植物细胞工程快繁周记

植物细胞工程 植物快繁周记 专业：制药工程 姓名：陈琪 学号：19100101 试验时间:3.14—6.6. 上课时间：每周四晚 指导老师：陆长梅 实验一、培养基贮备液（母液）的配制 2013年3月14日 一、实验目的： 1.熟悉MS培养基的组成，掌握贮备液的配制方法。 2.清洗和准备下次实验所需器械，如培养皿、培养瓶等。 二、实验药品及仪器 药品： ， ， ， ， 仪器：天平、量筒、烧杯、容量瓶、培养皿、培养瓶、洗衣粉 三、实验过程 各组分别配制MS培养基贮备液 贮备液I(g) 贮备液III(mg) MgSO4·7H2O 3.70 500mL FeSO4·7H2O 278 100mL NH4NO3 16.50 Na2-EDTA·2H2O 373 CaCl2·2H2O 4.40 生长调节剂 KNO3 19.00 6-BA 50mg 50mL KH2PO4 1.70 NAA 50mg 50mL 贮备液II(mg) 贮备液IV(mg) KI 8.3 100mL 肌醇 1000 100mL H3BO3 62 烟酸 5 MnSO4·4H2O 223 盐酸硫胺素 1 ZnSO4·7H2O 86 盐酸吡哆醇 5 Na2MoO4·2H2O 2.5 甘氨酸 20 CuSO4·5H2O 0. 25 称量 溶解 混合 定容 CoCl2·6H2O 0. 25 1．我组配制贮备液Ⅰ(g)(20×)：分别称取 3.70g ， 16.50g ， 4.4g ， 19.00g ， 1.70g ，分别置于小烧杯中分别溶解，再一次混合，并定容至500mL。 2．其他组配制贮备液Ⅱ(mg)(100×)100mL，贮备液Ⅲ(mg)(100×)100mL，贮备液 Ⅳ(mg)(100×)100mL，生长调节剂：浓度为1mg/mL的 6-BA和NAA各50mL。 3．各种母液配制完成后分别用玻璃瓶贮存，贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期、组别等，保存在冰箱的冷藏室内。 4．另配制超净台上各种试剂： 1mol/L 的NaOH 1瓶 1mol/L HCL 1瓶 0.1%的升汞：每个超净工作台一瓶 70~75%酒精：每个超净工作台一瓶 95%酒精：每个超净工作台一瓶 酒精棉球：每个超净工作台一瓶 实验二、固体培养基的配制与灭菌 2013年3月21日 一、实验目的 1. 学习掌握植物组织固体培养基的配置和灭菌方法。 2. 为下次实验准备各种灭菌好的培养基和器械 2、 实验材料 试剂材料：培养基母液，蔗糖，琼脂，1mol/L HCL，1mol/L 的NaOH 实验仪器：分析天平，高压灭菌锅，pH计，电炉 三、实验过程 1．接种用具洗涤、灭菌、烘干。 2．清洗培养皿（6个），清洗完成后，每个培养皿中放一张滤纸，然后用牛皮纸将培养皿包裹好，准备灭菌。 3．无菌水（6瓶）：在清洗干净的培养瓶中装入2/3的自来水，盖紧瓶盖，准备灭菌。 4．配MS培养基（500mL）：分别量取贮备液Ⅰ25mL，贮备液Ⅱ5mL，贮备液Ⅲ 5mL，贮备液Ⅳ5mL，加入400mL水，加3%蔗糖，混合均匀后调节pH至5.8，称取0.8%琼脂剪碎加入到已调好pH的溶液中加热使琼脂完全溶解，最后定容至500mL，混合均匀，趁热分装至20个清洗干净的培养瓶中，约25mL/瓶。 5．将用牛皮纸包好的培养皿、无菌水以及分装完毕的培养基放在同一金属小筐中，放入高压灭菌锅中121℃，20min灭菌。灭菌完毕后，将培养皿放入烘箱中烘干，无菌水及培养基放在组培室中。 6.