响应面分析法在中药提取和制备工艺中的应用

品 6 份，分别精密加入 0. 270 mg /mL 的丹参酮ⅡA 对照品溶液 0. 6 mL，照“3. 4”项下方法制备和 “3. 1”项下方法进行测定，结果见表 1。 表 1 丹参酮 ⅡA 加样回收率试验结果(n =6) 样品 含量 / μg 加样量 / μg 测得 总量 / μg 回收率 / % 平均 回收率 / % RSD /% 185. 0918 162 348. 2655 100. 72 185. 1878 162 348. 4785 100. 80 185. 0402 162 352. 1280 103. 14 184. 6270 162 348. 5025 101. 16 184. 6934 162 350. 5580 102. 39 184. 7376 162 348. 3780 101. 01 101. 54 0. 9777 3. 11 样品中丹参酮ⅡA 含量测定 精密称取 3 批样品(批号 090908、090909、090910) ，按“3. 4”项 下方法制成供试品溶液，分别吸取供试品溶液 10 μL进样，依法测定，计算丹参酮ⅡA 含量分别为 37. 2294、36. 8598、38. 5811 μg /g，平均含量为 37. 5568 μg /g。 4 讨论 4. 1 本研究采用 TLC 法鉴别软肝颗粒中三七、当 归两味药，比较三七的展开剂 1:三氯甲烷-乙酸乙 酯-甲醇-水(15∶ 40 ∶ 22 ∶ 10) ，展开剂 2:三氯甲烷-甲 醇-水(13∶ 7∶ 2) ，结果使用展开剂 1，在 10 ℃以下放 置 12 h以上取上层液，饱和时间不少于 30 min ，且 10 ℃下展开时斑点较清晰，分离效果好。 4. 2 本研究采用 HPLC 法测定颗粒中丹参酮ⅡA 含量，通过二极管阵列检测器检测收集 190 ～ 800 nm所有吸收光谱，丹参酮ⅡA 最大吸收峰为 269 nm;比较流动相 1:甲醇-水(75∶ 25) ，流动相 2:甲醇- 水(80∶ 20)〔1〕，流动相 3:甲醇-水(70∶ 30) ，发现流动 相 1 系统适应性最好;比较超声提取 45 min(250 W，40 kHz) ，甲醇回流(80 ℃恒温水浴)提取 1 h，结 果超声提取法样品中丹参酮ⅡA 含量较高，可能因 温度较高会加速丹参酮ⅡA 的降解〔2〕，故本研究采 用超声提取法处理样品。 4. 3 本品中丹参酮ⅡA 平均含量为 37. 5568 μg / g，考虑到药材的来源以及制剂生产、储藏等因素，暂 定本品中含丹参酮ⅡA不得少于 30 μg /g。 4. 4 本研究采用 TLC 法定性鉴别三七、当归特征 斑点明显，HPLC 法测定君药丹参中丹参酮ⅡA 含 量，方法较简便，且稳定、准确，可有效控制软肝颗粒 的内在质量。 参 考 文 献 ［1］赵磊磊，谢凯，朱盛山，等 . 不同产地丹参的 HPLC 和 TLC图谱分析［J］. 中药材，2007，30(6) :646-648. ［2］苏子仁，曾惠芳，曾元儿，等 . 丹参醇提工艺中丹参酮Ⅱ A降解动力学研究［J］. 中药材，1997，19(12) :1-3. 收稿日期:2010-04-12 基金项目:黑龙江省科技攻关项目(GC05C31602) * 通讯作者:刘高峰，Tel:0451-55969328，E-mail:liugaofengwty@ 126. com。 ·综述· 响应面分析法在中药提取和制备工艺中的应用 余小翠，刘高峰* (哈尔滨医科大学附属第二医院药学部，黑龙江 哈尔滨 150086) 摘要 在中药有效成分的提取和中药制剂的制备过程中工艺条件的优化极为重要。响应面分析法是一种优 化工艺条件的有效方法，该方法采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，试验次数少、周期 短，求得的回归方程精度高且能研究几种因素间的交互作用，显示出突出的优势，是一种优于其他统计分析的实验 设计方法，目前主要应用于生物、农业、食品等领域，而在中药领域中的研究尚比较少。