高速逆流色谱与硅胶柱色谱结合分离制备高纯度芦荟素异构体

高速逆流色谱与硅胶柱色谱结合分离制备高纯度芦荟素异构体书书书 !""# 年 $ 月 %&’(&)* !""# 色谱 !"#$%&% ’()*$+, (- !"*(.+/(0*+1"2 !"#$ !+ %"$ $ +! , +- 收稿日期：!""-."$.$/ 第一作者：黄丹凤，女，硕士研究生 $ 通讯联系人：曹学丽，女，博士，副研究员，&’#：（"$"）#0102$$#，()*+,#：-+".#3 /0$ 1/12$ ’32$ -4$ 基金项目：北京市教委科技发展计划项目（项目号：56!""+$""$$""$），北京市“优秀人才培养专项”经费资助 $ 高...

书书书 !""# 年 $ 月 %&’(&)* !""# 色谱 !"#$%&% ’()*$+, (- !"*(.+/(0*+1"2 !"#$ !+ %"$ $ +! , +- 收稿日期：!""-."$.$/ 第一作者：黄丹凤，女，硕士研究生 $ 通讯联系人：曹学丽，女，博士，副研究员，&’#：（"$"）#0102$$#，()*+,#：-+".#3 /0$ 1/12$ ’32$ -4$ 基金项目：北京市教委科技发展计划项目（项目号：56!""+$""$$""$），北京市“优秀人才培养专项”经费资助 $ 高速逆流色谱与硅胶柱色谱结合分离制备高纯度芦荟素异构体黄丹凤，4 曹学丽，4 赵 4 华，4 董银卯（北京工商大学化学与环境工程学院北京市植物资源研究开发重点实验室，北京 $"""2/）摘要：芦荟素是芦荟叶中主要的蒽醌类成分，通常以芦荟素 7 和 8 两种非对映异构体形式并存，目前已成为许多芦荟产品质量控制指标之一。采用高速逆流色谱和硅胶柱色谱结合的方法，从老芦荟干粉中分离制备了高纯度的芦荟素 7（纯度为 109）和芦荟素 8（纯度为 1#9）样品，并采用快原子轰击质谱（ :78)6;）和核磁共振氢谱（ $< %6=）以及 >?(;@（AB+3,’4/)’40+4-’3 42-#’+B ?C’B0+2D’B ’EE’-/ DF’-/B"D-"FG）等方法对所得的两个芦荟素异构体的立体构象进行了确认。该法具有制备量大和分离效率高的特点。关键词：高速逆流色谱；硅胶柱色谱；分离制备；高效液相色谱；芦荟素异构体中图分类号：?#-04 4 文献标识码：74 4 文章编号：$""" )0/$2（!""#）"$ )""+! )"+4 4 栏目类别：研究论文 !"#$%"%&’(# )#$%"%&’*+ *, -.*’+ /’%0&#"#*’0*1#"0 23 4’567 )$##8 9*:+&#";:""#+& 96"*1%&*5"%$63 9*12’+#8 <’&6 )’.’;% =#. 9*.:1+ 96"*1%&*5"%$63 I+4E’4A，J7? K2’#,，L<7? <2+，I?%> @,4*+" （!"#$#%& ’"( )*+,-*.,-( ,/ 01*%. 2"3,4-5"3 2"3"*-56 *%7 8"9"1,:;"%.，<56,,1 ,/ =6";#5*1 *%7 >%9#-,%;"%.*1 >%&#%""-#%&，!"#$#%& ?"56%,1,&( *%7 !43#%"33 @%#9"-3#.(，!"#$#%& !"""#$，=6#%*） -20&"%;&：7#",4，4+/2B+##G + *,./2B’ "E /M" 3,+D/’B’",D"*’BD，+#",4 7 +43 +#",4 8，,D /0’ *+N"B +4/0B+O2,4"4’ ,4 +#"’，+43 4"M D’BC’3 +D "4’ "E /0’ ,*F"B/+4/ -"4/B"# -"4D/,/2’4/D ,4 *"D/ "E /0’ -"**’B-,+# +#"’ FB"32-/D$ <,A0)DF’’3 -"24/’B-2BB’4/ -0B"*+/"AB+F0G（<;JJJ）-"*1,4’3 M,/0 D,#,-+ A’# -"#2*4 -0B"*+/"AB+F0G M+D 3’C’#"F’3 E"B /0’ FB’F+B+/,C’ D’F+B+/,"4 "E /0’ /M" ,43,C,32+# +#",4D$ 7#",4 7（109）+43 +#",4 8（1#9）M’B’ "1/+,4’3$ :+D/ +/"* 1"*1+B3*’4/ *+DD DF’-/B"*’) /BG（:78)6;），$< 42-#’+B *+A4’/,- B’D"4+4-’（ $< %6=）+43 >?