准备好超净台内的物品：剪刀、镊子、解剖刀、无菌水、无菌培养皿（部分培养皿内放滤纸）、酒精棉球、95%酒精瓶、废液缸、打火机、酒精灯。 7.甲醛熏蒸接种间。 四、注意事项 1.配制培养液时应注意： ①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制； ②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次； ③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。 2.溶化琼脂需要注意的是： 在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。 3.培养基的灭菌： 常规方法是放入高压灭菌锅内加热加压灭菌。一般少量的液体只要121℃ 即每平方厘米1.1kg的压力20分钟就能达到彻底灭菌。灭菌的功效主要是靠温度，而不是压力。 4.玻璃器皿及耐热用具等可采用干热灭菌，即利用烘箱加热到160-180℃ 的温度来杀灭微生物。 5.用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌。 五、实验结束后将所有灭菌过的器皿、培养基等放置在培养室一星期，观察是否长菌以确定是否灭菌彻底。 实验三、无菌苗的培养 2013年3月28日 一、实验目的要求 1.了解组织培养的基本程序。 2.掌握接种的方法和材料的培养过程。 3.掌握无菌操作技术。 二、实验用具： 烧杯、移液管、量筒、长镊子、超净工作台、剪刀、培养室（含空调、调节温度器） 三、实验材料： 番茄种子，荷兰马齿苋种子，MS培养基 四、实验过程 1．检查上周准备的培养基是否有长菌的现象，没有则可以使用。 2．检查超净工作台内东西是否齐全，包括酒精棉球，75%酒精溶液，95%酒精溶液，酒精灯，打火机，废液缸，剪刀，镊子，解剖刀。 3．将上周准备的灭菌并烘干的培养皿、培养瓶及无菌水放入超净工作台内，用75%酒精擦拭工作台面，关闭工作台移门，将紫外灯打开紫外灭菌半小时。 4．半小时后，将紫外灯关闭，但不打开日光灯，仅打开风机，防止菌体的光修复并去除臭氧，至少10min后才可上工作台进行操作。 5．选用荷兰马齿苋和番茄的种子，放入一个烧杯中，流水冲洗半小时，浮于表面的种子说明是干瘪的，弃用，滤去水，超净工作台准备完毕即可移至超净工作台继续后面的操作。 6．用75%酒精消毒双手，尤其是手指指甲处仔细擦拭，避免手上的细菌污染接种材料，上超净工作台，并将酒精灯点燃。 7．将冲洗后的种子用75%酒精浸泡45s，迅速加入无菌水终止消毒，倒掉之后，加入升汞没过种子即可，浸泡10min，然后用无菌水冲洗4-5次，然后将种子铺在装有滤纸的培养皿中，将多余水分吸干。 8．打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子将种子置于培养基上，每个培养基上放3~4粒种子，灼烧镊子放回，灼烧瓶口，盖上瓶塞。 9. 循环接种剩下的培养基，期间每次操作皆要消毒。 10. 培养瓶贴上标签，做好标记，最后放到光照培养箱中或培养室培养架上进行培养，条件为2000LX，26±1℃。 五、注意事项 1. 每瓶放置4-5个种子，保证发芽率，种子放置在培养基中间，分开放置，不要放置在壁上，不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。 2.