3_5_二硝基水杨酸_DNS_比色法测定马铃薯还原糖含量的研究

3 ,5 -二硝基水杨酸（DNS ）比色法测定 马铃薯还原糖含量的研究 朱海霞，石 瑛，张庆娜，陈伊里 * （东北农业大学，黑龙江 哈尔滨 150030） 摘 要：试验针对3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定马铃薯还原糖含量的吸收光谱及其对测定值可靠性的 影响因素进行了研究。找到了分析马铃薯还原糖的最佳条件：!射波长为510 nm，显色剂用量为6 mL，在沸水 浴的显色时间范围为12～15 min，结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明该方法的灵敏度得到了提高。由于该方法具有方便、安全、成本低等 优点，适合于常规实验室马铃薯还原糖批量和定量的测定。 关键词：马铃薯；还原糖；比色法；3,5-二硝基水杨酸 收稿日期：2005-08-12 作者简介：朱海霞（1979-），女，东北农业大学硕士研究生， 从事马铃薯遗传育种研究。 基金项目：国家“863” 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目（2004AA241133）资助 !通讯作者：E-mail:potato@mail.neau.edu.cn 中图分类号：S532文献标识码：A 文章编号：1672-3635（2005）05-0266-04 马铃薯薯片和薯条油炸色泽是 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 马铃薯油炸 食品质量优劣的重要指标，还原糖含量则是影响油 炸色泽的重要因素[1]。因此，国内外马铃薯育种家 把还原糖含量作为选育油炸加工型马铃薯品种或材 料的重要品质指标。 测定马铃薯块茎还原糖含量的常规方法是 容量分析法如铜还原-碘量法。近年来，用比 色法测定马铃薯块茎中的还原糖含量因具有方 法简便、测定速度快等优点得到广泛应用，如 砷钼酸比色法和 3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色 法[2]。 DNS比色法的原理是[3]：3,5-二硝基水杨酸在 碱性溶液中被还原糖还原成氨基化合物，在沸水浴 中显色时间 5 min，波长在 540 nm下有最大吸收 峰。试验过程中的诸多因素如吸收光谱、显色剂用 量、显色时间等均对测定结果的准确性有直接影 响。因此，我们对用3,5-二硝基水杨酸比色法测 定马铃薯块茎还原糖含量的反应条件进行了一系列 的试验，试图摸索最佳的试验条件以保证试验的精 确度，以期获得可靠的数据为马铃薯品质育种的实 践提供参考。 1 材料与方法 1.1试验材料 1.1.1马铃薯样品 马铃薯新型栽培种轮回选择群体后代材料320 份，收获后一个月内，用脲糖试纸对块茎还原糖进 行初步测定，筛选还原糖含量有一定差异的材料40 份。挑选中等大小的块茎清洗、烘干、粉碎待用。 1.1.2马铃薯提取液的制备 准确称取马铃薯样品粉末（称前烘干至恒重） 1 g左右放入50 mL容量瓶中，其它步骤见文献[3]。 1.1.3仪 器 山东752型紫外光栅分光光度计。 1.1.4试 剂 1 mg·mL-1葡萄糖 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 液：准确称取 1 g的无 水葡萄糖，待溶解后定容至1000 mL。 DNS显色液：准确称取无水的3,5-二硝基水杨 酸6.5 g溶解待用。无水氢氧化钠40 g溶解后移入 500 mL容量瓶，冷却后定容。将水杨酸溶解液移 入1000 mL容量瓶并加入325 mL的氢氧化钠，再 加入15 mL丙三醇溶解定容至1000 mL贮存于棕 色试剂瓶中。以上试剂均为分析纯。水为蒸馏水。 1.2试验方法 1.2.1吸收光谱的测定 准确吸取 3、5、7 mL的 DNS于 50 mL容量 ·266· 中国马铃薯，第19卷，第5期，2005 图1 不同DNS显色剂用量的吸收光谱 瓶中并定容。取 1、3、5、7mL葡萄糖标准液 于 50mL容量瓶中并加入 5mLDNS，加水至 25 mL左右。在沸水浴中煮 5min，流水迅速冷却， 定容摇匀，20min后在 400～560nm之间测吸光 值。 1.2.2 标准曲线的测定 准确取 1、2、3、4、5、6、7、8mL的葡萄 糖标准液分别加入到 50mL的容量瓶中，各加 5 mL的DNS在沸水浴中煮 5min后流水迅速冷却， 定容摇匀，空白调零。20min后在所确定的吸收 光谱波长下测定吸光值。 1.2.3 显色剂用量的选择 为了保证显色完全，我们采用高浓度葡萄糖的 标准液来进行DNS用量的选择。准确吸取4mL的 葡萄糖标准液加入50mL容量瓶中，并分别加入 3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7mLDNS于容 量瓶中加水约25mL，步骤同上。 