(;@（AB+3,’4/)’40+4-’3 42-#’+B ?C’B0+2D’B ’EE’-/ DF’-/B"D-"FG）M’B’ ’*F#"G’3 E"B /0’ ’#2-,3+/,"4 "E /0’,B D/B2-/2B’ -"4E"B*+/,"4$ &0’ 3’C’#"F’3 *’/0"3 ,D "E 0,A0 FB’F+B+/,C’ -+F+-,/G +43 0,A0 ’EE,-,’4-G ,4 B’D"#2/,"4$ >#3 <*"80：0,A0)DF’’3 -"24/’B-2BB’4/ -0B"*+/"AB+F0G（<;JJJ）；D,#,-+ A’# -"#2*4 -0B"*+) /"AB+F0G； FB’F+B+/,C’ D’F+B+/,"4； 0,A0 F’BE"B*+4-’ #,O2,3 -0B"*+/"AB+F0G （分析，采用快原子轰击质谱（978%:6）和核磁共振氢谱（ "! ;:<）以及 =>?6@（ (24,’+01%+0&40-+, 0/-A+42 >B+2&4/)+2 +CC+-1 )*+-12.)-.*5）等方法对芦荟素异构体的结构进行了鉴定。图 !" 芦荟素异构体的结构 !"#$ !" %&’()&(’*+ ,- ./,"0 1".+&*’*,"+,2*’+ !" 实验部分 ! $ !" 仪器和试剂 ! ! =6"+7( 型高速逆流色谱仪系统，配有聚四氟乙烯管（"D9?）分离柱（内径 ", - 33，总容量 ’’+ 3#）、6"++%7 型恒流泵、**’(7%EF 检测器、(+)% 型记录仪（北京市新技术应用研究所研制）；""++#$ 型高效液相色谱系统，配有 G><87H 68%$"*色谱柱、四元泵、二极管阵列检测器（I7I）、自动进样器（7(’A+01 公司）；<87H 68%$"*柱（) !3，’)+ 33 . #, - 33 ’K ,K）；流动相：试验中分别采用了只在水中添加 ’, ’M 冰醋酸和在甲醇和水中均添加 ’M 冰醋酸的甲醇%水（体积比为 )) / #)）作流动相，流速： +, % 3# L 3’0；检测：采用二极管阵列检测器，以芦荟素的特征吸收波长 ’&( 和 ()& 03 为检测波长进行双波长检测。 ! $ ’" 质谱和核磁共振分析 ! ! 该工作在解放军军事医学科学院仪器分析中心完成，所用质谱仪为 :’-2.34)) G4N6*+- 质谱仪；核磁共振仪为 F42’40 O;>F7 -++ 超导核磁共振谱仪，氘代试剂为 $I(>I。 ·(#· http://wanmei-luhuijiao.com/ 色谱第 !" 卷 !" 结果与讨论 ! ! #" 硅胶柱色谱所得 $ 个级分的 "#$% 分析 # # 经 !"#$ 分析（见图 !）发现，%$ 中主要含有与对照品相对应的芦荟素成分（暂称为 &），%! 同时主要含有 & 和另外一种可能的芦荟素异构体（暂称为 ’），%% 中则主要含有 ’，同时在每一级分中还含有大量的其他杂质成分。图 !" 硅胶柱色谱分离得到的 $ 个级分 &#，&! 和 &$ 的 "#$% 谱图 &’(! !" "#$% )*)+,-’- ./ &#，&! )*0 &$ /1)23’.*- 041’540 /1.6 ) -’+’2) (4+ 2.+76* ()*+,- ./01-：2-3/04),5603-7 6+3/ !