微生物检测 美国药典

微生物检测 非无菌供试品的微生物检测：微生物计数检测 修改：生长促进实验，计数 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 的适应性以及阴性对照 概论 在供试品存在的情况下发现微生物检验能力必须被确定。 如果检验过程中发生变更或者供试品变更，且这些变更可能影响检验结果，适应性必须被确认。 检验菌株的准备 使用稳定的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 菌悬液或者按照下面所述备制。使用菌种保存技术（种子批系统），以便用于接种的可萌发微生物从最初的主种子批开始不超过5代。每种细菌和霉菌菌株的生长分别按照表一中的描述进行。 表一测试微生物的备制和使用 微生物 菌株的备制 生长促进 供试品存在的情况下计数法的适应性 嗜氧微生物总数 酵母菌及霉菌总数 嗜氧微生物总数 酵母菌及霉菌总数 ATCC6538， NCIMB9518，CIP4.8或者NBRC13267，金黄色酿脓葡萄球菌 大豆酪蛋白消化琼脂或者大豆酪蛋白消化培养基 30℃-35℃， 18-24小时 大豆酪蛋白消化琼脂或者大豆酪蛋白消化培养基≤100CFU，30℃-35℃，不超过3天 大豆酪蛋白消化琼脂或者MPN大豆酪蛋白消化培养基≤100CFU，30℃-35℃，不超过3天 ATCC 9027， NCIMB8626， CIP82.118或者NBRC1275，绿脓杆菌 大豆酪蛋白消化琼脂或者大豆酪蛋白消化培养基 30℃-35℃， 18-24小时 大豆酪蛋白消化琼脂或者大豆酪蛋白消化培养基≤100CFU，30℃-35℃，不超过3天 大豆酪蛋白消化琼脂或者MPN大豆酪蛋白消化培养基≤100CFU，30℃-35℃，不超过3天 ATCC6633， NCIMB8054， CIP52.62或者NBRC334,枯草杆菌 大豆酪蛋白消化琼脂或者大豆酪蛋白消化培养基 30℃-35℃， 18-24小时 大豆酪蛋白消化琼脂或者大豆酪蛋白消化培养基≤100CFU，30℃-35℃，不超过3天 大豆酪蛋白消化琼脂或者MPN大豆酪蛋白消化培养基≤100CFU，30℃-35℃，不超过3天 白色念珠菌， ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72或者NBRC 1594 沙氏葡糖琼脂或者沙氏葡糖培养基20℃-25℃， 2-3天 大豆酪蛋白消化琼脂≤100CFU，30℃-35℃，不超过5天 沙氏葡糖琼脂≤100CFU，20℃-25℃，不超过5天 大豆酪蛋白消化琼脂≤100CFU，30℃-35℃，不超过5天 MPN：不适应 沙氏葡糖琼脂≤100CFU，20℃-25℃，不超过5天 黑曲霉， ATCC 16404, IMI 149007, IP 1431.83, 或者NBRC 9455 沙氏葡糖琼脂或者马铃薯葡萄糖琼脂20℃-25℃， 5-7天 或者直到形成良好的孢子状态 大豆酪蛋白消化琼脂≤100CFU，30℃-35℃，不超过5天 沙氏葡糖琼脂≤100CFU，20℃-25℃，不超过5天 大豆酪蛋白消化琼脂≤100CFU，30℃-35℃，不超过5天 MPN：不适应 沙氏葡糖琼脂≤100CFU，20℃-25℃，不超过5天 使用pH7.0的缓冲氯化钠蛋白胨溶液或者pH7.2的磷酸盐缓冲溶液备制测试菌悬液；备制黑曲霉孢子悬浮液时， 0.05%的聚山梨脂80可以被添加到缓冲液中。测试菌悬液应在两小时内使用，或者在2-8℃的条件下24小时内使用。也可以通过制备并稀释枯草芽胞杆菌营养细胞的新鲜悬液进行替代，制备稳定的胞子悬液，在接种测试中使用适当体积的胞子菌悬液，稳定的胞子悬液在2-8℃保存，保存期是经过验证的。 阴性对照 为了确定检测条件，用选择好的稀释液代替测试备制来进行阴性对照。必须没有微生物的生长。当按照供试品检测中的描述进行检验时，也需要进行阴性对照。如果阴性对照不合格需要进行调查。 培养基的生长促进 检测每个批次的已经备制好的培养基以及通过脱水培养基或者描述的配料备制的每个批次的培养基。 在部分/盘大豆酪蛋白消化肉汤培养基以及大豆酪蛋白消化琼脂上接种少量（不超过100CFU）微生物，按表一中所示，每一种微生物应使用单独一部分/一盘培养基。在沙氏葡萄糖琼脂上接种少量（不超过100CFU）微生物，按表一中所示，每一种微生物应使用单独的一盘培养基。按照表一中所述的条件进行接种。 固体培养基的生长通过一个不大于2的系数的调节必须不能与标准接种体计算得到的数值有区别。新鲜备制的接种体微生物的生长应与上一批通过检测的培养基的生长情形相同。如果肉眼能清晰看到的微生物的生长与上一批通过检测的培养基的生长情形相同的话，液体培养基是适合的。 计数方法在供试品中的适应性 样品的备制 样品的备制方法取决于被检测供试品的特性。如果下列所述的步骤均不能得到满意的结果，必须找一种适当的替代程序。 水溶性供试品- 在pH7.0的缓冲氯化钠蛋白胨溶液，pH7.2的磷酸盐缓冲溶液或者大豆酪蛋白消化肉汤培养基中溶解或者稀释要检测的供试品（通常是一份供试品在10份稀释液中稀释备制）。如果需要的话，调节pH值从6到8。如果需要，用同样的稀释液进一步稀释。 不溶于水的脱脂供试品-将要检测的供试品在pH7.0的缓冲氯化钠蛋白胨溶液，pH7.2的磷酸盐缓冲溶液或者大豆酪蛋白消化肉汤培养基中悬浮（通常按1：10的稀释比例备制）。 表面活性酶如每升一克的聚山梨脂80可被加入以辅助易溶于水的物质的悬浮。如果需要，调节pH值6到8.