微生物来源溶栓药物的研究进展_史丰坤

收稿日期: 2008- 05- 14 作者简介:史丰坤( 1982- ) ,女,山东省东营市人,山东轻工业学院硕士研究生,研究方向:微生物资源开发. 文章编号: 1004- 4280( 2008) 04- 0026- 04 微生物来源溶栓药物的研究进展 史丰坤1 ,刘建军1, 2 ,赵祥颖2 ,张京涛3 ( 1. 山东轻工业学院 食品与生物工程学院,山东 济南 250353; 2. 山东省食品发酵工业研究 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 院,山东 济南 250013; 3. 山东省日照市质量技术监督局, 山东 日照 276800) 摘要: 目前治疗血栓性疾病安全且有效的方法是溶栓疗法。已临床使用的溶栓药物主要是纤溶酶原激活剂类, 但 还存在许多缺陷, 因此新型溶栓药物的研制迫在眉睫。微生物是溶栓酶的重要来源, 通过对国内外微生物来源溶 栓药物的研究和开发状况进行分析和总结, 为寻找新型的、相对廉价有效的溶栓药物提供了依据。 关键词: 微生物;溶栓药物; 纤溶酶 中图分类号: Q556+ . 9 文献标识码: A Recent advances in thrombolytic drugs originates in microorganism SHI Feng- kun 1 , LIU Jian- jun 1, 2 , ZHAO Xiang- ying 2 , ZHANG Jing- tao 3 ( 1. School of Food and Bioengineering, Shandong Institute of Light Industry, Jinan 250353, China; 2. Shandong Food Ferment Industry Research & Design Institute, Jinan 250013, China; 3. Rizhao Quality and Technical Supertision Bureacl, Rizhao, 276800) Abstract: Thrombolytic therapy is safe and effective in curing thrombotic diseases at present. Plasminogen ac- t ivators are widely used as thrombolytic drugs clinically, while they are far away from perfect and urgent re- quests call for development of new thrombolyt ic drugs. Microorganism is an important source of thrombolytic, by analyzing and summarizing research and development status of thrombolytic drugs from microorganisms at home and abroad, data of searching new and cheap thrombolytic drugs are put forward. Key words: microorganism; thrombolyt ic drugs; fibrinolytic enzyme 当前, 严重危害人类健康的一大类疾病是血管 栓塞性疾病,据世界卫生组织调查显示,全世界血栓 性疾病患者不少于 1500 万人[ 1] , 其中以老年人居 多,而且还有上升趋势。心脑血管疾病已跃居人类 死因的首位[ 2]。 现在已临床使用的溶栓药物主要是纤溶酶原激 活剂类,其疗效肯定,明显降低了患者的死亡率和致 残率,但还存在许多缺陷,主要表现在初始再灌注延 迟或失败、易出血及再梗死等不良反应,而且大多数 价格昂贵,因此,研制高效、快速、防止再栓塞及减低 出血等不良反应的新型溶栓药物的需求迫切。由于 微生物种类多、繁殖快、容易培养, 生长条件易于控 制,提取 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 也较简单, 因此,研究微生物来源的溶 栓药物,越来越受到重视。 本文通过查阅国内外众多的溶栓药物研究文 献,着重阐述了来源于微生物的溶栓药物的制备研 究状况以及发展趋势。