyHunanAgriculturalUniversity,Changsha410128;2CropGeneEngineeringKeyLaboratoryofHunan Province,Changsha410128) Abstract: RNAinterference(RNAi)isanevolutionarilyconservedeukaryoticadaptiveresponsethatleadtothe specificdegradationoftargetmRNA speciesinresponsetocellularexposuretohomologousdouble-strandedRNA molecules.Itistobothendogenouspathogenicnucleicacids,andregulatestheexpressionofprotein-codinggenes.RNAiis nowapowerfulinstrumentforfunctionalgenomicanalysesandwillbeapotentionallyusefulmethodinhighlyspecific dsRNAbasedgene-silencingtherapeutics. Keywords: RNAiGenesilence mRNA Genetherapy 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2007年第4期 2007年第4期 链和反义链的混合物注入线虫,发现 dsRNA能够 高效特异地阻断相应基因的表达,而且抑制基因表 达的效率比单链 RNA至少高 2个数量级,由此可 以看出,正义 RNA引起的基因抑制是因为其中混 入了极少量的 dsRNA。 2 RNAi机制 RNAi作用机制主要是在线虫、果蝇等生物体 内被阐明的。生物体内的双链 RNA可来自 RNA病 毒感染,转座子的转录产物,外源导入的基因,这些 来源的双链 RNA诱发了 RNAi机制,结果在病毒被 清除,转座子的表达被阻断,外源导入的基因被阻 断的同时,与其同源的细胞基因组中的基因表达也 被阻断,对于 RNAi所导致的基因沉默我们可对其 进行简单的分类: 2.1 转录后沉默(pasttranscriptionalgenesilencing PTGS)[4] 转录后沉默指的是内源基因在转录出 mRNA 后,由外源 dsRNA介导的引起 mRNA降解,从而导 致内源基因沉默,其大致过程,如图 1所示。 首先可能在 Argonaute蛋白的协助下,Dicer酶 识别外源长的双链 RNA分子(dsRNA),并以一定 的间隔将 dsRNA切成 22个核苷酸大小的小干涉 RNA分 子 (siRNA)、siRNA随 即 与 效 应 物 RISC (RNA诱导的沉默复合物)结合,在 ATP的作用下 解旋,从而 RISC由 250kD大小的前体形式变成约 100kD左右的 RISC活性形式 (RISC通过碱基互补 配对的原则,siRNA识别与自身具有同源序列的内 源 mRNA,最后通过 RISC将 mRNA降解,从而达到 阻止靶基因表达,使其沉默的目的)。 2.2 转录水平的基因沉默 植物外源的双链 RNA可以导致其基因组上的 DNA序列甲基化[5],如果甲基化出现在编码区,则 转录照常进行,但其表现转录后水平的沉默 (PTGS)如果甲基化出现在启动子区域,则转录不 能进行,从而表现为转录水平的沉默现象(TGS) TGS不如 PTGS稳定,也不具备可遗传性。 2.3 翻译水平的基因沉默 相关的数据表明,在脊椎动物和无脊椎动物 中,广泛存在小分子调控 RNA,被称为[6~9]miRNA (micro-RNA),在 miRNA中,小分子时序调控 RNA 占有相当大的比例,stRNA不会被翻译为蛋白质, 也不会导致 mRNA的降解,但能影响到蛋白质的 合成,从而最终也可能导致相关基因的沉默。 3 RNAi的应用 3.1 RNAi在功能基因组中的应用 尽管 RNAi机制还没有完全阐明,但人们最为 关心的仍然是 RNAi作为强有力的研究工具,在基 因功能组学领域内所发挥的巨大作用,目前果蝇、 线虫、水稻、小鼠以及人类基因组的大规模测序工 作已经完成,基因功能的研究已经提到议事日程[10], 从应用的角度来看,RNAi非常适合于基因功能的 大规模研究。这是因为:(1)RNAi可以非常简便地 代替基因敲除来制备特定基因缺失表型个体,从而 研究该基因的功能;(2)通过导入多种 dsRNA, RNAi可以实现同时敲除多个基因;(3)如果导入带 可诱导调控元件的 DNA,使基因在需要的时候转 录出特定的 dsRNA,可以在细胞特定的发育时期观 察基因敲除的效果。另外 RNAi具有高度的序列专 一性,可以特异地使特定基因沉默,获得功能丧失 或降低的突变。因此,RNAi可作为功能基因组研究 的强有力的手段,可以大大加快研究进展,如原来 要花费 6个月至 1年的时间才能明确一个哺乳动 物细胞基因如何关闭,现在只需一个星期就能明确 10个基因的关闭。将功能未知的基因的编码区(外 显子)以反向重复的方式由同一启动子控制,这样 图 1 转录后沉默机制 伍林涛等:RNAi技术及其应用 83 生物技术通报Biotechnology Bulletin 2007年第4期 (下转第96页) 在转基因个体内转录出的 RNA可形成双链 RNA, 产生 RNA干扰使目的基因沉默,从而可以进一步 研究基因的功能。 