Mg缺失对玉米幼苗发育及生理特性的影响-李淼

缺Mg胁迫对玉米幼苗发育及生理特性的影响 学生：李淼  班级：生科一班 学号：09352044 摘 要：本次实验利用完全元素和缺Mg元素培养液共同培养，观察了玉米幼苗缺Mg时的外部症状，测定了植物抗逆性，叶绿素含量，组织中糖的含量，根系活力以及代谢活性。结果表明：缺Mg植株老叶发黄失绿、有黄斑，叶尖端干枯、根系不发达，植物抗逆性弱，糖含量低，光合作用能力低，叶绿素含量显著降低。根系活力和代谢活性均很弱。 关键词：缺Mg培养；玉米；生理指标 玉米是我国北方主要栽培作物之一，在当前市场经济迅速发展的过程中，玉米是改善人民生活出口外贸重要的物质之一，对发展农业、畜牧业具有十分重要的意义[1]。 关于玉米一生各时期所需要的营养和缺素症状已有大量的报导，但多偏重于地上叶器官形态的研究，关于缺素造成生理上，内部结构的变化则报道的较少。我们知道，Mg是构成叶绿素的必需元素，而现有文献少有专一的细致的研究缺Mg对玉米幼苗生长的影响，因此本试验以玉米幼苗为试材探讨缺Mg对其生长发育及生理特性的影响。为玉米的营养诊断与合理施肥提供一些理论依据。 1 材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1.1 材料： 中山大学植物生理实验室提供玉米（Zea mays L）幼苗。 1.2 玉米苗培养    先将幼苗种于塑料钵中，在温室中进行溶液培养，分为完全营养液和缺Mg营养液两组，待幼苗生长至18~25cm时进行室内实验测定。设置缺Mg、完全的两个处理，每组处理为4株玉米幼苗。处理开始后，每隔1~2d通气一次，每隔 7d换 1次营养液。培养结束后，取出植株。进行室内生理各种生化指标测定。 1.3 光合作用测定 我们采用“LCi 便携式光合仪测定法”进行测定完全和缺素的两组玉米苗。Lci便携式光合仪是世界上最小巧、轻便的便携式光合作用测定仪，用以测量植物叶片的光合速率、蒸腾速率、气孔导度等与植物光合作用相关的参数。 Lci光合仪应用红外气体 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 原理，根据精密测量叶片表面CO2浓度及水分的变化情况来考察叶片与植物光合作用相关的参数。 在实验前选取两株完全培养和缺Mg培养植株在光照下放置30分钟，以保证实验结果的准确性。 1.4 电导率的测定 植物细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要的作用。在正常情况下，细胞膜对物质具有选择透性能力。当植物受到逆境影响时，如高温或低温，干旱、盐渍、病原菌侵染后，细胞膜遭到破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，以致植物细胞浸提液的电导率增大。膜透性增大的程度与逆境胁迫强度有关，也与植物抗逆性的强弱有关。 制备叶片浸出液以后，室温下使用电导率仪测定溶液电导率为初始电导率(S1)，煮沸后冷却再测量为终点电导率（S2）。 则相对电导率（SR）=S1/S2×100 1.5 根系活力的测定（TCC法） 氯化三苯基氮唑（TTC）溶于水中成为无色溶液，还原后即生成红色不溶于水的三苯甲暨（TTF） TTC的还原量能表示脱氢酶活性，作为根系活力的指标。本实验我们采用比色法，对照组和实验组同时实验，同时拍照并分析。 1.6 叶绿素总量的测定 叶绿素（a和b）在叶绿素（a和b）在碱的作用下能被皂化，而达到与类胡萝卜素分离。皂化叶绿素的颜色与原来叶绿素几乎相同，其颜色的深浅与含量成正比，所以，把皂 化叶绿素溶液与已知浓度的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 溶液进行比色测定，通过计算即可测得叶绿素含量。 