棉花黄萎病拮抗细菌的筛选与抗菌物分析

收稿日期: 2006�11�29 � � 作者简介:袁洪水( 1963�) , 男,副教授; * 通讯作者: zhu2222@ 126. com 基金项目:河北省自然科学基金项目( 398152) 棉花黄萎病拮抗细菌的筛选与抗菌物分析 袁洪水1 , 马 � 平2 , 李术娜1 , 胡 � 明1 , 朱宝成1* ( 1.河北农业大学 生命科学学院,保定 071001; 2.河北省农林科学院 植物保护研究所,保定 071000) 摘要:对 21株芽孢杆菌属细菌分别进行了摇瓶震荡培养,其发酵液上清液用硫酸铵盐析,杯碟 法测定了沉淀物对大丽轮枝菌( Vert i cil l ium dahl iae Kleb. )的拮抗活性, 并对其中 6 株具有 较强抑菌活性菌株的抗菌物进行了蛋白酶稳定性、热稳定性等分析。结果显示, BDT�25、JJ� 5、DHT�12、80b�2、DH T�13和 JJ�134菌株的抑菌活性较高; 6株拮抗细菌发酵液沉淀物均对 氯仿敏感, 抗菌物溶液经蛋白酶 K、胰蛋白酶和胃蛋白酶处理后活性丧失或显著下降, 对温度 也较敏感, 认为这些抗菌物质为蛋白或多肽类物质。拮抗菌株产生的抗菌蛋白通过抑制大丽 轮枝菌孢子萌发和使菌丝体原生质凝集而抑制其生长。 关键词:棉花黄萎病;大丽轮枝菌; 拮抗细菌; 筛选 中图分类号: S435. 621 � � � 文献标识码: A 文章编号: 1002�7807( 2007) 06�0436�04 Screening of Antagonistic Bacteria Against Verticillium dahliae and Charac� teristic Analyses of Antagonistic Substance YUAN H ong�shui1 , MA Ping2 , L I Shu�na1 , HU M ing 1 , ZHU Bao�cheng1 (1. Col lege of L if e S cience, A gr icul tur al Univer si ty of H ebei , B aoding 071001, China; 2. I nsti tute of P lants P rotect ion, H ebei A cademy of A gr icul tur al and Foresty S ciences, B aoding 071000, Chi� na) Abstract: T he Baci llus has w ide ant im icrobial spectr um, w hich has intensiv e inhibito ry act ivity a� gainst bacteria o r fungus caused diseases, thus confer them high potent ial biolog ical contr ol v alue. In this paper , the 21 Baci llus str ains w ere fermented in shaking , respect iv ely , the ext racellulary meta� bolic product w er e precipitated by ( NH 4 ) 2SO 4 salt ing out . The ant ifungal act ivity o f the ex t racted substance w ere determ ined through cy linder plate method against Ver ti ci l lium dahl iae K leb. T he re� sult show ed that six st rains had big ger inhibit ion zone and had ev ident