最初的 RNAi技术是通过浸泡或注射等方法将 双链 RNA直接导入细胞或胚胎中以关闭基因的表 达,但由此产生的表型变化不能遗传。因此,RNAi 局限于研究与胚胎发育有关的基因的功能,而在研 究成体基因功能时则受到限制。另外由于 RNA易 被 RNA酶降解,而哺乳动物中缺乏 siRNA自我增 殖机制,所以用这种方法介导的 RNAi在哺乳动物 中持续的时间较短,这在一定程度上限制了 RNAi 技术在哺乳动物中的应用。多个研究小组尝试在细 胞合成 siRNA的 RNAi技术,从而大大降低了成本, 增加了 RNAi技术的可操作性,Shi等用 Bluescripe 载体,U6作为启动子,从绿色荧光蛋白(GFP)的基 因上选择了一个 21个核苷酸的片段(片段 1)将其 插入到 Bluescript载体中,然后合成出片段 1的反 向重复序列,并在其后加了 5个胸腺嘧啶,称为片 段 2。他们将片段 2接到 Bluescript载体中片段 1的 后面,将载体转到细胞中后,转录出的 RNA由于具 有回文序列,会形成一个发卡结构,从而得到的双 链 RNA片段后面加了 5个胸腺嘧啶,RNA转录到 这个位置就会终止,而且转录出的 RNA形成发卡 结构后,会在 3端形成 2个突出的尿嘧啶,这类似 于 天 然 的 siRNA,因 而 有 利 于 双 链 RNA诱 发 RNAi。这种 RNAi技术有明显的优点,转基因可遗 传给后代,有利于突变的分析,双链 RNA可以被诱 导产生,RNAi能在发育的特定阶段出现,从而使研 究发育早期必需基因在发育晚期的功能成为可能, 当用细胞特导性启动子控制双链 RNA的表达时可 以研究特定基因在不同器官中的功能。 3.2 RNAi在抗肿瘤中的应用 肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的 结果,是一种多基因遗传病,单个的癌基因的阻断 不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长,由于 RNAi能 够在哺乳动物系统中被用来灭活特异序列的基因 片段,许多学者便考虑凭借此技术在基因水平上对 肿瘤进行治疗,并且 RNAi可以利用同一基因家族 的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一 特征, 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 针对这一序列的 dsRNA分子,只注射一 种 dsRNA即可将多个基因同时剔除,也可以同时 注射多种 dsRNA而将多个序列不相关的基因同时 剔除,Elbashir等成功地将 Hela细胞 (美国黑人宫 颈癌细胞)中编码核有丝蛋白,核纤蛋白的基因同 时敲除[11]。McMarus等开展了对 T细胞 CD4和 CD8 同时敲除的实验,当然他们发现同时对 CD4和 CD8 敲除实际意义不大,因为用来敲除 CD4的 siRNA会 与用来敲除 CD8的 siRNA产生竞争性抑制。尽管如 此,RNAi技术还是为肿癌的基因治疗提供了一条 新的思路[12]。 3.3 RNAi在抗病毒中的应用 目前已经证实,植物中的转录后基因沉默能够 抵抗病毒感染[13],这可能是植物的一个本能反应, 是植物在长期进化过程中,为了保护自身基因组完 整性,抵制外来核酸入侵的一种防卫保护机制。这 种机制可能在其他生物中也存在[14]。斯坦福医学院 的研究群,把 dsRNA放进小老鼠的肝细胞,dsRNA 被小老鼠体内的核酸酶分解成许多 siRNA[15]。研究 发现 siRNA具有高度专一性,会与小老鼠体内的丙 型肝炎病毒的 mRNA结合,使 mRNA分解并失去 翻译蛋白质的功能,斯坦福医学院运用此技术来治 疗丙型肝炎的研究,已从体外试管实验阶段推进到 体内的动物实验,且在小老鼠身上,看到丙型肝炎 病毒被阻断的明显效果[16~19]。我国是乙型肝炎的大 国,有学者认为 RNAi技术用于乙型肝炎的治疗, 有望成为乙型肝炎治疗的革命性的新方法,将具有 巨大的社会价值[20]。 4 展望 对 RNAi的研究已经有了一个良好的开端,但 还有大量的问题有待科学家们去解答,如在细胞浆 内发生的,转录后的 RNAi是否与核内的转录沉默 有某种联系;RNA逆向信息传递反作用于 DNA,生 命的信息是否起源于 RNA;如何更有效地将 siRNA 导入哺乳动物细胞,进行基因功能研究以及疾病基 因治疗呢[21,22]。尽管如此,我们有理由相信,RNAi 现象的研究将是未来 10年生物学领域中最激动人 心,也最有可能产生丰富成果的领域之一。有人预 产,RNAi技术的应用对生命科学的深远影响将不 会亚于 PCR技术。的确,RNAi技术体系的建立,为 84 生物技术通报Biotechnology Bulletin 2007年第4期 人类基因功能研究和疾病基因治疗开辟了一个革 命性的新领域[23]。 参考 文献 1 Napowc,LemiewxC,JorgensenKA.Plontcan,1990,2:279. 2 Guos,kempheusKJ.Ceu,1995,81:611. 3 FineA,XuS,Mellocc,etal.Nature,1998,391:806. 4 Cogmic,MacinoG.GenesDev,2005,10:638~643. 5 WassenegserM,Heimess,Kiedel.ceu,1994,76:567~576. 6 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