1.2.4 显色时间的确定 准确吸取1、2、4mL葡萄糖标准液分别加入 到50mL的容量瓶中，各加5mLDNS，并在沸水 浴中煮 2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、 18、20min，步骤同上。 1.2.5 稳定时间的确定 任意选择一个马铃薯样品提取液，准确吸取葡 萄糖标准液2mL和样品提取液4mL加入容量瓶， 步骤同上。显色后放置 20min、1、2、3、4、5、 6h后测定吸光值。 1.2.6 马铃薯样品DNS显色吸光度曲线 任意选取5个还原糖含量不同的马铃薯提取液 （稀释倍数12.5）进行重复扫描，获得吸光值。 1.2.7 不同波长下马铃薯还原糖含量的比较 任意选取12个还原糖含量不同的马铃薯样品 提取液，在本文所确定的波长和相关文献报道的波 长（540nm）下进行扫描，根据所获得的吸光值， 在不同波长下的标准曲线中分别查出相对应的浓 度，并计算总糖含量[4]。 还原糖mg×样品稀释倍数 样品质量 mg 1.2.8 数据处理 试验数据用 EXCEL2000进行处理和作图， 并采用成对数据比较和 t测验法进行差异显著性 分析。 2 结果与分析 2.1 吸收光谱 波长在400～600nm范围内对DNS液以及葡萄 糖标准液反应生成的氨化合物（蒸馏水调零）的吸 收光谱进行了扫描，由于所使用的分光光度计灵敏 度低，DNS用量大等原因，图1未能测得400～480 nm的吸光值，图2未得到510nm之前的吸光值， 所以均未得到二者的完整吸收峰度曲线，但从图1 可以看出，3mL、5mL、7mL的DNS在480～500 nm有较高的吸光值，由于显色剂本身具有颜色而 获得的吸光值将会影响显色液吸光值的可靠性，因 此分析波长的选择应避开此范围可消除显色剂对分 析的干扰，从图2可以看出510nm具有最大的吸 光值，在本实验仪器的基础上，根据图1、图2可 确定λmax=510nm。 2.2 标准曲线 从图3中我们可以发现，葡萄糖含量（mg·mL-1） 与相应的吸光度（A）有一定的线性关系，且其回归 图2 不同浓度糖显色液的吸收光谱 ·267·3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定马铃薯还原糖含量的研究———朱海霞，石 瑛，张庆娜，等 ×100还原糖含量= 方程为：y=0.1795x-0.0971，R=0.9996。 2.3 显色剂用量 为了确保显色完全进行，笔者选择最高浓度的 葡萄糖标准液进行显色剂用量试验。由图4可知， 吸光度随着显色剂用量的增加而增加，6～7mL趋 于稳定，所以确定DNS的最佳用量是6mL。 2.4 显色时间 由图5可以看出，还原糖含量不同的3个葡萄 糖标准液在沸水浴中 12min后，显色基本完全， 吸光度趋于稳定一致，因此本试验确定的最佳沸水 浴显色时间范围是12～15min。 2.5 显色液放置时间 图6说明，无论是标准液的显色液还是马铃薯 样品的显色液在显色之后的6h内，其吸光度逐渐 减小，可根据对还原糖含量精确度的要求选择测定 时间，即精确度要求高应及早测定，若进行大批量 样品的还原糖筛选，则可将显色液样品集中测定以 提高工作效率。 2.6 样品DNS显色液吸光度曲线 把不同马铃薯样品的 DNS吸光度绘成图 7。 对照图2可见，马铃薯样品的吸光度曲线与葡萄糖 标准液的吸光度曲线相一致，不同的浓度可形成梯 度间隔曲线，没有其它吸收峰，这表明马铃薯还原 糖含量完全可采用DNS比色法测定。 2.7 不同波长下的马铃薯还原糖含量 表1列出了不同块茎样品在510nm和540nm 波长下测定的还原糖含量（干基）。其中Χ为两波 长下测得结果的差值，Χ2为两波长下测得结果的 差值的平方。 通过对表中数据进行计算，获得的结果可以看 图3 葡萄糖标准曲线 图4 不同显色剂用量的吸光度变化及趋势 图5 沸水浴显色时间的吸光度变化及趋势 图7 不同浓度的马铃薯样品DNS吸光度曲线 图6 显色液放置时间与吸光度关系及趋势 ·268· 中国马铃薯，第19卷，第5期，2005 S=0.7299，Sx=0.2107，|t|=5.408，t0.01,11=3.106 出，由于|t|=5.408>t0.01,11，说明在510nm和540nm两 个波长下所测的马铃薯还原糖含量存在极显著差异。 3 讨 论 应用3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量， 对最佳吸收光谱的确定，不同的作物就有不同的选 择。罗志刚等[5]在烟草还原糖测定中确定的λmax=474 nm，齐香君等[6]在细菌纤维素发酵的还原糖测定中确 定的λmax=483nm，范玲等[7]在棉花还原糖测定中确定 的λmax=510nm，这些均与一般方法[3]中的λmax=540nm 有所不同。