& !8 09-3+9 09+: 0::-:（’’( "’，; < ;）= & 01 102.,- &；’ 01 102.,- ’= ! ! !" &#，&! 和 &$ 的 "8%%% 分离纯化 # # 从前面的预分离可看出，芦荟素属弱极性成分，对它的逆流色谱分离可用弱极性的正相溶剂体系氯仿5甲醇5水（体积比为 " ( % ( !）。该溶剂体系是逆流色谱分离中的一种典型的溶剂体系，常用于弱极性到中等极性物质的分离。在涉及芦荟素逆流色谱分离的文献报道中也多采用氯仿5甲醇5水体系，只是组成比例不尽相同。本文从该溶剂体系入手，以上相为固定相，下相为流动相，对 %$ 和 %! 进行了分离，所得 !>$$$ 谱图见图 %。!"#$ 分析表明，%$ 经 !>$$$ 分离后得到了部分纯化，但仍有一些极性较强的杂质不能得到分离。%! 中的 & 和 ’ 这两个可能的芦荟素成分在该体系条件下基本上能够实现分离，只是分离时间较长。我们也曾试图用反相的溶剂体系如正己烷5乙酸乙酯5甲醇5水体系对两者进行分离，但并不成功。由 %! 分离得到的!和" 两个级分的 !"#$ 如图 % 所示。由 %$ 分离得到的级分!与由 %! 得到的级分!的 !"#$ 图相似。从图 % 中可以看出，在!和"两个级分中，除了分别含有目标成分 & 和 ’ 之外，还含有其他的极性较强的杂质成分。因此我们将 %$ 分离得到的级分!与由 %! 得到的级分!合并（统称为级分!），将 %! 分离得到的级分"与由 %% 得到的级分"合并（统称为级分"），并分别进行进一步的 !>$$$ 纯化。图 $" &# 和 &! 的 "8%%% 谱图和由此得到的!和"两个级分的 "#$% 谱图 &’(! $" "8%%% -49)1)3’.*- ./ &# )*0 &! )*0 "#$% 2:1.6)3.(1)6- ./ /1)23’.*- ! )*0 " !>$$$ 1),;-43 1?13-2：9/,)7)@)7252-3/04),5603-7（"( %( !，; < ; < ;）；1303+)407? ./01-，A..-7 ./01-；2)*+,- ./01-，,)6-7 ./01-= >02.,-1：%$（!$) 2B）；%!（$’) 2B）= ()*+,- ./01- @)7 !"#$：2-3/04),5603-7（’’( "’，; < ;）6+3/ !8 09-3+9 09+: 0::-:= # # & 01 102.,- &；’ 01 102.,- ’= ! ! $" 级分!和"的 "8%%% 纯化 # # 经试验发现，级分!和"中含有的杂质无法再用上述的正相体系氯仿5甲醇5水除去，因此试验采用反相溶剂体系。开始以正己烷5乙酸乙酯5甲醇5水为基础进行试验，但试验结果表明，乙酸乙酯5甲醇5 水（体积比为 ’( $( ’）可以将级分!中的极性杂质完全分离除去，其 !>$$$ 谱图见图 " 50；而级分"中的杂质采用上述体系不能完全分离除去。经试验， ·""· http://wanmei-luhuijiao.com/ ! 第 " 期黄丹凤，等：高速逆流色谱与硅胶柱色谱结合分离制备高纯度芦荟素异构体采用极性更强的正丁醇!乙酸乙酯!水（体积比为 "# $ # %）可以获得理想的分离效果，其 "#$$$ 谱图见图 % !%。图 !" 级分!和级分"的 !"### 分离 $%&’!" !"### ()*+,+-%./( .0 0,+1-%./!+/2 0,+1-%./" &’(’)(*+, -./’0’,1(2：&’% ,34 ! ! .4 56.)(*+, 7：8+0/’,( 898(’3，’(290 .)’(.(’!3’(2.,+0!-.(’6 （’# " # ’，/ : / : /）；8.3;0’ 8*<’，"&( 314 %4 56.)(*+,!：8+0/’,( 898(’3，%=(.,+0!’(290 .)’(.(’!-.