固态发酵技术在酶生产中的应用研究进展_徐桂转

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 固态发酵技术在酶生产中的应用研究进展 徐桂转1 ,马俊军2 ,张百良1 3 ( 1.河南农业大学 农业部可再生能源重点实验室 ,河南 郑州 450002 ; 2. 河南省产品质量监督检验院 ,河南 郑州 450004) 摘要 : 能源危机和环境问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 的日益突出促进了固态发酵技术的发展。相对于液体深层发酵 ,固态 发酵在酶的生产中具有独特的优势。文中综述了固态发酵近年来在酶生产中的应用研究进展、固 态发酵产酶存在的问题和发展前景。 关键词 : 固态发酵 ; 液态发酵 ; 酶 中图分类号 : Q946. 5 　　文献标识码 : B 　　文章编号 : 1004 - 3268 (2007) 12 - 0013 - 04 　　固态发酵 ( solid state fermentation , SSF) 是指 利用不溶性原料作为固体支持物和营养物质 ,体系 无自由流动液体 ,在其上进行的任何发酵过程[1 ] 。 SSF 历史悠久 ,应用广泛 ,是人类利用微生物生产产 品历史最悠久的技术之一。但由于现代发酵工业对 大规模、集约化生产的要求 ,在过去的很长一段时间 内 ,有关它的应用研究基本停滞不前。自 20 世纪 90 年代以来 ,随着能源危机和环境问题的日益严 重 ,人们开始重新审视 SSF 的优点 ,并不断在原料、 工艺和设备等方面进行大量深入的研究 ,使 SSF 在 酶制剂、食品、医药、饲料、燃料、农药、生物转化、生 物冶金和生物修复等诸多领域取得了长足的 进展[2 ] 。 酶作为具有催化活性的生物制品 ,具有十分广 泛的应用领域 ,对它的需求也不断地增加。目前 ,大 多数酶的生产通常采用液体深层发酵 ( ssubmerged fermentation ,SmF) 技术 ,这使得酶的生产成本偏 高 ,在一些领域中使用 ,经济性较差。所以 ,人们不 收稿日期 :2007 - 07 - 12 基金项目 :河南省教育厅自然科学研究 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 资助项目 (200510459056) 作者简介 :徐桂转 (1972 - ) ,女 ,山西侯马人 ,副教授 ,博士 ,主要从事可再生能源转换及利用技术的研究。 通讯作者 :张百良 (1941 - ) ,男 ,河南汤阴人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事可再生能源方面的研究。 [31 ] 　Kong L ,Att ree S M , Fowke L C. 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All rights reserved. http://www.cnki.net 断尝试新的生产方法来降低酶的生产成本。研究显 示 ,相比 SmF 技术 ,SSF 技术在酶的生产方面具有 许多独特的优势[3 ] 。主要 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现在 : ①培养基价格低 廉 ,可以利用可再生的天然生物质或工业下脚料为 主要原料 ; ②工艺简单 ,节约能耗 ; ③产物浓度高 ,无 废液 ,后处理简单 ; ④所需通气压力低 ; ⑤有利于微 生物在接近于自然状态下生长等。这些特点决定了 SSF 生产酶具有明显的优势。以下主要介绍近年来 研究最多的几类酶的最新进展。 1 　SSF在酶生产中的应用 1. 1 　α- 淀粉酶 α - 淀粉酶是用途最广泛 ,产量最大的一类酶 , 主要应用于淀粉加工业、纺织工业、纸浆制造、酿造 和饲料加工等领域。利用 SSF 技术可生产出高活 力的α- 淀粉酶。国内学者曾以 BF7658 变异菌对 麸皮进行固体发酵 ,在培养温度 37～39 ℃,接种量 0. 