1.7 过氧化物酶活性的测定 过氧化物酶(POD)是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 在H2O2存在条件下，过氧化物酶(POP)能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲基苯酚，该物质在470nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测量470nm 的吸光度变化测定过氧化物酶(POD)活性。 1.8 可溶性蛋白质含量的测定及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 使用考马斯亮蓝G-250与蛋白质产生颜色反应，在一定范围内，蛋白质含量与颜色的深浅成正比，可以比色法测定。 制作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳提取的叶片蛋白质，根据Marker的条带和颜色深浅分析结果。 1.9 可溶性糖含量的影响 可溶性糖在强酸、高温的条件下发生分子内的脱水作用，生成糠醛或羟甲基糠醛，糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮作用形成一种蓝绿色的糠醛络合物，在一定范围内，其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比关系，故可用比色法测定。 1.10 硝态氮含量的测定（比色法） 本实验的原理是硝酸根还原成亚硝酸根后，与对氨基苯黄酸及-萘胺结合，生成玫瑰红色的偶氮化合物，生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，其颜色深浅与硝态氮含量在一定范围内成正比关系，故可用比色法进行测定。 2 结果与分析 2.1 玉米苗培养 在培养了植株4周后，我们对植株进行了拍照（图1和图2）。明显观察到缺Mg培养的玉米苗老叶发黄，叶片枯焦。但完全培养组的叶片也有个别干枯，我们认为是水分不足引起的。由于植物缺Mg以后是老叶症状比较明显，所以我们把各植株的叶子从上到下排序，一片片摘下分装并-80℃保存，以保证新鲜。每次取用材料尽量从第7叶开始倒数取用。对照组（完全培养）和实验组（缺Mg培养）每次实验均取用相同编号的叶片。 图1 完全营养液培养 图2 缺Mg培养液培养 Mg是可移动元素，植物缺Mg时症状首先在老叶中表现。Schimansky用放射性同位素28Mg对菜豆、大麦进行放射性离子示踪实验，证明Mg可以通过韧皮部进行运输，老叶里的Mg素可以移动至新叶中[2]。植物缺Mg最明显的外观症状就是缺镁失绿症，一般缺Mg植物老叶脉间黄化，严重者整片叶片发黄，并且较不缺镁的老叶提前衰老干枯。较多研究者在不同种类的植物中进行了缺Mg的研究，如禾谷类、甘蔗、桑树、甜菜、龙眼等[3]。研究发现缺镁首先导致植物中下部分叶脉间色泽变淡，由淡变黄再变褐，严重时叶片枯萎脱落，幼嫩组织发育也受阻，从而导致植物长势衰弱，产量明显下降。 2.2 光合作用测定 完全培养叶片： 光合作用效率（A）=8~9μmol（CO2）·m-2·s-1 蒸腾作用效率（E）=5.2μmol（H2O）·m-2·s-1 缺Mg培养叶片：光合作用效率（A）=12.71μmol（CO2）·m-2·s-1 蒸腾作用效率（E）=4.9μmol（H2O）·m-2·s-1 根据数据我们看出，完全培养的植株光合作用速率小于缺Mg培养的植株，蒸腾作用效率略大于缺Mg培养的植株。说明完全培养的植株生长状态比缺Mg培养的植株没有显著优势。这和我们的理论知识相悖。 我们知道Mg是叶绿素的重要组成部分，经过查阅资料，知道缺Mg植物的叶绿素含量会降低，虽然尚未有定论叶绿素的降低是由于Mg不足所致，但在缺Mg胁迫下的植株由于叶脉枯焦，理应光和效率不如全素培养植株。 结果原因： 1、光合作用是多因素作用的结果，例如水、CO2、光质等等。我们无法确定完全培养的植株处于无胁迫状态，而缺Mg植株处于单一因素的胁迫。 