除早期发现的B- 溶血链球 菌( Streptococcus hemolyticus )产生的链激酶( Streptok-i nase, SK)和金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus )产 生的葡激酶( Staphylokinase, SaK)以及枯草芽孢杆菌 ( Bacillus subtilis ) 产生的纳豆激酶( Nattokinase, NK) 外,又陆续筛选到可产生纤溶活性物质的链霉菌 第 22 卷 第 4期 2008 年 12月 山 东 轻 工 业 学 院 学 报 JOURNAL OF SHANDONG INSTITUTE OF LIGHT INDUSTRY Vol. 22 No. 4 Dec. 2008 ( Streptomyces sp . )、假单胞菌属( Pseudomonas )和根霉 ( Rhizuopus chinensis )等微生物。 1 几种重要的微生物来源的溶栓药物 1. 1 链激酶( Streptokinase, SK) 链激酶( Streptokinase, SK)发现于 1949年, 是世 界上最早发现的纤溶酶原激活剂,也是最早用于临 床治疗血栓性疾病的溶栓药物。SK是由B- 溶血性 链球菌( Streptococcus hemolyticus)分泌的胞外酶,能和 纤溶酶原结合, 并将其激活为纤溶酶,具有很强的溶 解纤维蛋白的能力。SK 是由 414个氨基酸组成的 单链蛋白质,分子量为 47 kDa,通过链激酶的人体实 验,证实其有促进血栓溶解的作用,主要用于治疗心 肌梗塞。SK耐热性强,在 100 e 下处理 10 min仍然 能保持活性。SK分子中含有 Asp、Glu,不含 Cys, 其 活性中心分别是 Asp 和His,没有 Ser 残基位点。它 的N- 端为 Ile, C- 端为 Lys, pI为 5. 0。 链激酶临床应用表明 [3] ,其优点是高效、廉价, 冠状脉开通率为 58% , 缺点是具有抗原性, 因为每 个人都有可能被链球菌感染过, 因此会在体内产生 抗SK的抗体, 从而会导致出血综合症, 另外, SK 半 衰期短影响了药效的发挥。最近又有报道称链激酶 可诱发成人呼吸窘迫综合症。为了保证 SK应用的 安全性和有效性, Reed G L等深入研究了SK分子与 其抗体的反应。利用杂交瘤技术制备了 51种抗 SK 单克隆抗体( mAb) ,通过竞争性结合实验, 分为 6个 主要的补体组, 它们分别与 SK 分子不同区域结合, mAb7D4结合于 SK分子 1~ 253区域,抑制 SK与 Pln 结合, 但不影响已形成的 SK- Pln活性。mAb8F5既 抑制 Pln的结合, 又抑制 SK- Pln 的活性。该抗体 与SK120~ 352区域结合。目前,正在用基因重组的 方法制备链激酶,且已经应用于临床,产生了一定的 效果。 1. 2 葡激酶( Staphylokinase, SaK) 葡激酶即葡萄球菌激酶, 是由溶源性金黄色葡 萄球菌 ( Staphylococcus aureus )分泌的一种胞外蛋白 质水解酶,是含 136个氨基酸残基的单链多肽,无二 硫键,分子量是 15 kDa, 为微生物次级代谢产物, 也 是目前获准用于急性心肌梗塞的溶栓药物之一。 SaK与 SK一样,是间接纤溶酶原激活剂。它首 先和血浆中的纤溶酶原( plasminogen, PLG)形成没有 酶活性的 1B1复合物。在纤溶酶( plasmin PLM)的作 用下, SaK水解掉 N- 端的 10 个氨基酸, 而 PLG 被 PLMPSaK复合物催化变为 PLM, 暴露出活性位点, 这 样形成 PLMPSaK复合物才有活性。 SaK有明显的纤维蛋白特异性, 当无纤维蛋白 或血栓时, PLMPSaK 复合物很快被 A2 - 抗纤溶酶 (A2- antiplasmin A2- AP)灭活, 不激活纤溶系统 [5] ; 有血栓存在时 PLMPSaK 复合物与血栓中的纤维蛋 白结合, A2- AP对 PLMPSaK复合物的抑制作用显著 减小,血栓表面上 PLG的激活作用增强 100倍, 起到 了特异性溶栓作用。纤维蛋白与 PLM 结合后, SaK 可释放出来再循环, 增加溶栓的效率。Sak 溶解富 含血小板的动脉血栓并使血管维持再通状态的疗效 显著优于 SK, 且重复给药溶栓效力未见下降。与 SK相比, Sak具有较弱的免疫原性。伴随基因工程 的发展,重组葡激酶也相继问世了, 已应用于临床, 并取得了较好的效果。 1. 3 纳豆激酶( Nattokinase, NK) 纳豆激酶是一种研究起步较晚但发展很快的新 一代溶栓剂, 也是目前研究比较多的一种即将应用 于临床的有效溶栓药物。它属一种枯草杆菌蛋白激 酶,是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌( Bacillus subtilis ) 产生的一种丝氨酸蛋白酶。