5 % ,发酵 48～60 h 条件下 ,产酶达 1 248 U/ g ,浅 盘培养平均产酶达 1 754 U/ g ,大大高于该菌液体发 酵的酶活 350 U/ mL ,显示出良好的经济性[4 ] 。国 外学者的研究结果也表明 , SSF 技术生产α - 淀粉 酶具有良好的经济和环境效益。Ramachandran 等[5 ]报道了利用椰子油饼作为基质 ,以 A . ory z ae 为菌种进行固态发酵 ,经过 24 h ,淀粉酶活性达 1 372 U/ g。补加 0. 5 %的淀粉和 1 %的蛋白胨能显 著提高酶的活性 ,达到 3 388 U/ g。固态发酵可以产 生高活力淀粉酶的原因是固态发酵中培养基麸皮的 碳源浓度比液态深层发酵中的碳源浓度高得多 ,并 且固态发酵中营养基质从固体颗粒到细胞的传递阻 力较大 ,不如在液体深层发酵中液体基质细胞内部 那样相对容易 ,从而消除了液体深层发酵中酶合成 的分解代谢阻遏 ,造成了淀粉酶的大量合成[6 ] 。 1. 2 　蛋白酶 蛋白酶有酸性、中性、碱性之分 ,其中以 SSF 生 产酸性蛋白酶的研究报道最多。酸性蛋白酶是水解 酶类的一种 ,能够在微酸条件下 ,通过内切和外切作 用将动植物蛋白质水解为短肽和氨基酸 ,广泛用于 食品、医药、饲料、制革工业、毛皮软化和脱毛处 理[7 ] 。我国在 20 世纪 80 年代初做过一些研究 ,此 后有关这方面的研究报道极少。近年来 ,随着酸性 蛋白酶作为一种新型的生物饲料添加剂 ,在饲料工 业中表现出潜在的功能 ,酸性蛋白酶正在引起人们 更多的研究兴趣。王晓林等[ 8 ]报道了以啤酒糟为主 要原料 ,SSF 生产酸性蛋白酶的方法。在最适的发 酵基质质量配比为啤酒糟 ∶豆粕 ∶玉米淀粉 ∶ KH2 PO4 = 100 ∶9 ∶2 ∶0. 2 ,原料含水量为 58 % ,发 酵温度 31 ℃,初始 p H 为 5. 5 的条件下 ,经发酵周期 84 h ,酸性蛋白酶活力达 7 800 U/ g。刘建峰等[9 ] 以 土曲酶为菌种 ,利用响应面分析法 ,考察了影响 SSF 产酸性蛋白酶培养基的 4 个主要因素 ,得到了以麸 皮和豆粕为主要原料的培养基 ,酸性蛋白酶的活力 可达 9 327 U/ g。 1. 3 　脂肪酶 脂肪酶是类脂化合物分解、合成和酯交换的催 化剂 ,广泛应用于食物、清洁剂、化妆品和制药行业 等。以往对于利用细菌、真菌和酵母菌生产脂肪酶 的研究主要集中于 SmF 上。近年来 ,利用不同固态 基质发酵生产脂肪酶 ,正在引起研究人员的关注。 不同的学者通过对 SmF 和 SSF 生产脂肪酶进行比 较后发现 , SSF 产脂肪酶的产率更高且酶活更稳 定[10 ] 。SSF 生产脂肪酶有诸多影响因素 ,如 :p H、 温度、通气和培养基组成。此外 ,甘油脂肪酸的存在 能使某些微生物分泌的脂肪酶增加[11 ] 。孙舒扬 等[12 ]在以 Rhizop us Chinese 全细胞发酵产脂肪酶 的研究表明 ,加入橄榄油不仅有利于菌体生长、提高 脂肪酶水解活力 ,更可使脂肪酶的合成活力显著增 加。整个发酵过程中橄榄油既作为碳源又是脂肪酶 的诱导物。 1. 4 　果胶酶 果胶酶是指分解果胶质的多种酶的总称 ,包括 聚半乳糖醛酸酶 ( P G) 、果胶裂解酶 ( PL) 、果胶酯酶 ( PE)等主要组分。果胶酶广泛应用于食品工业中 , 能澄清果汁和酒 ,改善油浸出 ,除去柑橘皮 ,增加一 些水果的硬度 ,使纤维脱胶。近年来 ,果胶酶及其水 解物也正逐渐应用于植物诱导抗病的研究中。研究 发现 ,利用 SSF 技术生产的果胶酶比 SmF 生产的 果胶酶性能更好。SSF 生产的果胶酶性质更稳定 , 具有较高的 p H 值和温度耐受性 ,且降解物阻遏影 响更小[ 13 ] 。目前 ,生产商业化果胶酶主要是用真菌 微生物 ,如 A s pergi l l us ni ger 菌株。利用 SSF 生产 果胶酶能使用不同的固态农业残渣作为底物 ,如麦 麸、豆糠、草莓渣、咖啡浆和咖啡壳、果壳、可可、柠檬 和橙皮、桔渣、甘蔗渣、麸皮和苹果渣等。