本文介绍了响应面分析法 在中药提取和制备工艺中的应用进展，以系统了解并指导其在该领域的应用研究。 关键词 响应面分析法;中药;提取;制备;工艺优化 中图分类号:R284 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2010)10-1651-05 中药有效成分的提取和制剂制备往往受多种因 素及其交叉作用的影响，且有多个 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 指标，很多情 况下是在某种条件下一个评价指标较好，而另一个 指标却较差，难以得到最佳的结果。因此，选择适宜 ·1561·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 33 卷第 10 期 2010 年 10 月 的设计方法进行工艺条件的优化显得尤为重要。传 统的设计方法如正交设计和均匀设计等，都有各自 的局限性，不能全面地优化工艺。已广泛应用于食 品、农业、化工等领域的响应面分析法近年来开始应 用于中药领域，该方法试验次数少、周期短，求得的 回归方程精度高、能研究几种因素间的交互作用，显 示出突出的优势〔1〕。现将响应面分析法在中药提 取和制备工艺中应用的国内外相关报道进行综述， 为其在该领域的应用研究提供参考。 1 响应面分析法及与其它设计方法的比较 响应面分析法(Response Surface Methodology， 简称 RSM)是由一组数学和统计学方法组成，可用 于一个或多个响应值与几种因素之间的关系，确定 各因素及其交互作用在加工过程中对非独立变量的 影响，给出一个数学模型，精确地表述因素和响应值 之间的关系，同时可根据数学模型控制响应值，选择 不同的操作参数〔2〕，从而寻求最佳工艺参数。一般 先通过单因素法选出对响应值有较大影响的因素， 然后根据因素水平数和实验点的不同，来选择合适 的实验设计方法。常见的实验设计方法有 3 水平因 子设计、Box-Behnken 设计、星点设计(central com- posite design)和 Doehlert 设计〔3〕。目前最常用的是 星点设计，但与星点设计相比，Box-Behnken 设计所 需的试验次数相对较少、效率更高且所有的影响因 素不会同时处于高水平，所有的试验点都落在安全 操作区域内等优点〔4〕，因此 Box-Behnken 设计也正 广泛被应用。根据试验设计进行实验，并对结果进 行分析。可得到回归方程，通过方差分析来验证方 程的拟合程度，通过解析回归方程可得最佳提取工 艺参数，同时可将回归方程中的任两因素保留，其它 因素固定为零水平，可作出响应面图及其等高线，得 到此两个因素的交互影响作用及各因素的最佳范 围，并在试验优化的区域内进行可行性验证，确定最 佳提取工艺。 在药学研究领域应用较多的传统的设计方法有 正交设计和均匀设计等。正交设计注重如何科学合 理地安排试验，可同时考虑几种因素，寻找最佳因素 水平组合，但它不能在给出的整个区域上找到因素 和响应值之间的一个明确的函数表达式即回归方 程，且不能全面地研究各因素之间的交互作用。均 匀设计以牺牲部分正交性、最大化地追求均匀性来 达到减少试验次数为目的，当试验次数少于因素个 数时，采用多重回归的方法来研究响应变量随自变 量的变化的回归方程就不是唯一的，而且其在试验 设计时没有考虑全部交互作用，只有通过回归分析 时引入因素之间的交叉乘积项等来进行探索，因此 其结果不够稳定。 响应面分析法由于试验次数少，试验精度高，并 适合于多因素、多水平的试验，比正交设计试验法更 简化，比均匀设计更全面，且得到的关系式可以确定 在试验范围内的任何试验点的预测值〔5〕，因而显示 出突出的优势。 2 响应面分析法在中药有效成分提取工艺中的应 用 影响中药有效成分提取的因素很多，如:所用的 提取溶剂的种类及其用量、提取的次数、时间、方式、 温度、pH 值、药物之间的配伍等〔6〕，响应面分析法 可以有效地对中药有效成分提取工艺进行优化。 