单一叶片的少次数测定为结果增加了不确定性。我们多测几次取平均值，或者应在利用光合仪测定完毕后立即进行叶绿素总量的测定，但是课程设置不能满足此条件。 3、实验的时候有影响因素，如有风、有阳光等都会导致数据不准确。 2.3 电导率的测定 结果：1、本实验中水的电导率为3.3μs，作为校正值。 2、S1为25℃所测，缺镁叶片浸出液电导率大于全素叶片浸出液。 3、S2为95℃所测，缺镁叶片浸出液电导率大于全素叶片浸出液。 4、加热后，两组叶片浸出液的电导率都显著增大，说明高温可以破坏细胞质膜的结构，增加通透性。 电导法测定的是缺素对植物叶片细胞原生质膜结构的影响。如果电导率增大，则说明原生质膜的结构遭到破坏，膜透性增大，细胞质内电解质外溢。缺Mg叶片的细胞质膜显著增大，说明Mg和质膜结构的维持有一定关系。缺Mg胁迫降低了卡尔文循环的效率，减少了NADPH的利用率，并且导致了光合作用的电子传递系统的过渡饱和，过剩的激发能产生较多电子，传递至O2后产生O2·-和其他的活性氧，活性氧有很强的氧化能力，可引起质膜的过氧化作用，从而破坏膜的结构和功能[4]。另外，缺镁胁迫在植物抵御有害因子对膜的损害、保证光合膜的正常功能等方面同样有不利影响。 2.4 根系活力的测定（TCC法） 本实验我们采用比色法。拍照如下： 左图为缺Mg培养的植物根系，右图为全素培养的植物根系。从根部生长来看，全素的根部生长更茂盛。从TTC比色来看，全素的要稍红一些。这说明Mg在维持根系活力具有一定作用。文献中记载，低镁和缺镁培养条件下，玉米幼苗根长降低了10.02%和14.24%，TTC法吸光度检测出低镁和缺镁条件下，根系活力分别较对照降低了27.04%和41.23%[5]，以上说明缺镁胁迫抑制了玉米幼苗的生长。 本实验中肉眼比色法不准确，特别是像此次实验结果不好分辨的情况下。因为根系活力不仅仅由于Mg影响，同时受到多种因素的影响，如保温时间、TCC反应时间等。 2.5 叶绿素总量的测定 本实验给出标准曲线，在得出实验叶片研磨液的叶绿素吸光度后查出数值，计算总量。 标准曲线如下： 完全营养液培养植株OD值：1.313 —— C为：134.17μg/ml 缺Mg营养液培养植株OD值：0.627 —— C为： 64.17μg/ml 叶绿素含量（mg/g 样品）=（V1×C/W×103）×V2/V3 （V1为皂化液体积ml，V2为叶绿素提取液总体积ml，V3为用于皂化的叶绿素提取液体积ml，C为标准曲线查的叶绿素含量μg/ml，W为取用叶片样品质量） 实验中各部分数据为：V1=10 V2=15 V3=5 W=0.5 则，完全营养液培养植株叶绿素含量=1.61mg/g 缺Mg培养液培养植株叶绿素含量=0.77mg/g 由数据看出，缺Mg会导致食物叶片叶绿素含量显著减少。分析机理是由于镁参与植物光合作用的电子传递和叶绿素合成。研究表明，叶绿体类囊体膜系统中维持一定的阳离子浓度是诱导类囊体垛叠形成基粒的重要条件，缺Mg引起光合膜垛叠受阻。有实验证实，Mg能调节叶绿体PSII和PSI之间激发能的分配，提高PSII与PSI相对荧光产量的比值[6]。 2.6 过氧化物酶活性的测定 从曲线的趋势来看是上升的，说明过氧化物酶活性在不断上升。这说明总体操作没有问题，如果酶分布不均则会上上下下导致曲线没有总体走势。 以每分钟光密度变化值表示酶活性大小，即以每分钟OD值减少0.01定义为1个活力单位。 过氧化物酶活性(U /gFW/min) = （ΔA470—反应时间内光密度值的变化，W为植物鲜重g，VT为提取酶液总体积ml，Vs为测定时取用酶液体积ml，t为反应时间min） 实验中各数据为：VT=15 Vs=0.1 W=0.3 t=5 完全培养液植株过氧化物酶活性=1080(U /gFW/min) 缺Mg培养液植株过氧化物酶活性=840(U /gFW/min) 从数据看出，缺镁胁迫使植物的过氧化物酶活性明显降低。前面已叙述过，缺Mg胁迫会使植物活性氧积累，导致质膜破坏。