如果需要，用同样的稀释液进一步稀释。 油性供试品-在过滤灭菌后的肉豆蔻酸异丙酯中溶解待检品或者取需要的最少量的无菌聚山梨脂80或者其他非抑制无菌表面活性剂与待检品混合，如果需要，加热至不超过40摄氏度，特殊情况下，不超过45摄氏度。仔细混合，如果需要，在水浴中以保持温度。加入足够量的已加热的选择好的稀释剂按1：10的比例备制初液。在保持乳状液形成的需要的最短的时间的同时，仔细混合。接下来的连续的10份稀释液可以通过使用选择好的含有适当浓度的无菌聚山梨脂80稀释剂或者其他的非抑制无菌表面活性剂备制。 流体或者喷雾状固体-在无菌状态下转移供试品至膜过滤器中或者无菌的容器中以进一步取样。 使用每个待检容器的全部的内含物或者规定数量的一定的剂量。 透皮贴剂- 去掉贴剂的保护层（去掉衬层）并贴在无菌玻璃或者塑料托盘上，黏贴面朝上。用适当无菌渗透物（如无菌纱布）将黏贴的表面盖上以防止贴剂粘在一起，并将贴剂转移到适量的选择好的含有如聚山梨脂80抑制剂和/或卵磷脂的稀释剂中。用力摇晃备制液至少30分钟。 接种以及稀释 添加足量体积的微生物悬浮液到按照上面所述备制的样品以及对照品（不含检测物）以得到不超过100CFU的接种体。接种体悬浮液的体积不应超过过稀释的供试品的体积的1%。 为了证明供试品中的可接受的微生物回收，已备制样品的最低的可能的稀释因子必须用于检测中。如果因为抗菌活性或者溶解性太差而不可能的话，必须开发进一步的合适的方案。如果样品的生长抑制不能另外避免，等量部分的微生物悬浮液可以在中和，稀释或者过滤后加入。 抗菌活性中和/去除 从按照接种和稀释描述中稀释的并在下面所述的供试品中微生物的回收程序中备制好的样品回收的微生物数， 应该与对照备制品回收的微生物数相同。 如果生长被抑制（通过不大于2的系数减少），然后特别修改计数检测程序以确保结果的有效性。例如，修改的程序可包括下列部分： 1） 增加稀释剂和培养基的用量； 2） 在稀释剂中加入一种特殊的或者一般的中和剂； 3） 膜过滤或者 4） 综合上述措施 中和剂- 中和剂可被用于中和抗菌剂的活性（参照表2）。他们可以特别在灭菌前加在已选择的稀释剂或者培养基中。如果被使用，其功效和微生物毒性的不存在必须通过中和剂和没有供试品开展空白。 表2 干扰物质的一般中和剂/方法 干扰物质 潜在中和剂/方法 戊二醛，水银剂 硫酸氢钠 酚醛塑料，酒精，乙醛，山梨酸酯 稀释 乙醛 氨基乙酸 季铵化合物，苯甲酸酯类，bisbiguanides 卵磷脂 季铵化合物,碘，苯甲酸酯类 聚山梨醇酯 水银剂 巯基醋酸盐 水银剂，卤素，乙醛 硫代硫酸盐 乙二胺四乙酸盐 镁离子或钙离子 如果不能发现合适的中和方法，可以假设导致隔离接种有机体失败的原因要归结于供试品的微生物活性。此信息可以解释为该供试品不易于被给定的微生物品种污染。然而，有可能是供试品只能抑制在此列出的部分的微生物，但是不能抑制测试菌株中不包括的其他的微生物，或者不能抑制测试菌株中没有代表的那些微生物。然后，用适合微生物生长以及特别接受标准的最高稀释因子进行实验。 供试品中微生物的回收 列出的每种微生物中，分别进行单独实验。只有增加的测试菌株微生物数被计算。 膜过滤- 使用标称孔尺寸不超过0.45um的膜过滤器。 过滤器材质的类型的选择要保证细菌保留效率不被要调查的样品成分影响。每种列出的微生物，使用一个过滤器。 转移适量的样品（最好是1克有代表性的样品，或者如果CFU数被预计很多可以减少用量）到膜过滤器中，样品要按照样品备制，接种和稀释，以及抗菌活性的中和/去除中的描述进行备制，立即过滤，并用适量的稀释剂冲洗膜过滤器。 为确定总好氧细菌数，转移膜过滤器到大豆酪蛋白消化琼脂的表面上。为确定酵母菌和霉菌总数，转移膜到沙氏葡糖琼脂的表面。按照表一中说述培养培养基。然后计数。 平板计数方法- 每种培养基至少进行两次培养皿方法，取平均值。 倾注平板方法-在直径是9CM的皮氏培养皿中加入1毫升的样品，样品按照样品备制，接种和稀释，以及抗菌活性的中和/去除中的描述进行备制，15-20毫升的大豆酪蛋白消化琼脂或者沙氏葡萄琼脂，两种培养基的保存不能超过45℃。如果使用更大一些的皮氏培养皿，琼脂培养基的用量也要相应增加。表一中所列出的每种微生物，至少要使用两个培养皿。 按照表一中所述培养培养皿。取每种培养基数的平均值，计算首接种体的CFU数量。 表面铺展方法-在直径是9CM的皮氏培养皿中加入15-20毫升的大豆酪蛋白消化琼脂或者沙氏葡萄琼脂，每个培养皿在大约45℃，并允许凝固。如果使用大一些的培养皿，琼脂的用量也要相应增加。干燥培养皿，例如，用鼓风干燥机或者在细菌培养器中。表一中列出的每种微生物，至少要使用两个培养皿。将测量好的不少于0.1毫升的样品散在培养基的表面上，样品要按照样品备制，接种和稀释，以及抗菌活性的中和/去除中的描述进行备制，按照倒板方法中的描述进行培养并计数。 最可能数法(MPN)- MPN方法的准确性要低于膜过滤方法或者平板计数方法。特别是对霉菌数得到一个不可靠的结果。由于这些原因，MPN方法是好氧细菌总数在其他方法不可行的情况下的保留方法。如果该方法的使用有据可循，按照下面的步骤进行。 按照样品备制，接种和稀释，以及抗菌活性的中和/去除中的描述备制一系列至少3个连续的10倍的稀释。三等分的1克或1毫升的每个水平的稀释，用于接种三个9-10毫升的大豆酪蛋白消化肉汤中。如果需要，表面活性剂如聚山梨脂80或者抗菌抑制剂可以加入到培养基中。 因此，如果备制了三个水平的稀释，9个试管要接种。 在30℃-35℃的条件下培养不超过3天。