此外 ,张保 国等[14 ]利用嗜碱性细菌克劳氏芽孢杆菌 S - 4 为菌 种 ,进行了产果胶酶的研究 ,通过对比发现 ,SSF 产 果胶酶具有明显的优势 ,并可以用甜菜粕为碳源和 酶的诱导物 ,酵母膏和麸皮作氮源。 ·41· 2007 年第 12 期 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 1. 5 　木聚糖酶 木聚糖酶 (xylanase) 是最主要的一种木聚糖降 解酶类 ,它主要通过内切方式降解木聚糖中的β - 1 ,4 - 木糖苷键。水解产物以低聚木糖为主 ,并伴有 少量的木糖和阿拉伯糖。木聚糖酶作为一类饲料添 加酶 ,可有效降解木聚糖抗营养因子 ,提高饲料营 养。它已经成为酶制剂生产行业中的一个重要产 品 ,具有广阔的应用前景。作为一种诱导酶 ,木聚糖 对木聚糖酶有很大的诱导作用。自然界中的许多半 纤维素中都含有木聚糖 ,如麸皮、玉米芯、稻草等。 所以 ,采用这些价格低廉的原料进行固态发酵具有 很好的应用价值。 黑曲霉是生产木聚糖酶使用最多的菌种。高洁 等[15 ]通过三角瓶和托盘固态发酵对黑曲霉 ASP - 12 产木聚糖酶的各种环境因素进行了研究。结果 表明 ,培养基最优配方为 : 玉米芯 5 %、K2 H PO4 0. 2 %、豆粕 2 %、麸皮 95 % ,培养基的初始 p H 值为 4. 5～5. 0 ,发酵温度为 28～32 ℃,接种量为 1 % ,发 酵 32 h ,酶活接近 2 000 U/ g。邬敏辰等[ 16 ] 探索了宇 佐美曲霉生产木聚糖酶的固体发酵条件 ,结果表明 , 三角瓶优化培养基及发酵条件为 :250 mL 三角瓶装 8. 0 g 基料 (麸皮 ∶玉米芯 = 3. 5 ∶4. 5) , N H4 NO3 10 g/ kg , Tween - 80 3 g/ kg , KH2 PO4 3. 0 g/ kg , CaC12 1. 0 g/ kg , MgSO4 ·7 H2 O 1. 0 g/ kg (均相对 于基料) ,基料与自来水的质量比为 1 ∶1. 3～1 ∶ 1. 4 ,p H 自然 ;于 29 ℃培养 72 h ,期间翻动 2 次 ,此 工艺条件下最高酶活力为 8 752 U/ g。此外 ,有学者 研究了里氏木霉和嗜热拟青霉产木聚糖酶固态发酵 条件 ,研究显示 ,固态发酵具有良好的适用性[17 ,18 ] 。 Battan 等[19 ] 报道了利用细菌 ( B aci l l us p umil us ASH)固态发酵木聚糖酶的研究 ,结果显示 ,麦麸是 最好的固体基质 ,在料水比为 1 ∶2. 5 ( W / V ) ,接种 量 15 % ,37 ℃条件下 ,酶活为 7 087 U/ g ,显示了良 好的工业前景。 1. 6 　纤维素酶 纤维素酶是使纤维素降解生成葡萄糖的酶的总 称 ,主要有 C1 酶、CX 酶和葡萄糖苷酶。这 3 种酶 协同作用可将天然纤维素降解为葡萄糖。自 1906 年在蜗牛的消化液中发现了分解纤维素的纤维素酶 后 ,纤维素酶就受到世界各国的重视。19 世纪 80 年代 ,首先被添加于动物饲料中 ,后来逐步应用于纺 织、造纸、日用化工、工业洗涤、酿造等领域 ,据预测 , 纤维素酶的开发利用将是未来可再生性资源利用开 发的关键之一。 自然界中广泛地存在着能降解纤维素的微生 物 ,它们种类繁多 ,包括细菌、真菌和放线菌等 ,其中 真菌中的木霉属是研究最多的产酶菌种。目前 ,纤 维素酶的生产有固体发酵和液体深层发酵两种方 法 ,其中固体发酵比液体深层发酵具有较多的优势。 固态发酵时 ,影响纤维素酶产量和酶活的因素很多 , 除菌种本身的个体差异外 ,培养基及其培养条件是 影响发酵产酶的主要因素。戴四发等[20 ] 在研究绿 色木霉产纤维素酶特性时发现 ,培养基中碳源及其 一些物质对纤维素酶复合系中各组分的分泌呈现不 同的规律 :分别以纤维素粉或麦麸为唯一碳源时 , CX 酶最早呈现最高酶活 ,而按比例混合作为碳源 时则各酶组分较一致的呈现最高酶活形式。 张建新等[21 ] 研究了以麸皮和玉米芯为主要原 料 ,采用康氏木霉 ( T richoderm a koni n gi i ) 固态发 酵生产纤维素酶 ,并对影响纤维素酶活性的碳源和 氮源配比、外加氮源、培养基初始 p H 值、培养时间 和表面活性剂等因素进行了研究。