接种用的酒精灯，火焰不要调得太高，接种时应靠近酒精灯火焰操作，接种动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。 3. 接种时严防超净工作台内着火。 4. 为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。 5. 培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。 6. 工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。 7.废液处理：酒精要回收，放原处；升汞有剧毒，小心不要溅出，废液倒回原处。 六、实验结果 上周配制的培养基没有长菌的，凝固也很好，正常使用。 实验四、无菌苗的生长与外植体的培养基配制 2013年4月18日 一、实验任务 1.观察上次实验情况。 2.配制接种外植体用的培养基 2、 实验材料 试剂材料：培养基母液，蔗糖，琼脂，1mol/L HCL，1mol/L 的NaOH 实验仪器：分析天平，高压灭菌锅，pH计，电炉 三、实验过程 1．观察无菌苗的生长情况 2．配制月季诱导培养基：MS+6-BA 1+NAA 0.1 （500mL） 分别量取贮备液Ⅰ25mL，贮备液Ⅱ5mL，贮备液Ⅲ 5mL，贮备液Ⅳ5mL，6-BA O.5mL，NAA 0.05mL，加入400mL水，加3%蔗糖，混合均匀后调节pH至5.8，称取0.8%琼脂剪碎加入到已调好pH的溶液中加热使琼脂完全溶解，最后定容至500mL，混合均匀，趁热分装至20个清洗干净的培养瓶中，约25mL/瓶。 3．培养基灭菌 4．再一次灭菌培养皿、无菌水等，为下周接种子叶、下胚轴做准备 四、实验结果 无菌苗已生长3周，总体情况多是荷兰马齿苋种子的萌发率高，而番茄种子的萌发率低，我组亦然。 番茄的种子基本没有萌发（图一），可能原因：番茄与马齿苋是放在一起培养的，马齿苋生长需光，番茄需暗，为了马齿苋的生长将光打开，可能影响到了番茄的萌发。 荷兰马齿苋萌发率较高（图二），无菌苗的下胚轴长得很长，只有子叶，子叶蔫了，可能原因：温度太高，空调温度失控（设置20℃，实际跑到30℃）。 有部分培养瓶中长菌，有的是霉菌，有的是细菌（图三） 实验五、植物外植体的接种与培养 2013年4月25日 一、实验任务 1．继续观察无菌苗的生长情况。 2．外植体的清洗、消毒和接种。 二、实验过程 1．观察无菌苗生长情况 2．收拾超净工作台并紫外灭菌 3外植体的清洗、消毒、接种 （1）选材：月季的叶片、茎、花，薄荷的叶片，番茄的下胚轴 （2）修剪与清洗： ①去除较老的叶片，尽量减小体积，减少污染 ②用洗衣粉将外植体表面灰尘及绒毛等洗净，用自来水流水冲洗30分钟。 （3）消毒：分别将月季和薄荷进行以下消毒，75％乙醇浸泡30s，加入无菌水终止消毒，倒掉后，加0.1%升汞浸泡10分钟，最后大量无菌水冲洗4-5次。无菌苗只需直接放在无菌水里清洗即可。 （4）无菌修剪：用无菌镊子和剪刀进一步去除多余的叶片，依据需要切割成相应大小的茎段（带2-3个叶片）。 a.月季及薄荷叶片的制备方法是：用解剖刀切取，切成1 cm×1 cm的小方片； b.月季的茎：需切取两个节之间的节间部分，长约1 cm； c.番茄下胚轴——切去子叶胚根，切成1-2cm一段； 切取的外植体要放入带滤纸的无菌培养皿中。 （5）接种：无菌操作将处理好的材料接种于培养基上。 （6）培养：25 ℃，光照培养。 三、注意事项 1.要根据植物材料对灭菌剂的敏感性来选用不同的药剂，确定适宜的处理时间和水洗的次数。不同植物、部位、组织年龄及环境状况——灭菌时间不同 2.