如果结果的读取困难或者由于待检品的性质的原因不确定，在同样的肉汤中或在大豆酪蛋白消化琼脂中在同样的温度条件下再培养1-2天，并使用其结果。从表三的数据中确定待检品的每克或者每毫升的最可能的微生物数。 表三 最可能的微生物值 观察的试管数 显示每一组的生长 供试品的MPN值 每克或每毫升 95%置信界线 每个试管的供试品的克数或者毫升数 0.1 0.01 0.001 0 0 0 <3 0-9.4 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 2 0 0 3 0 1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 1 0 1 1 1 1 2 0 1 2 1 1 3 0 2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 1 0 2 1 1 2 1 2 2 2 0 2 2 1 2 2 2 2 3 0 2 3 1 3 0 0 3 0 1 3 0 2 3 1 0 3 1 1 3 1 2 表三 微生物的最可能值 （继续） 结果以及解释 当确定膜过滤法以及平板计数法的适应性时，必须得到任何一种检测有机体的平均数值，该数值通过大于2的系数的调节与在没有供试品的参与下接种和稀释中规定的对照值没有区别。当确定MPN方法的适应性时，从接种体中计算得到的数值必须在对照品中得到结果的95%置信界限内。 如果上述标准不能用任一种所叙述的方法符合检测有机体中的其中一种，使用最接近标准的方法和检测条件来检测该供试品。 非无菌供试品的微生物检测：指定微生物的检测 培养基的生长促进和抑菌性，测试的适应性以及阴性对照 在存在供试品的情况下，此项测试检测微生物的能力必须得到确立。如果在测试性能或供试品中作了变更且这些变更可能影响测试的结果，则其适用性必须得到确认。 供试菌株的制备 按下面所述，使用标准化的稳定供试菌株悬浮液。使用菌种保存技术（种子批系统），以便用于接种的可萌发微生物从最初的主种子批开始不超过5代。 好氧微生物 将每个供试细菌菌株单独置于装有大豆酪蛋白消化物肉汤培养基或者大豆酪蛋白消化物琼脂培养基中容器内，在温度30o至35 o之间培养18至24小时。将白色念珠菌的供试菌株单独置于Sabouraud（沙氏）葡萄糖琼脂培养基或者Sabouraud（沙氏）葡萄糖肉汤中，在温度20o至25 o之间培养2至3天。 金黄色葡萄球菌 如ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83, 或 NBRC 13276 绿脓杆菌 如ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, 或NBRC 13275 大肠杆菌 如ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126, 或NBRC 3972 沙门氏肠道菌，肠道血清型为鼠伤寒沙门氏菌，作为替代品 如ATCC 14028 沙门氏肠道菌，肠道血清型为阿邦尼沙门氏菌 如NBRC 100797, NCTC 6017, 或 CIP 80.39 白色念珠菌 如ATCC 10231, NCPF 3197, IP 48.72, 或NBRC 1594 使用pH值7.0的缓冲氯化钠—蛋白胨溶液或pH值7.2的磷酸盐缓冲液来制备检测供试悬浮液。悬浮液在2小时内使用，或在存放于2o至8 o的情况下，在24小时内使用。 梭状芽孢杆菌 使用生孢梭菌如ATCC 11437 (NBRC14293, NCIMB 12343, CIP 100651) 或 ATCC 19404 (NCTC 532或 CIP 79.3)。于温度30o至35 o，厌氧条件下，在梭状芽孢杆菌强化培养基里将梭菌供试菌株培养24至48小时。作为制备然后稀释新鲜的梭状芽孢杆菌体细胞悬浮液的替代方法，一种稳定的孢子悬浮液被用于检测接种。此稳定孢子悬浮液可以在2o至 8o温度内保存，期限需验证。 阴性对照 为确认测试条件，用选定的稀释液代替供试制备品进行阴性对照实验。此试验中必须没有微生物的生长。 培养基的生长促进和抑菌性能 检测每批已制备的培养基和每批由脱水培养基或培养基成分制备培养基。按表1中所描述的内容来验证相关培养基的适用性能。 对生长促进性能的检测，液体培养基—用少量（不多于100cfu）适当的微生物，接种部分适合的培养基。在指定的温度下进行培养，且时间不多于检测中规定的最短时间。发生了清晰可见的微生物生长，且与用此前检验并批准过的培养基批次所得到的微生物生长相当。 对生长促进性能的检测，固体培养基—执行表面铺展法（见非无菌供试品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节下的平板计数法），用少量（不超过100cfu）适当的微生物给每个平皿接种。在指定的温度下培养，且时间不超过测试中规定的最短时间。发生了微生物生长，且与用此前检验并批准过的培养基批次所得到的微生物生长相当。 对抑菌性能的检测，液体或固体培养基—用至少100cfu适合的微生物接种合适的培养基。在指定的温度下进行培养，且时间不少于检测中规定的最长时间。应没有发生供试微生物的生长。 对指示性能的测试—执行表面铺展法（见非无菌供试品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节下的平板计数法），用少量（不多于100cfu）的适当的微生物给每个平皿接种。