结果表明 ,培养 基碳源和氮源配比以麸皮 ∶玉米芯为 3 ∶2 时最适 合 ;外加氮源以 0. 8 %硝酸铵产纤维素酶活性最高 ; 培养基初始 p H 值为 3. 0 时 ,纤维素酶活力最高 ,是 对照的 1. 37 倍 ;表面活性剂以0. 5 %“奇强”洗洁精 对提高纤维素酶活性的作用最显著 ,较对照提高 12. 4 % ;培养时间为 72 h 时 ,纤维素酶活性最高。 目前 ,纤维素酶还不能实现大规模地生产和使 用 ,这不仅需要寻找新的产纤维素酶菌株或进一步 选育高产菌株 ,同时 ,应大力开发新的生产技术。利 用农作物废弃物固态发酵产纤维素酶具有所产酶系 全面、能耗小、成本低等优点[ 22 ] ,SSF 技术在纤维素 酶的生产中具有重要的工业应用前景。 2 　SSF生产酶存在的主要问题及发展前景 随着环境和能源问题的日益突出 ,利用 SSF 产 酶引起了国内外研究者的广泛关注 ,它已经成为生 产酶的主要技术手段之一。但目前还存在着一些亟 待解决的问题。①能够进行固态发酵的酶种类偏 少。目前 ,大多的报道多为实验室的研究结果 ,但相 对实际生产和应用的酶种类而言 ,还是很小的一部 分 ,很少能体现出规模化生产的应用价值。②有关 SSF 产酶的研究中 ,由于各个试验所用的菌种、固体 基质和反应条件的设计存在差异 ,得到的数据缺乏 可比性 ,且各类试验以测酶活为多 ,以产酶量为指标 的研究不多。③由于 SSF 自身的特征 ,使得发酵参 数的控制非常困难 ,而且目前缺少固态发酵过程中 ·51· 河南农业科学 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 参数检测、发酵调控和自动化控制的仪表 ,造成了 SSF 过程产品质量的稳定性较差 ,同时 ,由于发酵数 据的缺乏 ,很难建立能够对数据做有效预测和最佳 化的数学模型。④新型 SSF 反应器的开发仍然是 值得研究的领域。由于缺少比较成熟的大规模生产 用 SSF 反应器 ,这无疑会大大阻碍固态发酵产酶的 实际应用。 目前 ,虽然工业上需求的酶大部分是用液态深 层发酵技术生产来满足的 ,但随着人们对固态发酵 认识的不断深入 ,固态发酵中存在的一些问题也有 望逐步得到解决和完善 ,使利用固态发酵技术进行 酶的大规模生产完全成为可能。尤其在能源危机和 环境问题日益突出的今天 ,固态发酵作为一种绿色 的生产工艺 ,将会有更加广阔的应用前景。 参考文献 : [1 ] 　Pandey A. Recent process developments in solid2state fermentation [J ] . Process Biochemist ry ,1992 ,27 : 109 - 127. [2 ] 　陈洪章 ,徐建. 现代固态发酵原理及应用 [ M ]. 北京 :化 学工业出版社 ,2004 :10 - 12. [3 ] 　Dos Santos M M , Souza da Rosa A , Dal′Boit S. Ther2 mal denaturation : is solid2state fermentation really a good technology for the production of enzyme [ J ] . Bioresource Technology ,2004 ,93 : 261 - 268. [4 ] 　吴大冶 ,张礼星 ,徐柔 ,等. 固态发酵生产细菌α- 淀粉 酶[J ] . 无锡轻工大学学报 ,2000 ,19 (1) : 54 - 57. [5 ] 　Ramachandran S , Patel A K ,Nampoothire K M. Coco2 nut oil cake - a potential raw material for the produc2 tion ofα- amylase [J ] . 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