SOD、POD、CAT是植物在逆境条件下的三大主要保护酶系统。这些活性氧在植物体内不断生成，同时又被保护酶系统清除。这三种酶活性大小能够作为衡量植株抗逆性强弱的指标。 然而，对于POD在缺镁植株体内的含量升高还是降低则有争议。苏中军[7]等研究表明，缺素培养液培养植株的生理指标略低于用完全培养液培养的植株，可能由于缺素培养后，引起生物体膜脂过氧化程度增高，导致生物体内自由基的产生于消除平衡破坏。而Tewari等在研究缺镁胁迫对桑树的影响时发现，桑树叶片中过氧化氢含量明显提高，保护酶POD、APX、SOD活性增强，保护性物质抗坏血酸含量也增加[4]。各人觉得可能是与选取胁迫条件中不同时期有关，如果是胁迫早期，保护酶会增加来消除活性氧的影响。如果是胁迫晚期，细胞质膜结构已经遭到破坏，保护酶已经无法消除影响，细胞系统崩溃，则保护酶活性会降低。 2.7 可溶性蛋白质含量的测定及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 利用考马斯亮蓝G-250束缚蛋白质的能力来进行比色。在一定范围内，蛋白质含量与颜色的深浅成正比。 标准曲线如下： 实验数据汇总如下表： 根据公式： 蛋白质含量=（mg/g FW）= (m0为查标准曲线得到的样品测定管中蛋白质的质量mg；V0为提取液总体积ml；V1为测定时取样液体积ml；m1 为取样量g) 实验中，各组植株取用了各1g叶片 完全培养液培养的植株蛋白含量(mg/g)=32.1mg/g 缺Mg培养液培养的植株蛋白含量(mg/g)=26.7mg/g SDS-PAGE蛋白质电泳结果如下： 如上图，我们从左到右分别加样为： Marker1、缺素、全素、缺素、全素、缺素、全素、Marker2 总体看起来，缺Mg植株蛋白质的条带比完全培养植株蛋白质条带颜色浅，说明缺Mg胁迫可以导致蛋白质合成的减少。下面利用PhotoshopCS4测量分析相对迁移率： 相对迁移率=蛋白样品迁移距离（cm）/溴酚蓝迁移距离（cm） 以相对迁移率为x值，蛋白分子量对数为y值作图如下： 先分析完全培养液培养植株蛋白电泳结果： 缺Mg培养液培养植株蛋白电泳结果： 从统计数据和拍照条带明显看出，缺Mg的第15条带不见了，说明缺少了一些分子量为20.9的蛋白质。 根据以上分析数据，我们可以说明缺Mg对植物蛋白质合成是有不良影响的。查阅文献后发现，Mg对蛋白的影响主要是影响N的含量。熊英杰[5]研究，新叶中N元素在低Mg和缺Mg情况下含量较对照分别下降20.83%和32.14%，老叶中N元素在低Mg和缺Mg情况下含量较对照分别下降12.59%和24.46%。这说明，缺镁显著影响植物体内N元素含量，从而导致蛋白质合成受阻。苏中军[7]等也证明了，在缺Mg胁迫的玉米苗叶片中，蛋白质含量比全素培养的植株含量低。也有资料说，Mg能稳定蛋白质合成所必需的核糖体构型，缺Mg导致核蛋白体解离成小的核蛋白体亚单位。另外，Mg对RNA聚合酶，进而对核中RNA的形成也是必需的，缺Mg时RNA的净合成立即停止，之后蛋白质合成迅速下降。 2.8 可溶性糖含量测定 标准曲线给出如下： EMBED Equation.KSEE3 \* MERGEFORMAT 实验比色测得： 完全培养液培养植株OD值：0.436 —— 糖浓度为：76.79μg/ml 缺Mg培养液培养植株OD值：0.215 —— 糖浓度为：38.02μg/ml 可溶性糖含量%=（C×V/（W×106））×100 （C为提取液的糖含量，从标准曲线上查得μg/ml，V为样品稀释后的体积ml，W为样品重量g） 则，完全培养液植株可溶性糖含量%=2.56 缺Mg培养液植株可溶性糖含量%=1.27 由数据看出，缺Mg胁迫导致植株可溶性糖含量减少，个人认为原因在于缺Mg已经导致了整个植株生长状态紊乱，叶绿素含量减少，光合作用速率下降，细胞质膜结构破坏，通透性增大，综合造成了植物的同化作用降低，合成的糖类含量减少。 