(’6（" # $ # %，/ : / : /）；8.3;0’ 8*<’，"’( 314 ! ! > .8 8.3;0’ >；? .8 8.3;0’ ?4 # ’ !" 样品的纯度分析及结构鉴定 # ’ ! ’ $" 样品的纯度分析 ! ! "@A$ 分析表明，所得的 > 和 ? 样品的纯度均较高，在 &)$ 和 $’) ,3 下 "@A$ 分析的纯度（以峰面积百分比计）> 样可达 )*B，? 样为 )+B（图略）。 # ’ ! ’ #" 样品的结构鉴定 ! ! C>?!D# 分析显示，> 和 ? 样品均有［D , "］, - %") 的分子离子峰，说明 > 和 ? 样品的相对分子质量均为 %"*，它们互为同分异构体，且其相对分子质量与芦荟素的分子式 $&""&&E) 相吻合。 ! ! > 和 ? 样品的 "" FDG 数据如表 "。总的说来，两者的数据没有显著的区别，且与文献［*］报道的数据基本吻合，化学位移值的少许差异是由于氘代试剂的不同（本文采用 $&$E&，文献［*］采用二甲基亚砜（&D#E）以及 &D#E!$&$0$（体积比为 "# $））所致。从这些数据基本上可以判断 > 和 ? 样品都为芦荟素，但很难区别哪个是芦荟素 >，哪个是芦荟素 ?。因此，通过 HEI#J 方法对 "( 位碳的葡萄糖基的空间位置进行了确定。当照射化学位移值（ !）为 $. % 的 "K!" 时，> 样品的 ’ !" 信号增强；而 ? 样品的 % !" 信号增强。根据文献［*］，推断 > 样品为芦荟素 >，而 ? 样品为芦荟素 ?。这个判断结果与 > 和 ? 样品在 "@A$ 及 "#$$$ 中所表现的色谱行为相符。相对芦荟素 ? 而言，芦荟素 > 的极性较弱，因此在反相 "@A$ 中，芦荟素 > 出峰时间应在芦荟素 ? 之后，这与图 &，$ 中的实际情况一致。在正相的 "#$$$ 分离中，富含芦荟素 > 的级分"在富含芦荟素 ? 的级分!之前出峰（见图 $ 的 C&），也说明芦荟素 > 的极性弱于芦荟素 ?。这些色谱结果从另一方面证明了结构推断的正确性。表 $" 芦荟素异构体 3 和 4 的$! 567 数据 8+9:) $" $! 567 2+-+ .0 +:.%/ 2%+(-),).%(.;),( .0 3 +/2 4 .9-+%/)2 0,.; -<) ()*+,+-%./（#=%>=，&’’ 6!?） @6+(+, !（>0+*, >） !（>0+*, ?） & !" + 4 */（ 8） + 4 *’（ 8） % !" / 4 (%（ 8） / 4 (’（ 8） ’ !" / 4 (’（L，/ 4 &） / 4 (/（L，/ 4 *） + !" / 4 %*（LL，/ 4 *） / 4 %+（LL，/ 4 *） / !" + 4 *’（L，/ 4 *） + 4 *%（L，* 4 %） "( !" % 4 ’)（L，& 4 (） % 4 ’)（L，& 4 (） "" !"& % 4 +%（L，/ 4 &） % 4 +$（L，% 4 &） " K!" $ 4 %(（LL，) 4 +，&） $ 4 %(（LL，) 4 +，&） & K!" $ 4 ((（LL，) 4 +） $ 4 ("（LL，) 4 +） $ K!" $ 4 &%（LL，* 4 %） $ 4 &’（LL，* 4 %） % K!" & 4 */ 0 & 4 )%（3） & 4 */ 0 & 4 )(（3） ’ K!" & 4 */ 0 & 4 )%（3） & 4 */ 0 & 4 )(（3） + K!". $ 4 $/（LL，""，’） $ 4 $/（LL，""，’） + K!"% $ 4 ’’（LL，""，&） $ 4 ’%（LL，"&，&）致谢 ! 感谢解放军军事医学科学院仪器分析中心质谱和核磁共振室的支持。参考文献：［"］! M.3’6 M H，N.(2 @，C.0/’9 & I4 C6’’ G.L*).0 ?*+0+19 O D’L*)*,’，&(($，$%（&）：&$$ ［&］! H=((’63., J， $2.