这可能由于最佳波长的确定受到仪器性 能、灵敏度、试验对象中还原糖含量、可溶性物质种 类及DNS用量等因素的影响，因此我们应根据自己 的试验对象和仪器设备来确定试验所需的最佳条件。 通过对应用3,5-二硝基水杨酸比色法测定马铃 薯还原糖含量的影响因素，如吸收光谱、显色剂用 量及显色时间等条件进行试验筛选，确定马铃薯块 茎还原糖含量测定的最佳波长为510nm，DNS用 量为 6mL，沸水浴时间 12～15min。这与 540nm 下测定的还原糖含量存在极显著差异。方便快捷、 安全、准确、低成本DNS比色法，适合于马铃薯 块茎还原糖含量的批量和定量测定。 [ 参 考 文 献 ] [1] 王春英，陈伊里，石 瑛.影响马铃薯油炸品质的研究进展 [J].中国马铃薯，2003,4:232-236. [2] 梅文泉，隋启君，佴注，等.马铃薯块茎中还原糖测定的一 种方法 [J].云南农业科技，2003,3:23-24. [3]宇正祥.食品分析手册[M].北京:中国轻工业出版社，1998. [4] 许庆芬，吕文河，石瑛，等.马铃薯块茎还原糖的测定方法 的比较 [J].中国马铃薯，2004,6:337-33. [5]罗志刚，曾满枝，凌晨，等.3,5-二硝基水杨酸比色法测定烟 草中水溶性总糖.中国烟草科学，2000,2:34-36. [6]齐香君，苟金霞，韩戌 ，等.3,5-二硝基水杨酸比色法测定 溶液中还原糖的研究.纤维素科学与技术，2004,3:17-20. [7]范玲，闫建庆，郑春霞，等.3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法 在分析棉花纤维还原糖含量中的应用研究 [J].棉花学报， 1996,3:151-154. 表1 不同波长下测得的还原糖含量 样 品 510nm 540nm X X2 YP1 2.46 2.879 -0.419 0.176 YP2 4.527 5.5.32 -1.005 1.02 YP3 3.905 4.582 -0.677 0.458 YP4 6.746 8.149 -1.403 1.968 YP5 1.287 1.863 -0.576 0.331 YP6 1.745 3.039 -1.294 1.674 YP7 3.207 5.028 -1.821 3.316 YP8 3.572 4.582 -1.01 1.02 YP9 4.827 6.103 -1.276 1.628 YP10 1.533 2.005 -0.472 0.223 YP11 6.523 9.541 -3.018 9.108 YP12 2.214 2.897 -0.683 0.466 ∑ 42.546 56.2 -13.65 21.388 Applying3,5-dinitrosalicylicAcid(DNS)Methodto AnalyzingtheContentofPotatoReducingSugar ZHUHai-xia，SHIYing，ZHANGQing-na，CHENYi-li (NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,Heilongjiang,China) Abstract：3,5-dinitrosalicylicacid(DNS)methodwasusedtoanalyzethecontentofreducingsugarbyus- ingspectrophotometry,andthewave-lengthandsomerelevantfactorswereresearchedinanalyzingthecontentof potatoreducingsugarwithDNSmethod.Thebestconditionsforanalyzingthecontentofpotatoreducingsugar hadbeenestablished.Thesewere:wave-length:510nm;DNSsolution:6mL;anddurationforcolordevelopment inwaterbath:12～15min.Thesensitivityofthemethodhadbeenimproved.Theexperimenthadconfirmedthat theimprovedDNSmethodwassimple,safeandeasytoconduct.Themethodcanbeusedincommonlaboratories forquantitativeanalysis. KeyWords:potato;reducingsugar;spectrophotometry;3,5-dinitrosalicylicacid ·269·3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定马铃薯还原糖含量的研究———朱海霞，石 瑛，张庆娜，等 环君