在指定温度下进行培养，且时间为在检测中规定的时间范围内。菌落在外观和指示反应上与从此前已检测并批准的培养基批次所获得的菌落是相当的。 检查方法的适用性 按照在供试品的检测项下相关的段落里的描述，对每种新供试品进行样品制备。混合的时候，在指定的增长培养基里加入每种供试菌株。单独接种供试菌株。在被接种的供试制备品中，使用数量相当于不多于100cfu的微生物。 按照在供试品的检测项下相关段落里的描述，使用所规定的最短接种时间进行检测。 规定的微生物必须按照在供试品的检测项下的描述，以指示反应进行检测。 供试品的任何抗菌活性会使修改检测规程（见在非无菌供试品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节下的抗菌活性的中和/去除项）成为必要。 对某个特定的供试品，如果其对于检测所指定的微生物的抗菌活性不能被中和，则可以假定为在供试品中不会存在此种被抑制微生物。 供试品的检测 胆汁耐性革兰氏阴性菌 样品的制备和预培养—按照非无菌供试品生物学检测：微生物计数检查法<61>章节中的描述，将不少于1克的供试品以1:10稀释来制备样品，但是使用大豆酪蛋白消化物肉汤培养基作为所选择的稀释剂，混匀，并在20o至25 o时培养一段时间，此时间段足以使细菌复苏但不足以促进微生物的繁殖（通常2个小时而不超过5小时）。 确认微生物不存在的检测—除非另有规定，否则使用按样品的制备和预培养项下规定制备的、对应的1克该供试品的制备品，接种至肠道菌增菌肉汤培养基Mossel。在温度30o至35 o下培养24至48小时。再次培养紫红色胆汁葡萄糖琼脂培养基平皿上。在温度30 o至35 o下培养18至24小时。 如果没有菌落生长，则供试品符合该检测的要求。 表1. 培养基的生长促进、抑菌、指示性能 检测/培养基 特性 供试菌株 胆汁耐性革兰氏阴性菌的检测 l肠道菌增菌肉汤培养基 生长促进 大肠杆菌 绿脓杆菌 抑制 金黄色葡萄球菌 紫红色胆汁葡萄糖琼脂培养基 生长促进+指示 大肠杆菌 绿脓杆菌 大肠杆菌的检测 麦康凯培养基流体 生长促进 i大肠杆菌 抑制 金黄色葡萄球菌 麦康凯琼脂 生长促进+指示 大肠杆菌 沙门氏菌的检测 氯化镁孔雀绿沙门氏菌富集肉汤培养基 生长促进 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium or Salmonella enterica subsp. enterica serovar abony 抑制 金黄色葡萄球菌 木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养基 生长促进+指示 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium or Salmonella enterica subsp. enterica serovar abony 指示 大肠杆菌 绿脓杆菌的检测 十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基 生长促进 绿脓杆菌 抑制 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌的检测 甘露醇氯化钠琼脂培养基 生长促进+指示 金黄色葡萄球菌 抑制 大肠杆菌 梭状芽孢杆菌的检测 梭状芽孢杆菌强化培养基 生长促进 生孢梭菌 哥伦比亚琼脂 生长促进 生孢梭菌 白色念珠菌的检测 （沙氏）葡萄糖肉汤培养基 生长促进 白色念珠菌 （沙氏）葡萄糖琼脂培养基 生长促进+指示 白色念珠菌 定量检测— 选择和再培养—将在样品的制备和预培养项下规定的制备品和/或分别包含0.1克，0.01克，和0.001克（或0.1毫升，0.01毫升，和0.001毫升）该供试品的稀释液，接种于适量的肠道菌增菌肉汤培养基Mossel。在温度30℃至35℃下培养24至48小时。在紫红色胆汁葡萄琼脂培养基的平皿上对培养物进行再次培养。在温度30℃至35℃下培养18至24小时。 说明—菌落的生长构成了阳性结果。记录产生阳性结果的最少量供试品和产生阴性结果的最大量供试品。从表2中大概确定细菌的数量。 表2. 结果的说明 每个供试品数量的结果 每克或每毫升供试品的细菌几率数量 0.1 g or 0.1 mL 0.01 g or 0.01 mL 0.001 g or 0.001 mL + + + 超过103 + + - 小于103并且大于102 + - - 小于102并且大于10 - - - 10 小于10 大肠杆菌 样品的制备和预培养—按在 非无菌产品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节下的描述，将不少于1克的供试品以1:10稀释来制备样品，并使用10毫升或对应1克或1毫升的数量，接种于适量（按照检查方法的适用性项下的内容来确定）的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基，混匀，并在温度30℃至35℃ 下培养18至24小时。 选择和再次培养—摇动容器，转移1毫升大豆酪蛋白消化物肉汤培养基至100毫升的麦康凯（MacConkey）肉汤培养基，并在温度42 ℃至44 ℃ 下培养24至48小时。在温度30至35℃下，于麦康凯（MacConkey）琼脂培养基的平皿上再次培养18至72小时。 说明—菌落的生长表明了大肠杆菌存在的可能性。