2. 1 黄酮类 白苏主要成分为紫苏醛、紫苏醇、柠 檬烯以及紫苏苷、木犀草素、芹菜苷、芹黄素等多种 黄酮类化合物〔7〕，具有抗氧化和清除自由基的作 用〔8〕，还有解热、镇咳、平喘等作用〔9〕。王薇等〔10〕采 用响应面分析法对超声提取白苏中黄酮类化合物的 工艺进行了优化研究。据 Box-Behnken 中心组合原 理，综合单因素实验结果，以料液比、乙醇体积分数 与提取时间为影响因素，白苏中总黄酮提取率为响 应值，对实验结果采用 SAS 9. 1. 3 软件进行分析，得 回归方程:Y = 25. 8233 － 0. 1213X1 + 0. 4800X2 + 2. 0588X3 － 0. 9242X 2 1 － 0. 0575X1X2 + 0. 0800X1X3 － 1. 5467X22 + 0. 4825X2X3 － 2. 0292X 2 3。据响应曲面图 及其等高线图对影响超声提取的关键因子及其相互 作用进行分析，得到的优化工艺参数为:药材 15 倍 量 60%乙醇超声提取 4 次，每次 18 min，最后得到 的白苏总黄酮的提取率为 24. 65 mg /g。验证实验 结果 RSD为 2. 12%，证明该工艺稳定，重现性好。 另有报道采用响应面分析法对超声波提取金银 花总黄酮〔11〕、微波提取苦丁茶总黄酮〔12〕、乙醇提取 山楂中总黄酮〔13〕、乙醇提取万寿菊花总黄酮〔14〕、乙 醇提取乳苣总黄酮〔15〕等工艺进行优化，为黄酮类化 合物的广泛应用和资源的充分利用提供依据。 2. 2 生物碱类 吴茱萸具有散寒止痛、降逆止呕、 降血压的作用，吴茱萸次碱是吴茱萸的主要成分之 一〔16〕。王君伟等〔17〕从乙醇体积分数、提取时间、原 料目数、溶剂倍数 4 个因素出发，利用响应面分析法 对其提取参数进行优化。试验分析表明其因素显著 性顺序为:乙醇体积分数 ＞原料目数 ＞提取时间 ＞ 溶剂倍数，并得出吴茱萸次碱提取的最佳工艺条件 为:原料目数为 40 目、提取时间为 3. 0 h 、溶剂倍数 为 31 、乙醇体积分数为 72% ，吴茱萸次碱的最大提 取率为 8. 90 mg /g，而理论值为 8. 95 mg /g，说明响 ·2561· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 33 卷第 10 期 2010 年 10 月 应面分析得到的试验结果模型真实可靠，可得到较 理想的研究结果。赵卫星等〔18〕采用响应面分析法 对百部总生物碱提取工艺进行了优化，得到百部总 生物碱含量为 9. 63 mg /g，为其在农业、医药、食品 等方面的开发提供理论参数，对百部进一步的开发 和应用具有重要价值。 2. 3 苷类 紫花苜蓿(Medicago sativa L. )简称苜 蓿，其有效成分苜蓿皂苷是一种很好的生物活性物 质，有降血脂、预防和减轻动脉硬化、抗炎及抗癌作 用，被认为是苜蓿药用功能的主要来源。张亮等〔19〕 从单因素试验出发，得出对总皂苷得率影响较大的 4 因素为:超声功率、超声时间、固液比、超声温度。 以这 4 个因子为自变量，以总皂苷得率为响应值，设 计了 4 因素 3 水平共 21 个实验点的响应面分析实 验，利用 Minitab软件对实验数据进行分析得到回归 方程，通过分析响应面图得出，对总皂苷得率影响显 著程度由大到小依次为:超声温度、固液比、超声功 率和超声时间，其中超声温度和固液比影响最为显 著，直接关系到皂苷提取率。并得到最佳工艺条件 为:超声功率 403 W，超声时间 22 min，固液比 1∶ 51， 超声温度 43 ℃，皂苷的最高得率为 4. 53%。研究 结果对实现我国苜蓿皂苷资源的深层次开发，开辟 其新的应用途径，提高苜蓿皂苷产品的科技含量，都 具有重要的意义。 另有报道分别用响应面分析法对广西桔梗总皂 苷提取工艺〔20〕和超声提取栀子苷工艺〔21〕进行优化 研究，取得满意结果。 