1987年,日本须 见洋行等首先发现纳豆( natto)及其提取物在体外具 有溶栓作用,分离出其中活性成分,定名为纳豆激酶 ( Nattokinase,NK)。1993年 Fujita M 等 [6] 学者用 SDS - PAGE测定NK的分子量为 27. 7 kDa,通过等电聚 焦测得 NK 的 pI 为 8. 6 ? 0. 3, 测出纳豆激酶是由 275个氨基酸残基组成的, 并已经从 Bacillus subtilis 中获得了这些酶的基因 aprN。aprN除了合成 275个 氨基酸的结构基因, 还包括了 29 个残基的信号肽 和 77个残基的前肽,其活性中心的催化部位由 Asp 32、His 64和 Ser 221组成, 底物结合部位由 Ser 125、 Leu 126和 Gly 127组成, NK在 pH 6~ 12、50 e 以下 稳定,经过 5个循环冻融后可保持 95% 活性, 当与 血清蛋白、胃黏液蛋白以及煮沸过小麦或大米提取 液和肉汤混合后, NK的稳定性则显著增加,甚至在 酸性环境下, 酶活性也不会完全丧失,说明 NK在胃 中也可以保持一定的活性。目前 NK的药效学研究 已经进入临床实验阶段,在临床实验中, 口服NK胶 囊能明显缩短优球蛋白的溶解时间( ELT) , 而优球 蛋白的纤溶活性提高, 还能促进血管内皮细胞产生 t- PA,因而 NK具良好的口服溶栓作用。 NK作为潜在的溶栓药物具以下优点 [7] : ¹ 来 源于传统发酵食品,安全性好; 可由消化道吸收,具 有成为口服性药物的可能; º 是一种单链蛋白质, 分子量小,易被人体消化吸收; » 对纤维蛋白的作 用机制不同于 UK 等现行临床用药, 它具有直接的 27第 4期 史丰坤,等 :微生物来源溶栓药物的研究进展 纤溶作用,同时还可以激活体内的 t- PA。 另外,台湾学者 Chang CT 等[ 8]人从/纳豆0菌突 变株的固体发酵物中纯化出纤溶活力较高的丝氨酸 蛋白酶,该酶分子量 31. 5 kDa, pI 为 8. 3,最适作用 pH 7. 8, 最适作用温度 55 e , 底物专一性与 NK 相 似。我国学者对此也开展了一些研究工作。彭 勇[ 9]、齐海萍[ 10]分别从我国/纳豆0和豆豉中分离出 产纤溶酶的枯草杆菌, 对发酵产物中的纤溶活性成 分提纯并研究其生化性质。刘常金等[ 11] 提纯了枯 草杆菌产生的一种纤溶酶并进行了部分性质的研 究,从枯草杆菌 SBS6菌株发酵上清液中分离得到电 泳纯的纤溶酶, 经 SDS- PAGE和凝胶过滤测得其分 子质量为 31 kDa,最适 pH 8. 9, 最适温度为 50 e , 酶 在60 e 下 pH 5~ 12 范围内相当稳定, Ca2+ , Mg2+ , Zn 2+ ,Mn 2+ 等离子对酶的溶解血纤维活性无明显影 响, Fe2+ 和 Fe3+ 分别抑制酶活性的 17%和 20%。谢 秋玲等 [12]从市售纳豆中分离出一株能产生纳豆激 酶的枯草芽孢杆菌( B. subtilis ) , 并且研究了液体发 酵条件,优化了培养基。将提取出的纳豆激酶应用 于狗的血栓实验以及健康人群的体内溶栓实验研 究,证明除了具有显著的溶栓作用之外,也具有促进 静脉内皮细胞产生纤溶酶原激活剂的能力。韩国学 者Kim W 等[ 13]从韩国传统食品 ) ) ) 发酵豆饼酱中 发现枯草激酶( CK)。CK 由芽孢杆菌 ( Bacillus sp . CK- 114)分泌, CK 是目前发现热稳定最高的溶纤 酶, 水解稳定高,最适温度70 e ,最适 pH 10. 5,分子 量28. 2 kDa。CK除具有十分显著的纤溶活性外, 还 有促纤溶活性, 协助溶栓。目前已经在许多动物模 型实验中表现出较理想的溶栓效果。 这些枯草杆菌产生的纤溶酶都来自传统发酵食 品,所取得的研究成果对开发功能食品,并生产溶栓 药物尤其是口服溶栓药物, 以达到治疗和预防血栓 栓塞性疾病的目的, 具有重要的社会和经济意义。 2 其它微生物来源的溶栓药物 随着研究的深入,除发酵食品外, 还在土壤、稻 草、海洋等其它环境中发现了此类微生物。 2. 1 链霉菌产生的新型纤溶酶 链霉菌是多数抗生素生产的重要菌种, 可同时 分泌多种蛋白酶, 且为非致病菌, 较金黄色葡萄球 菌、链球菌等致病菌优越性强,因此研究该种菌产生 的活性物质具有重要的实际意义。利用链霉菌产生 的新型纤溶酶来制备溶栓药物可能是一种新的尝 试。 中国协和医科大学中国医学科学院王俊等[ 14] 报道从云南土壤中筛选到一株产多种纤溶活性成分 的链霉菌Y405( Streptomyces sp . ) ,所产生的新型纤溶 酶 SW- 1,为一种活性蛋白酶, 并分离出了其中的单 肽链蛋白酶 CGW- 3和 SW- 1。CGW- 3为一丝氨 酸蛋白,分子量 22. 7 kDa, pI 9. 0。CGW- 3不仅具 有直接降解纤维蛋白的作用,而且能够激活纤溶酶 原。