在无菌条件下，将消毒过的实验材料切成小块，制备外植体。 3. 外植体放入培养基时，注意方向。每瓶放置外植体的数量，应该根据培养瓶瓶的大小来确定，一般放置2-4块。注意外植体也不要放得太少，以充分利用培养基中的营养成分。 4.工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。 5.接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中。 四、实验结果 一周后观察外植体愈伤组织生长情况。 实验六、石楠生根培养基的配制与灭菌 2013年5月2日 一、实验任务 1．观察上周外植体愈伤组织的生长情况。 2．清除长菌的培养瓶。 3．配制石楠生根培养基。 二、实验过程 1．观察上周外植体愈伤组织的生长情况。 2．配制石楠生根培养基：1/2 MS+NAA 0.2+IBA 0.5 (1000mL) 分别量取贮备液Ⅰ25mL，贮备液Ⅱ5mL，贮备液Ⅲ 5mL，贮备液Ⅳ5mL，IBA 0.5mL，NAA 0.2mL，加入600mL水，加2%蔗糖，混合均匀后调节pH至5.8，称取0.9%琼脂剪碎加入到已调好pH的溶液中加热使琼脂完全溶解，最后定容至1000mL，混合均匀，趁热分装至20个清洗干净的培养瓶中，约50mL/瓶。 3．培养基灭菌 4. 再一次灭菌培养皿、无菌水等，为下周接种生根材料做准备。 三、实验结果 我组情况： 有4个培养瓶：月季的叶片消毒过度，死亡（图四） 有1个培养瓶：月季的茎消毒时间不够，染菌（图五） 有2个培养瓶：月季的茎，开始长芽（图六） 有2个培养瓶：月季的花，继续生长，其中一个培养基底部有黑色分泌物，疑似长菌，继续观察（图七） 有8个培养瓶：月季叶片生长无明显变化（图八），但薄荷的叶片形状有所变化，说明开始生长愈伤组织（图九） 有3个培养瓶：无菌苗——番茄，长势良好，下胚轴膨大，愈伤组织开始形成，且比外植体长势好（图十） 其他组发现： 1. 马齿苋和番茄无菌苗不易染菌，一周内就开始愈伤组织长出 2. 薄荷：叶片很容易灭菌过度，但叶芽容易长出，在节部和节间易长出白色的不定根。 3. 菊花：茎很容易灭菌过度又很容易染菌，几乎所有的茎段全部死亡。叶片相对较好。（可能是由于有大量绒毛的缘故）。 4. 驱蚊草：叶片比较容易除菌，不容易死，茎段太粗，且有两组长菌。 5. 双色茉莉染菌不严重。 实验七、外植体的生根培养 2013年5月9日 一、实验任务 1．观察所接植物的生长情况。 2．清除长菌的培养瓶。 3．接种生根用外植体。 4．配制诱导月季生芽培养基。 二、实验材料 石楠，小叶女贞，大叶女贞 三、实验过程 1．观察前几次实验现象 2．收拾超净工作台并紫外灭菌 3．清洗外植体：用洗衣粉将外植体表面灰尘及绒毛等洗净，用自来水流水冲洗至少30分钟。 4．接种石楠、小叶女贞、大叶女贞，选择嫩芽、花苞或嫩茎切取两个节之间的节间部分，长约1 cm接种） 5．整理实验台，将接种好的组培瓶放入培养室中培养。 6．配制诱导月季生芽培养基：MS+6-BA 1 +NAA0.1 分别量取贮备液Ⅰ25mL，贮备液Ⅱ5mL，贮备液Ⅲ 5mL，贮备液Ⅳ5mL，6-BA O.5mL，NAA 0.05mL，加入400mL水，加3%蔗糖，混合均匀后调节pH至5.8，称取0.8%琼脂剪碎加入到已调好pH的溶液中加热使琼脂完全溶解，最后定容至500mL，混合均匀，趁热分装至20个清洗干净的培养瓶中，约25mL/瓶。 