2.9 硝态氮含量的测定 自己制作标准曲线如下：   完全培养液培养植株OD值：0.089 —— 硝态氮含量：1.832μg/ml 缺Mg培养液培养植株OD值：0.052 —— 硝态氮含量：1.034μg/ml X（100g样品中硝态氮毫克数）={[(5×C×2×25)/V]/W}×0.1=(25×C)/(W×V) （C为比色液中硝态氮含量μg/ml，25为分析液总体积ml，V为所取分析液体积ml，5为比色液体积ml，2为分析液被稀释倍数，W为样品重量g，0.1为换算单位） 计算结果为：完全培养液培养植株X（100g）=3.664mg 缺Mg培养液培养植株X（100g）=2.068mg 由数据看出，缺Mg胁迫导致植株硝态氮（NO2-）含量减少，这可能是造成蛋白质合成减少的一部分原因。Riensb[8]等研究者发现，硝酸还原酶（NR）是N素代谢的限速酶，NR可直接调节NO3-还原成NO2-，从而调节N代谢，Mg可提高NR的活性水平。所以缺Mg会造成NR活性降低，从而导致植株体内NO2-含量减少。 硝态氮的作用很多，例如影响叶片对光的截获、促进根部吸收水分等。而影响NR活性的因素有很多，有光照强度、NO3-含量、碳代谢物（蔗糖）和离子浓度。需要知道的是，硝酸盐还原成亚硝酸盐需要大量的能量，是一个非常大的耗能过程。如果植株不能正常进行糖代谢，不能产能，那么将会严重影响到氮代谢，从而影响蛋白质合成。 3 讨论 Mg是植物体内的重要营养元素，参与植物体内的许多生理过程，因此缺Mg必然影响植物的生理功能，导致植物生长受抑制。研究结果表明。缺Mg会使植株细胞原生质膜电导率升高，根系活力降低，叶绿素总量下降，过氧化物酶活性降低，可溶性蛋白质合成受阻，可溶性糖总量合成下降和硝态氮含量减少，综合结果是植株正常生长代谢受到明显抑制。本实验结果基本上都与所查文献结果一致，除了使用Lci便携式仪器测量光合作用速率的结果不正确。失败原因已经分析过了，但其它各生理指标都比较科学，能够作为研究缺Mg胁迫对玉米幼苗影响的理论依据。 参考文献： [1] 黄鑫,王磊,李成,等. 玉米幼苗缺素症状研究[J]. 东北农业大学学报, 2004, 35 (3): 272-275 [2] 李延,刘星辉,庄卫民. 植物Mg素营养生理的研究进展[J]. 福建农业大学学报, 2000, 29 (1): 74-80 [3] 曹恭,梁鸣早. 镁——平衡栽培体系中植物必需的中量元素[J]. 土壤肥料, 2003, (3): 01-03 [4] 熊英杰,陈少风,李恩香,等. 植物缺镁研究进展及展望[J]. 安徽农业科学, 2010, 38 (15): 7754-7757 [5] 熊英杰,钟韬韬,严燕冬,等. 缺镁胁迫对玉米幼苗生长和离子平衡的影响[J]. 井冈山大学学报, 2010, 31 (3): 65-67 [6] 林世青,张其德,娄世庆,等. 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Key words: magnesium deficient stress; physiological character � EMBED ET.Chart.6 \* MERGEFORMAT ��� _1234567891.unknown _1234567892.unknown _1234567890.xls Chart2 0 0.1 0.196 0.285 0.38 0.483 0.588 0.69 0.777 叶绿素含量（ug/ml） 光密度 叶绿素总量测定的标准曲线 Sheet1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 0.1 0.196 0.285 0.38 0.483 0.588 0.69 0.777 Sheet1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 叶绿素含量（ug/ml） 光密度 叶绿素总量测定的标准曲线 Sheet2 Sheet3