这需通过鉴别检测来证明。 如果没有菌落存在或如果确认鉴别检测为阴性，则该供试品符合该检测的要求。 沙门氏杆菌 样品的制备和预培养—按照在 非无菌产品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节下的描述制备供试品，并使用对应不少于10克或10毫升的数量接种于适量（按照检查方法的适用性项下内容来确定）的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基，混合，在温度30℃ 至35℃ 下培养18至24小时。 选择和再次培养—转移0.1毫升大豆酪蛋白消化物肉汤培养基至10毫升氯化镁孔雀绿沙门氏菌富集肉汤培养基，并在温度30至35℃之间培养18至24小时。在木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养基的平皿内再次培养。在温度30至35℃之间培养18至48小时。 说明—可能存在的沙门氏菌通过生长良好的红色菌落，带有或没有黑色中心来识别。这由鉴定试验来确认。 绿脓杆菌 样品的制备和预培养—按照在 非无菌产品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节中的描述，将不少于1克的供试品以1:10稀释来制备样品，并使用10毫升或对应1克或1毫升的数量，接种于适量（按照检查方法的适用性项下描述来确定）的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基，混匀。当检测贴剂时，通过无菌膜过滤器来过滤对应一贴制备品的样品（见 非无菌产品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节中样品的制备项下贴剂），并置于100毫升大豆酪蛋白消化物肉汤培养基。在温度30至35℃ 之间培养18至48小时。 选择和再次培养—在十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基的平皿内再次培养，并在温度30℃至35℃之间培养18至72小时。 说明—菌落的生长表明了绿脓杆菌存在的可能性。这需通过鉴别检测来证明。 如果菌落不存在或如果确认鉴别检测为阴性，则该供试品符合该检测的要求。 金黄色葡萄球菌 样品的制备和预培养—按照 非无菌产品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节中的描述，将不少于1克供试品以1:10稀释来制备样品，并使用10毫升或对应1克或1毫升的数量来接种适量（按照检查方法的适用性项下的描述来确定）于大豆酪蛋白消化物肉汤培养基，并使其均匀。当检测贴剂时，通过无菌膜过滤器来过滤对应一贴制备品的样品（见在 非无菌产品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节里的样品的制备项下的贴剂），并置于100毫升大豆酪蛋白消化物肉汤培养基内。在温度30℃至35℃下培养18至24小时。 选择和再培养—再次培养在甘露醇氯化钠琼脂培养基的平皿上，并在温度30至35℃之间培养18至72小时。 ℃ 说明—金黄色葡萄球菌存在的可能性通过由黄色区域环绕的黄色或白色菌落的生长来识别。这需通过鉴别检测来证实。 如果所描述类型的菌落不存在或如果确认鉴别检测为阴性，则该供试品符合该检测的要求。 梭状芽孢杆菌 样品的制备及热处理—按照 非无菌产品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节中的描述，将不少于1克供试品以1:10稀释来制备样品，分别取相对应不少于10毫升的两个供试品。将其中一份在温度80℃加热10分钟，并快速冷却。不要加热另外一份。 选择和再培养—使用10毫升或对应1克或1毫升的产品来做检测（按照检查方法的适用性项下的描述来确定）在无氧的条件下、温度30℃至35℃之间，培养48小时。培养之后，将来自每个试管的培养物在哥伦比亚琼脂培养基上进行再次培养，并在无氧条件下、温度30℃至35℃之间，培养48小时。 说明—杆菌（带有或没有内生孢子）厌氧性生长出现阴性过氧化氢酶反应的现象，表明了梭状芽孢杆菌的存在。 这需通过鉴别检测来证实。如果所描述类型的菌落不存在或如果确认鉴别检测为阴性，则该供试品符合该检测的要求。 白色念珠菌 样品的制备和预培养—按照在 非无菌产品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节中的描述制备供试品，并使用10毫升或对应不少于1克或1毫升的数量，接种于100毫升Sabouraud（沙氏）葡萄糖肉汤培养基，并混匀。在温度30o至35o之间培养3至5天。 选择和再培养—对在Sabouraud（沙氏）葡萄糖琼脂培养基的平皿中进行再次培养，并且在温度30o至 35o之间培养24至48小时。 说明—白色菌落的生长可以表明白色念珠菌的存在。这需通过鉴别检测来证明。 如果这样的菌落不存在或者如果确认鉴别检测为阴性，则供试品符合该检测的要求。 建议的溶液和培养基 [注—给出本节以提供资料。] 以下溶液和培养基已经证实能够令人满意地用于其用途，正是为了此用途它们被置于药典的微生物污染检测项下。其他培养基可能成为药典中的微生物污染。如果其他培养基具有类似的生长促进和抑菌性能，则也可以使用。 贮备缓冲溶液—将34克磷酸二氢钾转移到一只1000毫升容量瓶内，溶解在500毫升纯净水中，以氢氧化钠调整pH值为7.2±0.2，加入纯净水至刻度，并混匀。