2. 4 大黄蒽醌类 大黄主要有效成分为蒽醌衍生 物〔22〕，其中游离蒽醌具有抗菌消炎、抗病毒、抗癌、 保肝利胆、降脂降压、促智、抗衰老和延缓肾衰等作 用〔23〕。大黄的成分复杂，游离蒽醌一般采用从大黄 中提取蒽醌类化合物再水解的方法制备。关于水解 条件的研究报道不一，且不详尽。何苗等〔24〕采用响 应面分析法对大黄游离蒽醌水解条件做了进一步研 究。根据单因素试验及 Two-level试验结果，采用响 应面 Box-Behnken 设计分析。以水解率为响应值， 对主要的 3 个因素(盐酸浓度、温度和时间)进行 3 水平优化，最终得出对水解率影响的大小排序为:盐 酸浓度 ＞温度 ＞时间;且温度和时间的交互作用不 大，随着温度的升高，水解率开始下降;盐酸浓度和 温度、时间的交互作用影响显著。根据预测值确定 大黄游离总醌的最佳水解条件为:盐酸浓度 5. 4 mol /L，反应液温度为 46 ℃，搅拌速度控制在 50 ～ 150 r /min，水解 1. 5 h，最大水解率为 97. 7%，与验 证实验值接近。 2. 5 茶多酚类 茶为药用，在我国已约有 270 年 的历史。茶多酚是茶的主要成分，包括黄烷醇、黄烷 双醇、黄酮类和茶多酚酸类，其中大部分是黄烷 醇〔25〕。茶多酚不仅是一种天然无毒的抗氧化剂，也 是理想的天然药物，具有多种保健功能和药理作 用〔26〕:具有清除自由基、抗菌抗病毒、抗肿瘤、抗氧 化、除臭、多药耐药性逆转和防治心血管病等作用。 为研究几个因素间交互作用对提取率的影响，郭树 琴等〔27〕用 Box-Behnken的中心组合试验设计原理， 综合单因素试验结果，选取提取时间、超声电功率、 液料比 3 个因素，进行 3 水平的响应面分析方法。 得到回归方程，并运用 Design Expert软件对 15 个实 验点的响应值进行回归分析。从而得出对提取率影 响由大到小的顺序为:料液比 ＞提取时间 ＞超声功 率。从响应面曲面图中可知，料液比与提取时间对 茶多酚提取率的交互效应最为显著，表现为曲线较 陡;而料液比与功率对茶多酚提取率的交互效应次 之，功率与提取时间对茶多酚提取率的交互效应不 显著，相应表现为曲线较为平滑。通过解析回归方 程，得出最优提取条件为:料液比为 40. 2 mL /g，超 声功率为 476 W，提取时间为 15. 1 min，最大提取功 率 10. 312%，采用该实验条件进行验证实验得提取 率为 10. 307%，说明通过采用响应面分析法得到了 一个能较好预测试验结果的模型方程。 3 响应面分析法在中药制剂制备工艺中的应用 3. 1 甘草次酸长循环脂质体的制备 甘草次酸 (glycyrrhetic acid，GA)为中药甘草的主要有效成 分，具有治疗慢性肝炎及肝癌、免疫调节等作用〔28〕。 GA难溶于水，口服几乎不吸收，普通注射剂的生物 利用度低。脂质体由于制备简单，对机体无毒，无免 疫原性及易实现靶向性等特点而倍受重视。将 GA 制备成长循环的脂质体，可以提高药物的体内吸收， 延长药物在体内的循环时间，达到肝靶向的目的。 脂质体的评价指标一般为包封率、粒径、释放度，在 多指标的优化试验中，每个指标的优选可能会相互 矛盾，对某一指标有利的条件可能对另一指标不利。 李娟等〔29〕用响应面分析法对甘草次酸长循环脂质 体的制备进行了研究，并在试验中引入一个综合指 标“归一值”(OD)以考察指标的综合效果。以影响 脂质体理化性质较显著的 3 个因素:大豆磷脂(PC) 的用量、去氧胆酸钠(SD)的用量和 PLA-mPEG的用 量作为考察对象，以包封率、粒径、释放率、OD 值为 指标，采用 Design-Expert 7. 0. 3(试用版)软件对各 因素进行拟合得回归方程。结果为:影响脂质体包 封率最主要的因素为磷脂的用量，随磷脂量增大，亲 ·3561·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 33 卷第 10 期 2010 年 10 月 脂性的药物更容易进入脂质双分子层，脂质体的包 封率可明显提高。