antagonist ic act ivity . So these st rains w ere selected to be further tested. Selected six st rains w hich had highs antagonistic act iv ity, their antag onist ic substances character ist ic, such as stability to chloro form, pr oteinase K, t rypsin, pepsin and heat w ere analyzed. It w as indicated that all the substance w ere sensitive to chloroform, there had no inhibit ion zone appearance. Key words: cot ton Ver t ici l lium w ilt ; Ver ti ci ll ium dahl iae ; antagonist ic bacterium; screen � � 由大丽轮枝菌引起的黄萎病是棉花的主要病 害,对棉花产量和品质均造成极大影响 [ 1�2]。对于 棉花黄萎病的防治国内外在抗病育种、农业措施 和化学防治等方面均做了大量工作, 目前生物防 治被认为是最具有发展潜力的有效防治方法之 一。筛选大丽轮枝菌的拮抗细菌用于生物防治, 或从拮抗菌中分离抗菌蛋白, 克隆抗病基因,是获 得抗病植株的有效手段,而获得高拮抗活性的菌 株是生物防治的基础。 芽孢杆菌具有较广的抗菌谱, 对多种病原菌 � 棉 花 学 报 � Co tton Science � � 2007, 19( 6) : 436~ 439 的生长均有抑制作用, 具有较高的潜在生防利用 价值。拮抗细菌通过产生肽类、磷脂类、多烯类和 氨基酸等抗菌物质, 达到抑制病原菌生长的作用。 尤其是肽类抗菌物的发现,为抗病基因工程提供 了新的生物资源和抗病基因, 是一具有极大应用 潜力的微生物类群[ 3] 。 本文报道了从实验室保存的 21 株芽孢杆菌 中,筛选出了 6株能分泌高活性抗菌物质、对棉花 黄萎病有较强拮抗作用的菌株, 并研究了其胞外 抗菌物质的部分特性。 1 � 材料与方法 1. 1 � 材料 1. 1. 1 � 供试菌株。大丽轮枝菌 ( Vert icil l ium dahl iae Kleb. ) , V�190 菌株。芽孢杆菌属( Ba� cil lus spp. ) 拮抗细菌: 菌株 BDT�25、BNT�26、 CJT�2、DHT�12、DHT�13、DHT�16、DHT�27、 DMT�3、HNT�2�113、JJ�5、JJ�102、JJ�134、LBT� 261、LBT�330、N CD�2、NZT�2�7、NZT�3�89、 NZT�50、SP�8�2、70A�7、80b�2,共 21株。供试菌 株均由河北省农林科学院植物保护研究所植病生 防实验室保存。 1. 1. 2 � 培养基。LB琼脂培养基, 用于拮抗细菌 平板培养与斜面保存; NB液体培养基, 用于拮抗 细菌液体发酵; PDA 培养基, 用于大丽轮枝菌培 养和拮抗菌活性测定 [ 5]。 1. 1. 3 � 试剂。蛋白酶 K、胰蛋白酶、胃蛋白酶,均 为 AMRESCO 公司产品。 1. 2 � 实验方法 1. 2. 1 � 拮抗菌株抗菌物的制备。将实验室保存 的拮抗细菌分别接种在 LB 琼脂培养基平板上, 30 � 培养 48 h。挑取单菌落接种于装有 50 mL� NB 培养液的 250 mL 三角瓶中, 28 � 、170 r min�1摇床振荡培养 48 h [ 3]。发酵液离心 20 min ( 6000 r min�1 ) , 取上清液, 加入固体硫酸铵至 85%饱和度, 4 � 下静置 8 h 后, 离心 20 min ( 10000 r min�1 , 4 � )。