四、实验结果 番茄的愈伤组织继续生长（图十一）； 月季叶片的愈伤组织已经开始形成，但是不多，很小（图十二）； 月季的花枯萎，估计会死亡（图十三）； 月季的茎上新长的芽继续生长（图十四）； 薄荷叶片的愈伤组织上周已经长出了了，但是这周观察感觉没有上周长得好，有些萎缩（图十五），继续培养，下周观察其生长情况。 实验八、观察无菌苗及外植体生长情况 2013年5月16日 上周生根培养结果： 我组：由于外植体消毒不彻底，有6个培养瓶内长了霉菌，1个培养瓶内长了细菌（图十六）； 1个培养瓶内，植物体（石楠）伤口上有雾状物质——内生菌（图十七）； 1个培养瓶内，大叶女贞枯萎（图十八）。 其他的培养瓶内暂时看不出有何变化，未长菌，未生根（图十九） 其他组：无菌苗无内生菌，生根很快，已经长出根，番茄的下胚轴整个“睡”在培养基上，其上直接长根（图二十），说明生长素对跟的影响很大。有的根已经长出（图二十一），有的根萌动但未长（图二十二），可能是培养基的差异。 愈伤组织的培养情况： 番茄的愈伤组织膨胀得更大（图二十三）； 马齿苋下胚轴愈伤组织长势最好（图二十四）； 月季叶片中间细胞死亡的长不出愈伤组织，周围细胞没死的则长出了遇上组织（图二十五）； 月季的花苞死亡，但叶片仍然生长（图二十六）； 月季的茎继续生长，长出了新的叶片（图二十七）； 薄荷的叶片培养一周后长出了愈伤组织，但第二周再观察时，感觉萎缩了，没有第一周时的大，培养到第三周，死亡（图二十八），猜想：月季的诱导培养基能够诱导薄荷愈伤组织的形成，但是无法使其长久的生长。 实验九、愈伤组织诱导生芽的培养、芽生芽的培养 2013年5月23日 一、实验任务 1.观察上次实验结果 2.收拾超净工作台 3.接种愈伤组织、无菌苗 4.清洗长菌培养瓶 二、实验步骤 1.选材：马齿苋、月季 2.清洗：将马齿苋和月季的用无菌水清洗干净，去除上面的琼脂。 3.接种：将马齿苋的愈伤组织切成小块状（约0.5cm），月季的芽修剪，然后分别进行接种，愈伤组织讲切面贴于培养基上，芽直接插入培养基中。 4．接种完毕，将培养瓶放入培养室培养。 三、实验结果 我组用于生根的石楠、小叶女贞、大叶女贞仍然没有什么变化（图二十九）。 其他组用马齿苋无菌苗生根，一个星期长根，两个星期苗已经长得很高且茎变粗壮（图三十），根与茎处长出愈伤组织（图三十一），说明此次细胞分裂旺盛。 番茄有很多气生根（图三十二）。 实验十、观察愈伤组织诱导生芽、芽生芽的生长情况 2013年5月30日 愈伤组织诱导生芽 月季的愈伤组织变多变大（图三十三）； 马齿苋愈伤组织表面有红点出现（图三十四），说明会长出芽，有的愈伤组织已经开始长芽（图三十五）； 番茄的愈伤组织褐化（图三十六），可能材料本身已老化。 芽生芽 月季芽有黄化现象（图三十七）； 马齿苋的芽上长出许多新芽（图三十八）。 生根培养（三周） 石楠长出新叶（图三十九）； 小叶女贞、大叶女贞都死了（图四十），说明石楠的生根培养基不适用于小叶女贞和大叶女贞的生根培养； 马齿苋生根后长得愈发健壮，可开始炼苗（图四十一）。 实验十一、继续观察芽的生长情况 2013年6月6日 观察到： 月季的愈伤组织继续增多，生长速度比之前快（图四十二）； 马齿苋愈伤组织长得更大（图四十三），甚至将培养基撑破（图四十四），可能原因：培养基中生长素浓度偏高，或马齿苋植物体内含大量生长素，下次培养时或降低生长素浓度或换激素； 马齿苋表面发红，但芽并无想象的多（图四十五）。 _1430496781.unknown _1430496913.unknown _1430496949.unknown _1430496858.unknown _1430496684.unknown