=8’6!N+058+, I4 ?*+)2’3 #98( I)+0， &(((，&*：*&’ ［$］! N*0P*+’, > D，N., M9Q ?!I，F’-(+, A I4 ?*+)2’3 #98( I)+0，&(("，&)：’$ ［%］! @.6Q D R，@.6Q S "，R*3 F J，#2*, J H，$2+* J #，A’’ S H， R*3 R "，A’’ # R4 @29(+)2’3*).0 >,.098*8，"))*，)："*+ ［’］! T+,(. C，?+1+,* @，D.8+((* @，D*).0* H4 S $26+3.(+16 >， "))’，/"*：)) ［+］! G’%’)). M，R.98’6 E，".1’08 "，T’88*, R!"，D.L=,L+ D， H.3%. F4 @29(+)2’3*).0 >,.098*8，&(($，"%：*$ ［/］! H6++3 U S，G’9,+0L8 V4 @0.,(. D’L，")*/，’$：$%’ ［*］! D.,*(+ @，D+,(* &，#;’6.,<. H4 S $2’3 #+)，@’6Q*, V6.,8 "，"))(，（’）：" &)/ ［)］! J.3.3+(+ D，782*Q.-. D，D.8=* V，F.Q.<.-. "，R.%.8.! -. J4 S >88+) E55 >,.0 $2’3，")*’，+*（$）：%)$ ［"(］! R=<=9. "，V.3.* 7，?’;;= "，#2*3;+ R，$2*2.6. V4 S $26+3.(+16 ?，&(("，/’&：)" ［""］! $2’, S*,L+,1，A* M’*，A* #=9=,4 $2*,’8’ S+=6,.0 +5 $26+3.! (+16.;29（陈金东，李蔚，李素云4 色谱），&((&，&(（%）：$+* ［"&］! A* S*,13’*，M= J*,14 #)*’,)’ .,L V’)2,+0+19 +5 C++L 7,! L=8(69（李静梅，吴颖4 食品工业科技），&(($，&%（""）：/+ ［"$］! H*6’00* > D，D’88*,. >，C’66.,(’00* @，#*,*%.0L* D，V.6+0. > D4 $26+3.(+16.;2*.，&(("，’$（#=;;0）：#&*% ［"%］! I08+209 D >，H=0 M，D=6;29 V @4 7,(’6,.(*+,.0 733=,+;! 2.63.)+0+19，&((%，%：" /$) ［"’］! J=., A D，$2’, W W，>* @，T* D，M= @，A* T J4 S A*X $26+3 G’0.( V’)2，&(("，&%（")）：& )+" ［"+］! M.,1 $2=,9.,，$.* &*,11=+，A*= T2’,10*.,1，"= #2=*1’,， ?*., S=,4 $2*,’8’ S+=6,.0 +5 @2.63.)’=(*).08（王春燕，蔡定国，柳正良，胡水根，卞俊 4 中国医药工业杂志），&(("， $&（%）："%’ ［"/］! J=., A*3*,1，$2’, W=’Y*.,，A*= H=+Y*.,1，V*., H=+).*4 $2*,’8’ S+=6,.0 +5 >,.09(*).0 $2’3*8(69（袁黎明，谌学先，刘国祥，田国才 4 分析化学），&(($，$"（&）：&’" ［"*］! $2’, $=,82’，A*= J=5’,1，T2+= T2*0.,4 $2*,’8’ S+=6,.0 +5 $26+3.(+16.;29（陈存社，刘玉峰，周志兰 4 色谱），&(($， &"（%）：%$’ ·’%· http://wanmei-luhuijiao.com/

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