沉淀物用 pH 7. 2磷酸 盐缓冲液溶解, 相同磷酸盐缓冲液透析( 8000 D) 2 d,冷冻干燥,置于�75 � 冰箱保存。用磷酸盐缓 冲液溶解, 经 0. 22 �m 微孔滤膜过滤, 制成 3 g L �1抗菌物溶液,用于拮抗活性测定 [ 3]。 1. 2. 2 � 抗菌物的抑菌活性测定。将大丽轮枝菌 在PDA 平板上25 � 培养 7- 10 d,在菌落边缘区 域刮取孢子, 接种于盛有 100 mLPDA 液体培养 基的三角瓶中, 25 � 、150 r min�1条件下振荡培 养 7 d。用无菌纱布过滤并稀释制得含 108 个孢 子 mL�1的悬浮液。 取 2 mL 孢子悬液加入 100 mL 融化后冷却 至 45 � 左右的 PDA 培养基中, 倒平板, 于 25 � 培养过夜,制成病原菌平板。然后在平板上均匀 放置无菌环柱(外径 6. 0 mm,内径 5. 0 mm,高 10 mm ) , 分别在每个环柱内注入抗菌物溶液 100 �L, 每种抗菌物做 3个重复, 以无菌磷酸盐缓冲 液为对照, 25 � 培养 3 d,观察大丽轮枝菌的生长 情况,并测定抑菌圈直径。 1. 2. 3 � 抗菌物的稳定性测定。1)对氯仿的稳定 性。抗菌物用 pH 7. 2磷酸盐缓冲液溶解, 浓度 为 3 g L�1 , 与等量氯仿混合振荡处理 60 m in,离 心,取上层水相, 待残留氯仿挥发尽后, 以不处理 的抗菌物溶液作对照,测定抑菌活性[ 6]。2) 对蛋 白酶的稳定性。抗菌物用 pH 7. 2磷酸盐缓冲液 溶解,浓度为 6 g L�1 ,分别加入等体积浓度为 1 g L�1的蛋白酶 K、胰蛋白酶、胃蛋白酶,摇匀,使 酶终浓度为 0. 5 g L�1 ,抗菌物浓度为 3 g L�1 , 在37 � 下处理 2 h。以不加酶处理的抗菌物溶液 为对照,测定抑菌活性 [ 7]。3)对热的稳定性。浓 度为 3 g L�1的抗菌物溶液,分别在 40 � 、60 � 、 80 � 、100 � 、120 � 下处理 20 m in。以未经热处 理的样品为对照,测定抑菌活性[ 8]。 1. 2. 4 � 抗菌蛋白抑菌机理。1)孢子萌发试验。 制备大丽轮枝菌孢子悬液, 取 10 �L 孢子悬液与 10 �L BDT�25菌株抗菌蛋白( 0. 6 g L�1 )混合, 用凹玻片悬滴法培养, 定时镜检,无菌水作对照。 2)对菌丝生长的作用。制备大丽轮枝菌孢子悬 液,液体培养至孢子萌发, 取 10 �L 菌丝悬液与 10 �L BDT�25菌株抗菌蛋白( 0. 6 g L�1 )混合, 以凹玻片悬滴法置于纱布保湿的培养皿中培养, 定时镜检,无菌水作对照。 2 � 结果与分析 2. 1 � 棉花黄萎病拮抗菌株的筛选 对 21株拮抗细菌进行液体发酵,用硫酸铵沉 淀发酵液中的抗菌物质,通过平板对峙法测定抗 菌物的抑菌活性, 结果有 9株拮抗细菌出现了透 明抑菌圈(图 1,表 1) , 说明其抑制大丽轮枝菌孢 子萌发和菌丝体生长。其中菌株 BDT�25、JJ�5、 DHT�12、80b�2、DHT�13、JJ�134拮抗作用明显, 作为进一步研究对象。 4376 期 � � � � � � � � � � � � 袁洪水等:棉花黄萎病拮抗细菌的筛选与抗菌物分析 图 1 � 部分拮抗菌株的抑菌效果 Fig. 1� The antifungal effect of the antagonistic bacterium strains 表 1� 拮抗菌株发酵液抗菌物抑菌活性测定 Table 1 � The antifungal activity of the antagonistic substance from the antagonistic bacteria strains 菌株 抑菌圈平均直径/ mm CK 0 BDT�25 18. 38 JJ�5 16. 88 DHT�12 14. 75 80b�2 14. 75 DHT�13 14. 25 JJ�134 12. 