去氧胆酸钠与嵌段共聚物对包封 率有一定影响，去氧胆酸钠可以减少脂质体的粒径。 另一方面，磷脂用量的增加会导致粒径在一定程度 上增大。处方中加入的 PLA-mPEG 嵌段共聚物可 以减慢脂质体的释药速度，以延长脂质体在体内的 循环时间。通过控制 OD值，可有效评价处方指标， 常被应用于具有多个评价指标的优化设计。通过验 证，证明试验拟合的方程可以较好描述因素与指标 的关系，并且所制备的长循环脂质体基本可以达到 体内长循环的设计指标。 3. 2 挥发油-β-环糊精包合物的制备 紫苏叶含有 较多的挥发油，具有解表散寒、行气和胃的有效成 分，目前紫苏叶挥发油的中成药制剂多以配洒挥发 油、密封包装为主，其缺点是挥发油易损失，气味不 良和不易贮存。而用环糊精做成的包含物能改善药 物理化性质，增加药物的溶解度和稳定性，提高药物 的生物利用度，减少不良反应，掩盖不良气味等，解 决了某些药剂生产工艺中的不少难题〔30〕。以 β-环 糊精包合紫苏叶中的挥发油，能防止制剂贮存时挥 发油的损失。吴大章等〔31〕应用响应面法优化紫苏 叶挥发油-β-环糊精包合物制备工艺，采用 Box-Be- hnken设计实验，并以非线性数学模型拟合，复相关 系数高。由回归分析所作的曲面图和响应面图可 知，投料比与包合温度对包封率的影响较为显著，而 包封时间的影响不大。同时交互因素影响较大，造 成当包合率较大时，得率会降低;当得率较小时，包 合率反而较大。因此，实验中引入一个综合指标，用 “归一值”(OD)对工艺进行综合评价，即包合率与 收得率的综合评价指标，该值可反映总体效应结果。 最终确定紫苏叶挥发油-β-环糊精包合物制备工艺 最优条件为:β-CD-挥发油投料比为 8. 5 ∶ 1，包合时 间为 4 h ，包合温度为 51 ℃。经验证实验证明模型 可靠，用响应面法研究紫苏叶挥发油-β-环糊精包合 物最佳制备工艺可行。 王霏娜等〔32〕也采用了响应面分析法对 β-环糊 精包合白术挥发油的工艺进行优化，进一步促进了 中药新剂型、新品种的开发。 3. 3 山楂总黄酮磷脂复合物的制备 山楂为药食 同源植物，主要含有机酸类和黄酮类化合物。有机 酸类为山楂消食化积的主要有效成分，黄酮类化合 物具扩张冠状动脉，改善微循环，抗动脉粥样硬化等 多种药理作用〔33〕。黄酮类化合物由于水溶性差限 制了其临床应用，但磷脂可以与难溶性药物制成磷 脂复合物，可有效提高难溶性药物在体内的吸收。 史亚军等〔34〕采用星点-效应面法对山楂总黄酮磷脂 复合物的制备工艺进行了优化。首先采用 Plackett- Burman 设计对制备工艺影响因素的重要性进行考 察，结果表明投料比(磷脂 /药物)、药物浓度和反应 时间为主要的影响因素。用星点设计对显著性因素 的水平进行优化，以药物与磷脂的复合率为评价指 标，最终得到的最佳工艺为投料比为 3∶ 1，主要浓度 为 10 mg /mL，反应温度是 40 ℃，并通过验证实验证 明模型是可靠的。 4 响应面分析法在中药领域的应用展望 响应面分析法由于在试验设计和结果表达方面 更加优良，因而在国内外已广泛应用于食品、生物工 程、化工等领域〔35-37〕，在中药研究中的应用还是一 个比较新的研究领域。对于中药有效成分的提取和 制剂制备工艺的研究，目前报道尚比较少，但已有的 研究结果显示，响应面分析法作为一种有效的实验 设计方法，可进行多因素多水平实验研究，并可研究 因素间的交互作用，根据综合指标得到最优化的工 艺结果，显示出较其它设计方法更多的优势。随着 响应面分析法应用的增多，其在中药领域的应用研 究对于推动中药相关学科的发展和资源的充分利 用，将发挥重要的作用。 参 考 文 献 ［1］慕运动 . 响应面方法及其在食品工业中的应用［J］. 郑 州工程学院学报，2001，22(3) :91-94. ［2］慕运动，朱碧，郭兴凤 . 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