SW- 1分子量为 30 kDa, pI 8. 5,在 4~ 37 e 和 pH 4. 0~ 9. 0时具较好的稳定性。Fujita M 等[ 15] 将 SW- 1注入大鼠静脉, 结果显示在体内对静脉血栓 有显著的溶解作用,其效果与同剂量的尿激酶相当。 SW- 1使大鼠血浆中纤溶酶和纤溶酶原水平提高, 而对内源组织型纤溶酶原激活剂( t- PA)和A2 纤溶 酶抑制剂无显著影响, 此外 SW- 1还引起系统中纤 维蛋白原水平下降,说明SW- 1还可降解纤维蛋白 原,这与体外的试管凝块实验结果是一致的。表明 它对血栓中纤维蛋白的特异性不强, 在溶栓的同时 有可能造成系统溶纤。 2. 2 海洋假单胞菌产生的纤溶酶 与陆栖微生物相比,海洋微生物具有其独特的 生理特性,如:耐盐、耐高压、嗜低温等。所以海洋微 生物是获取新溶纤活性物质的又一重要来源,将为 人类提供更好的生物制品。 刘晨光等[ 16] 从海洋假单胞菌( Pseudomonas )获 得一种新型溶纤酶,分子量是 21 kDa, pI 7. 4~ 7. 5, 最适作用 pH 为 8. 0, 最适作用温度为 50 e 。该酶 可降解苯甲酰- L- 精氨酸乙酯盐酸盐( BAEE)的活 性,酶动力学分析表明: K m = 0. 87 mmolPL, Vmax = 1. 80 @ 10- 3 mmolPLs- 1。该酶能切割 Arg 或Lys形成 的肽键。但是对该酶的结构、催化特征以及毒理、药 效作用等还需进一步研究。 2. 3 根霉产生的纤溶酶 天津科技大学从南方小药酒中分离出一株根霉 ( Rhizuopus chinensis) , 经鉴定为中国根霉, 命名为中 国根霉 12# ,发酵后产生具有溶解血栓活性的物质。 近来,刘晓兰等[ 17] 利用紫外线- 氯化锂复合诱变的 方式,筛选得到酶产量较出发菌株提高 32. 9%的一 株稳定高产正突变株, 通过固体发酵进一步筛选。 分离纯化纤溶酶分子量为 18. 0 kDa 和 16. 6 kDa,等 电点 8. 5 ? 0. 1, 有直接降解血纤维蛋白和激活血纤 维蛋白溶酶原成纤溶酶的双重溶栓作用, 测定的根 霉纤溶酶 N- 端的 12个氨基酸序列依次为 NH2 - Ser- Val- Ser- Glu- Ile- Gln- Leu- Met- His- Asn - Leu- Gly。 28 山 东 轻 工 业 学 院 学 报 第 22 卷 2. 4 芽孢杆菌产生的纤溶酶 韩国的Wodeuk. Kim等从芽孢杆菌( Bacillus sp . CK- 114)的分泌物中分离纯化得到了一种分子量 为 28. 2 kDa 的纤溶酶, 命名为枯草激酶( CK)。CK 的最适作用温度为 70 e , 具有较好的热稳定性, 与 同类的枯草杆菌蛋白酶激酶相比, CK具有明显的纤 溶活性, 为其它酶的 8倍。此外 CK 还具有促纤溶 活性,协助溶栓。目前 CK 已经在许多动物模型实 验中表现出较理想的溶栓效果。 2. 5 粪链球菌产生的纤溶酶 英国的Walton Oaks等从粪链球菌中提取得到 一种纤溶酶,为中性金属内肤酶, 分子量为 19 kDa。 该酶对产色底物 FAGLA有高度契合性,它的活性受 TLCKT 和 TPCK抑制作用不明显, 但可被 EDTA 和 Zn 2+ 所抑制,体外溶栓试验证明该酶是一种不依赖 纤溶酶原 ) ) ) 纤溶酶系统的纤溶酶类。但由于该酶 热稳定性较差, 至今不未有很完善有效的提纯方法。 此外, Lee 等[ 18]还从密环菌( Armillariella mellea) 发酵物中分离到具溶纤作用的金属蛋白酶。 3 展望 微生物代谢产物在整个药物的发展过程中扮演 着重要的角色。微生物种类繁多,为我们的研究提 供了广阔的研究空间,伴随着新微生物的不断发现, 新的溶栓药物也不断涌现。在国内外, 利用微生物 寻找溶栓药物依然是最佳手段。目前, 溶栓药物的 来源不仅是从自然界之中筛选微生物, 更为重要的 是通过改造的微生物 ) ) ) 基因工程菌, 提高溶栓药 物的应用专一性。因此, 对由微生物分泌纤溶酶类 的研究将会为临床大量使用这类溶栓药物提供广阔 的前景。 参考文献: [ 1] 石英. 血栓与血栓疾病的治疗进展[ J ] . 新疆医学, 1998, 19 ( 4) : 231- 233. [ 2] Beilin B, Shavit Y, Razumovsky J , et al. Effect of mild perioperat ive hypother on cellularimmune responses [ J] . Anesthesiology, 1998, 89 (5) : 1133- 1140. 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