50 LBT�330 10. 25 JJ�102 10. 25 SP�8�2 7. 50 注:抑菌圈直径等于无菌环柱外径 6. 0 mm 时, 记为 0。 2. 2 � 抗菌物的性质分析 2. 2. 1 � 抗菌物对氯仿的稳定性。抗菌物经氯仿 处理后测定抑菌活性(表 2)。所有抗菌物经氯仿 处理后均没有抑菌圈出现, 说明抗菌物对氯仿 敏感。 2. 2. 2 � 抗菌物对蛋白酶的稳定性。抗菌物经蛋 白酶处理后测定抑菌活性(表 2)。BDT�25菌株 抗菌物溶液对 3种蛋白酶都较敏感, 处理后活性 完全丧失; JJ�5 菌株抗菌物对胃蛋白酶敏感、 DHT�12、DHT�13和 JJ�134 菌株抗菌物对胰蛋 白酶敏感,经酶处理后活性丧失;其它经蛋白酶处 理后活性明显下降, 但仍保留了部分活性。 2. 2. 3 � 抗菌物的热稳定性。抗菌物溶液经加热 处理后测定抑菌活性 (表 3)。BDT�25 菌株在 40 � 处理后仅保留部分抗菌活性, 60 � 以上温度 处理后活性完全丧失; 除 JJ�5 菌株外, 其余菌株 120 � 处理后活性全部丧失; 100 � 处理后还保留 部分活性的有 JJ�5、DH T�12和 DHT�13菌株;能 耐受 80 � 处理保留部分活性的还有 80b�2、JJ�134 菌株; 说明 BDT�25 菌株抗菌物对热不稳定, 而 JJ�5菌株的抗菌物对热处理的稳定性较强。 表 2 � 抗菌物经氯仿和蛋白酶处理后的抑菌活性 Table 2� The antifungal activity of the treated antagonistic substance by chloroform and proteinase 菌株 抑菌圈平均直径/ mm CK 氯仿 蛋白酶 K 胰蛋白酶 胃蛋白酶 BDT�25 19. 30 0 0 0 0 JJ�5 17. 00 0 6. 21 7. 01 0 DH T�12 15. 33 0 10. 00 0 11. 00 DH T�13 15. 01 0 6. 51 0 12. 51 JJ�134 13. 10 0 8. 16 0 12. 50 80b�2 15. 65 0 9. 00 7. 04 7. 98 表 3� 抗菌物经热处理后的抑菌活性 Table 3� The antifungal activity of the treated antagonistic substance by high temperature 菌株 抑菌圈平均直径 / mm CK 40 � 60 � 80 � 100 � 120 � BDT�25 19. 25 8. 25 0 0 0 0 JJ�5 16. 50 12. 75 9. 50 8. 50 7. 46 7. 25 80b�2 15. 50 13. 25 8. 25 6. 50 0 0 DH T�12 15. 25 9. 50 9. 75 9. 50 7. 45 0 DH T�13 14. 00 13. 25 11. 25 11. 25 7. 57 0 JJ�134 12. 75 11. 50 11. 00 10. 25 0 0 � � 经上述实验, 拮抗菌株, 尤其是 BDT�25, 发 酵液硫酸铵沉淀产物均对氯仿敏感,经蛋白酶 K、 胰蛋白酶和胃蛋白酶处理后活性丧失或显著下 降,对温度敏感,认为这些抗菌物为蛋白或多肽类 438 � � � � � � � � � � � � � � � � � � 棉 � 花 � 学 � 报 � � � � � � � � � � � � � � � � � 19 卷 物质。 2. 3 � 抗菌蛋白的抗菌机理 2. 3. 1 � 抗菌蛋白对大丽轮枝菌孢子萌发的影响。 抗菌蛋白处理大丽轮枝菌 3 d后,在显微镜下观 察,发现大多数孢子萌发被抑制,少数孢子的发芽 点细胞变大,有圆状泡状物形成;但 4 d后孢子长 出的幼嫩菌丝溶解, 泡状物消融、崩解。 2. 3. 2 � 抗菌蛋白对大丽轮枝菌菌丝生长的抑制 作用。