分装在容器中，并灭菌。在温度2℃到8℃之间贮存。 磷酸盐缓冲液pH值7.2—制备纯净水与贮备缓冲溶液（800:1 v/v）的混合液，并灭菌。 缓冲氯化钠－蛋白胨溶液pH值7.0 磷酸二氢钾 3.6 g 二水合磷酸氢二钠 7.2 g (相当于0.067M磷酸盐) 氯化钠 4.3 g 蛋白胨（肉类或酪） 1.0 g 纯净水 1000 mL 在一个高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。 大豆－酪蛋白消化物肉汤培养基 酪蛋白胰酶消化物 17.0 g 大豆木瓜蛋白酶消化物 3.0 g 氯化钠 5.0 g 二元磷酸氢盐 2.5 g 水合葡萄糖 2.5 g 纯净水 1000 mL 调整pH的值，以使在灭菌后，温度为25℃时，pH值为7.3±0.2。在高压灭菌器以经过验证的周期进行灭菌。 大豆－酪蛋白消化物琼脂培养基 酪蛋白胰酶消化物 15.0 g 大豆木瓜蛋白酶消化物 5.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0 g 纯净水 1000 mL 调整pH值，以使在灭菌后，温度为25℃时，pH值为7.3±0.2。在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。 (沙氏)葡萄糖琼脂培养基 葡萄糖 40.0 g 动物组织胃酶消化物和酪蛋白胰酶消化物混合物（1:1） 10.0 g Agar 琼脂 15.0 g 纯净水 1000 mL 调整pH值，以使在灭菌后，温度为25℃时，pH值为5.6±0.2。在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 马铃薯浸液 200 g 葡萄糖 20.0 g 琼脂 15.0 g 纯净水 1000 mL 调整pH值，以使在灭菌后，温度为25℃时，pH值为5.6±0.2。在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。 (沙氏)葡萄糖肉汤培养基 葡萄糖 20.0 g 动物组织胃酶消化物和酪蛋白胰酶消化物混合物（1:1） 10.0 g 纯净水 1000 mL 调整pH值，以使在灭菌后，温度为25℃时，pH值为5.6±0.2。在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。 肠道菌增菌肉汤培养基Mossel 白明胶胰酶消化物 10.0 g 水合葡萄糖 5.0 g 脱水牛胆汁 20.0 g 磷酸二氢钾 2.0 g 二水合磷酸氢二钠 8.0 g 亮绿 15 mg 纯净水 1000 mL 调整pH值，以使在灭菌后，温度为25℃时，pH值为7.2±0.2。加热到100 o持续30分钟，立即冷却。 紫红色胆汁葡萄糖琼脂培养基 酵母提取物 3.0 g 白明胶胰酶消化物 7.0 g 胆盐 1.5 g 氯化钠 5.0 g 水合葡萄糖 10.0 g 琼脂 15.0 g 中性红 30 mg 结晶紫 2 mg 纯净水 1000 mL 调整pH值，以使在灭菌后，温度为25℃时，pH值为7.4±0.2。加热至沸腾；不得在高压灭菌器内加热。 麦康凯（MacConkey）肉汤培养基 白明胶胰酶消化物 20.0 g 一水乳糖 10.0 g 脱水牛胆汁 5.0 g 溴甲酚紫 10 mg 纯净水 1000 mL 调整pH值，以使在灭菌后，温度为25℃时，pH值为7.3±0.2。在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。 麦康凯琼脂培养基 白明胶胰酶消化物 17.0 g 蛋白胨（肉类和酪蛋白） 3.0 g 一水乳糖 10.0 g 氯化钠 5.0 g 胆盐 1.5 g 琼脂 13.5 g 中性红 30.0 mg 结晶紫 1 mg 纯净水 1000 mL 调整pH值，以使在灭菌后，温度为25℃时，pH值为7.1±0.2。沸腾1分钟并且持续摇动，然后在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。 氯化镁孔雀绿沙门氏菌富集肉汤培养基 大豆蛋白胨 4.5 g 六水氯化镁 29.0 g 氯化钠 8.0 g 磷酸氢二钾 0.4 g 磷酸二氢钾 0.6 g 孔雀石绿 0.036 g 纯净水 1000 mL 轻微加热，溶解。在时，使用高压灭菌器，温度不超过115 ℃，以经过验证的周期进行灭菌。在加热和高压灭菌后，温度25℃时，pH值为5.2±0.2。 木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养基 木糖 3.5 g L-赖氨酸 5.0 g 一水乳糖 7.5 g 蔗糖 7.5 g 氯化钠 5.0 g 酵母提取物 3.0 g 酚红 80 mg 琼脂 13.5 g 脱氧胆酸钠 2.5 g 硫代硫酸钠 6.8 g 枸橼酸铁铵 0.8 g 纯净水 1000 mL 调整pH值，以使在加热后，温度为25℃时，pH值为7.4±0.2。加热至沸腾，冷却到50o，并倒进培养皿内。不得在高压灭菌器内加热。 十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基 白明胶胰酶消化物 20.0 g 氯化镁 1.4 g 硫酸二钾 10.0 g 十六烷三甲基溴化铵 0.3 g 琼脂 13.6 g 纯净水 1000 mL 甘油 10.0 mL 加热伴以摇动至沸腾1分钟。