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Lowry’s法(Folin-酚试剂法).ppt

Lowry’s法(Folin-酚试剂法)

tianbo614
2013-04-12 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《Lowry’s法(Folin-酚试剂法)ppt》,可适用于高等教育领域

Lowry’s法(Folin酚试剂法)测定蛋白质含量Lowry’s法(Folin酚试剂法)测定蛋白质含量DeterminationofproteincontentbyLowry‘smethod怎样测定血清中蛋白质的含量怎样测定血清中蛋白质的含量蛋白质含量测定的常用方法比较蛋白质含量测定的常用方法比较选择测定方法时应考虑选择测定方法时应考虑、实验对测定所要求的灵敏度和精确度、蛋白质的性质、溶液中存在的干扰物质、测定所花费的时间等。Lowry’s法(Folin酚试剂法)测定蛋白质含量Lowry’s法(Folin酚试剂法)测定蛋白质含量DeterminationofproteincontentbyLowry‘smethod实验目的实验目的、掌握Folin酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其实验操作技术。、掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。原理原理年Folin首创利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基(酚基)还原酚试剂(磷钨酸磷钼酸)起蓝色反应。年Lowry对此法进行了改进先于标本中加碱性铜试剂再与酚试剂反应提高了灵敏度。原理原理第一步:双缩脲反应在碱性溶液中,双缩脲(HNOC-NH-CONH)能与Cu作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键,因此有双缩脲反应。即在碱性溶液中蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu作用生成紫红色的蛋白质Cu复合物。原理原理第二步:Folin酚显色反应Folin酚试剂在碱性条件下极不稳定其磷钼酸盐磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混合物)。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸(Tyr)故有此显色反应。即蛋白质Cu复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸生成蓝色的化合物。原理原理在一定浓度范围内蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。样品样品健康人血清试剂试剂、牛血清白蛋白标准液(μgml)、碱性硫酸铜溶液(当日有效)、Folin酚试剂仪器和器材仪器和器材、V分光光度计、恒温水浴箱、试管支、试管架、加样枪、加样枪架、坐标纸操作操作各管混匀室温放置min。向各管内加入Folin酚试剂mL,s内迅速混匀!℃放置min。冷却至室温后以nm波长比色用号管作空白读取各管吸光度。注意事项注意事项Folin酚试剂在酸性条件下较稳定而碱性硫酸铜试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜蛋白质溶液。故当Folin酚试剂加到碱性的铜蛋白质溶液中后必须立即混匀(加一管混匀一管)使还原反应发生在磷钼酸磷钨酸试剂被破坏之前。注意事项注意事项因Lowry反应的显色随时间不断加深因此各项操作必须精确控制时间。即第支试管加入mL碱性硫酸铜试剂后开始计时分钟后第支试管加入mL碱性硫酸铜试剂分钟后加第支试管以此类推。全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到分钟则第支试管可立即加入mLFolin酚试剂分钟后第支试管加入mLFolin酚试剂分钟后加第支试管以此类推。水浴min冷却后每一分钟测一管。蛋白样品碱性铜试剂混匀放min加酚试剂s混匀水浴min放至室温比色数据处理数据处理绘制标准曲线步骤绘制标准曲线步骤、选择合适的坐标纸、画坐标轴、根据测得的数据描点、连线、求实验结果绘制标准曲线绘制标准曲线以A值为纵坐标牛血清白蛋白标准液浓度为横坐标绘制标准曲线。绘制标准曲线绘制标准曲线根据所描点的分布情况作直线或光滑连续的曲线该线表示实验点的平均变动情况因此该线不需全部通过各点但应尽量使未经过线上的实验点均匀分布在曲线或直线两侧。计算计算根据未知样品溶液的吸光度值在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。然后乘以稀释倍数()得出每毫升未稀释血清含蛋白质的微克数即每毫升血清中蛋白质的微克数(μgml)。血清蛋白浓度(μgml)=样品蛋白质浓度××本方法的特点:本方法的特点:优点:灵敏度高比双缩脲法灵敏约倍。操作简单不需特殊仪器设备。缺点:费时间较长要精确控制操作时间标准曲线也不是严格的直线形式专一性较差干扰物质较多。复习思考题复习思考题、试述Folin酚试剂法的优点?、应用本方法有哪些干扰作用?为什么?应如何注意?请将答案附在实验报告上!V分光光度计操作步骤V分光光度计操作步骤开机预热分钟转动波长旋钮调所需波长。按键切换到T档将黑体放入光路中合上盖按键校零开盖将参比液按空白液、标准液、待测液顺序放入比色杯架上合上盖按键切换到A档拉动比色架拉杆将空白液放入光路中合上盖按键校零拉动拉杆将标准、待测液依次放入光路中即可读取其吸光度A读数后将黑体放入光路中开盖取出比色杯将参比液倒回原试管中清洗比色杯并晾干关机盖上防尘盖登记仪器使用登记本。MODEMODE

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