在显微镜下观察, 处理 3 d后大丽轮枝菌 菌丝顶端及中部膨大, 透明度降低, 原生质凝集, 泡状物增多, 膨大物增大; 4 d后, 菌丝顶端及中 部泡状物破裂, 菌丝体凝集后出现溶解,细胞质外 溢。此时,固体对峙培养的培养基上出现了透明 抑菌圈。8 d后在抑菌圈周围部分菌丝出现微菌 核,并且随时间的延长微菌核的范围逐渐扩大。 3 � 讨论 自从 1952 年 Babad 等人从枯草芽孢杆菌培 养液中分离出抗菌肽以来,相继分离出了多种抗 菌肽[ 9] ,在植物病害的生物防治上显现出很大的 应用前途[ 10] 。 本研究中对抗菌物的制备是按照蛋白质的主 要特性进行的, 分离供试芽孢杆菌的发酵液, 其中 6个菌株的硫酸铵盐析物对 V. dahl iae Kleb.有 较强的拮抗作用。对抗菌物进行氯仿稳定性、蛋 白酶稳定性、热稳定性的试验分析,结果抗菌物对 氯仿敏感,经蛋白酶 K、胰蛋白酶和胃蛋白酶都处 理后活性丧失或显著下降,对温度也较为敏感,证 明这些抗菌物是蛋白或肽类可能性极大。而其余 菌株的发酵液粗提物无抑菌活性, 原因可能是所 产抗菌物质为非蛋白类物质, 或性质不稳定而在 处理过程中失活,或是蛋白浓度过低未表现出来, 也可能其拮抗作用是因营养竞争造成的。 对抗菌物质抗菌机理的研究表明,抗菌蛋白 具有抑制孢子萌发和溶解菌丝体使原生质外溢作 用,从而抑制大丽轮枝菌生长,因此可以作为生防 制剂用于防治棉花黄萎病。另外, 为从拮抗菌中 纯化其抗菌蛋白,克隆出抗病基因,进一步构建基 因工程菌株或获得转基因植物奠定了基础。 参考文献: [ 1] 徐 � 显. 棉花抗黄萎病育种研究现状及对策[ J] . 河 北农业科学, 2004, 8 ( 2) : 95�97. [ 2] 李社增, 马 � 平, 刘杏忠, 等. 利用拮抗细菌防治棉 花黄萎病 [ J] . 华中农业大学学报, 2001, 5 ( 10) : 422�425. [ 3] 李术娜, 杜红方, 袁洪水, 等. 棉花黄萎病拮抗细菌 LC�04 菌株的抗菌蛋白产生条件研究[ J] . 棉花学报, 2006, 18 ( 4) : 233�237. [ 4] 周艳芬, 杜红方, 袁洪水, 等. 棉花黄萎病拮抗蛋白 的分离与纯化[ J] . 棉花学报, 2007, 19( 2) : 98�101. [ 5] 赵 � 斌, 何绍江. 微生物学实验 [ M ] . 北京: 科学出 版社, 2002. [ 6] 沈锦玉, 尹文林, 曹 � 铮, 等. 枯草芽孢杆菌 B115 抗 菌蛋白的分离纯化及部分性质[ J] . 水生生物学报, 2005, 29( 6) : 689�693. [ 7] 齐东梅, 梁启美, 惠 � 明, 等. 棉花枯萎、黄萎病拮抗 芽孢杆菌的抗菌蛋白特性[ J] . 微生物学通报, 2005, 32 ( 4) : 42�46. [ 8] 何青芳, 陈卫良, 马志超. 枯草芽孢杆菌 A30 菌株产 生的拮抗肽的分离纯化与理化性质研究[ J] . 中国水 稻科学, 2002, 16 ( 4) : 361�365. [ 9] KAJIMU RA Y, Sug iyama M , Kaneda M . Bacillope� tins, new cyclic lipopetide ant ibiotics from Bacillus subtillis FR�2[ J] . J Antibiotics , 1995 , 48( 10) : 1095�1103. [ 10] EMM ERT E A B, H andelsman J. Biocontr ol o f plant disease: a ( G ram�) posit ive per spectiv e [ J ] . FEMS Micr obiol Lett ers, 1999, 171: 1�9. � � ! 4396 期 � � � � � � � � � � � � 袁洪水等:棉花黄萎病拮抗细菌的筛选与抗菌物分析