调整pH值，以使在灭菌后，温度为25℃ 时，pH值为7.2±0.2。在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。 甘露醇氯化钠琼脂培养基 酪蛋白胰酶消化物 5.0 g 酪蛋白胃蛋白酶消化物 5.0 g 牛肉浸膏 1.0 g D-甘露醇 10.0 g 氯化钠 75.0 g 琼脂 15.0 g 酚红 0.025 g 纯净水 1000 mL 加热伴以摇动至沸腾1分钟。调整pH值，以使在灭菌后，温度为25 ℃时，pH值为7.4±0.2。在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。 梭状芽孢杆菌强化培养基 牛肉浸膏 10.0 g 蛋白胨 10.0 g 酵母提取物 3.0 g 可溶性淀粉 1.0 g 一水葡萄糖 5.0 g 半胱氨酸盐酸盐 0.5 g 氯化钠 5.0 g 乙酸钠 3.0 g 琼脂 0.5 g 纯净水 1000 mL 将琼脂水合，并加热伴以持续搅拌直至沸腾使其溶解。如果有必要，调整pH值，以使在灭菌后，温度为25 ℃时，pH值大约为6.8±0.2。在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。 哥伦比亚琼脂培养基 酪蛋白胰酶消化物 10.0 g 肉类胃酶消化物 5.0 g 心脏胰酶消化 3.0 g 酵母提取物 5.0 g 玉米淀粉 1.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂，根据其凝胶化机能调节数量 10.0-15.0 g 纯净水 1000 mL 将琼脂水合，并加热伴以持续搅拌直至沸腾使其溶解。如有必要，调整pH值，以使在灭菌后，温度为25℃ 时，pH值为7.3±0.2。在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。静置冷却到温度为45℃至50 ℃之间；如需要，加入对应20 mg庆大霉素盐基的硫酸庆大霉素，并倒进培养皿内。 (71) 稳定性实验 此通则的各部分已经与欧洲药典和/或日本药典的对应部分做了协调。不一致的部分用符号（ ）来标明。 这些药典规定程序自身的设计不能确保一批产品无菌或已经灭菌。这主要是通过灭菌 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 或者无菌操作程序的验证来完成。 根据药典这个实验适用于物质，供试液及本文，本实验符合无菌要求。然而，好的实验结果只能表明在实验条件下样品检测中没有发现受污染微生物。 微生物污染防范 为了实现这样的条件，试验环境必须调整到适合进行无菌检查的方式。为避免污染而采取的特定预防措施应不会对任何试图在检查中发现的微生物产生影响。通过在工作区域作适当取样并进行适当控制，来定期监测进行此试验的工作条件。 培养基和孵化温度 按照下面描述的方法配制实验用培养基，或者使用相对媒介，其能够符合好氧菌、厌氧菌、霉菌生长促进试验的要求即可。 下面的培养基已经被证实适合进行无菌检查。巯基醋酸盐液体培养基主要用于厌氧菌的培养。但其也用于检测好氧菌。大豆酪蛋白消化物培养基适合于培养霉菌和好氧菌。 巯基醋酸盐液体培养基 L-胱氨酸 0.5 g 氯化钠 2.5 g 葡萄糖 5.5/5.0 g 琼脂 0.75 g 酵母提取物(水溶性) 5.0 g 酪蛋白胰酶消化物 15.0 g 巯基乙酸钠 0.5 g 或者巯基乙酸 0.3 mL 刃天青钠溶液(1比1000)，新配制 1.0 mL 纯净水 1000 mL 灭菌后pH:7.1±0.2 将L-胱氨酸、氯化钠、葡萄糖、酵母提取物、酪蛋白胰酶消化物与纯净水混合，并加热至实现溶解。将巯基乙酸钠或者巯基乙酸溶解于该溶液，如果需要可再加入1N氢氧化钠，以便在灭菌后该溶液呈pH值7.1 ± 0.2。如需要则过滤，再次加热该溶液但不得煮沸，并趁热以湿润滤纸将该溶液过滤。加入刃天青钠溶液，混匀，并将该培养基置于适当容器中，该容器应为培养基提供特定的面积－深度比，以使在培养期末表明氧气摄入的变色部分不超过培养基的上半部分。使用经过验证的工艺进行灭菌。如果需要储存该培养基，将其置于无菌、气密容器中，在2℃ 至25 ℃之间储藏。如果超过上部三分之一的培养基已经呈粉色，可以用以下方法恢复该培养基一次：在水浴锅中或者自由流动蒸气中加热该容器，直至粉色消失，并迅速放凉，须小心防止非无菌空气进入到容器中。 大豆-酪蛋白消化物培养基 酪蛋白胰酶消化物 17.0 g 大豆粉木瓜蛋白酶消化物 3.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钾 2.5 g 葡萄糖 2.5/2.3 g 纯净水 1000 mL First supplement, USP-NF 发补1，USP-NF Soybean-casein digest medium (continued) 大豆蛋白消化酶（继续） Dibasic Potassium Phosphate二盐基亚磷酸钾…… Dextrose Monohydrate/Anhydrous葡萄糖一水/无水…… Purified water纯化水…… pH after sterilization:7.3±0.2 灭菌后pH值：7.3±0.2 Dissolve the solids in the purified water, heating slightly to effect a solution. Cool the solution to room temperature, and adjust the pH within 1N sodium hydroxide so that, after sterilization, it will have a PH of 7.3±0.2. Filter, if necessary to clarify, dispense into suitable containers, and sterilize using a validated procedure. Store at a temperature between 2° and 25° in a sterile well-closed container, unless it is intended for immediate use. Do not use the medium for a longer storage period than has been validated. 将固体物质溶解于纯净水，轻微加热以实现溶解。放凉溶液至室温，并用1N氢氧化钠调整pH值，以便在灭菌后其pH值呈7.3 ± 0.2。过滤，如需要则使之澄清，分装入适合的容器，并用经过验证的程序消毒。如果不立刻使用，则在2 到25 度之间以无菌且密闭良好的容器保存。不要使用储存器超过验证期的酶。 Soybean-Casein Digest Medium is to be incubated at 22.5±2.5° 大豆-酪蛋白消化物培养基将在22.5 ± 2.5 条件下培养 Media for Penicillins or Cephalosporins 用于青霉素和头孢菌素的培养基 Where sterility test media are to be used in the Direct Inoculation of the Culture Medium method under Test for Sterility of the Product to be Examined, modify the preparation of Fluid Thioglycollate Medium and the Soybean–Casein Digest Medium as follows. To the containers of each medium, transfer aseptically a quantity ofβ-lactamase sufficient to inactivate the amount of antibiotic in the specimen under test. Determine the quantity ofβ-lactamase required to inactivate the antibiotic by using aβ-lactamase preparation that has been assayed previously for its penicillin- or cephalosporin-inactivating power. [NOTE—Supplemented -βlactamase media can also be used in the membrane filtration test.] 当无菌检查培养基用于供试产品无菌检查项下的培养基直接接种法时，按如下内容变更巯基醋酸盐液体培养基和大豆-酪蛋白消化物培养基的制备方法。向每一种培养基的容器中，以无菌操作转移足够灭活供试样品中所存在抗生素的β -内酰胺酶。使用此前已经对其青霉素或头孢菌素灭活能力进行了测定的 β-内酰胺酶配制品，来测定灭活该抗生素所必需的β -内酰胺酶数量。[注意：补充的β -内酰胺酶培养基也可以用于膜过滤试验] Alternatively (in an area completely separate from that used for sterility testing), confirm that an appropriate amount of β-lactamase is incorporated into the medium, following either method under .Method suitability Test, using less than 100 colony-forming units (cfu) of Staphylococcus aureus (see Table 1) as the challenge. Typical microbial growth of the inoculated culture must be observed as a confirmation that the β-lactamase concentration is appropriate. 或者（在与无菌试验所用场所彻底隔离的区域中），按照适应性试验方法项下的任意一种方法，使用少于100个菌落（cfu）的金黄色葡萄球菌（见表1）作为挑战，来确认适当数量的 -内酰胺酶已经被整合到该培养基中。必须观测到接种后培养物中出现典型微生物生长，才能确认 -内酰胺酶浓度是适当的。 Table 1. Strains of the Test Microorganisms Suitable for Use in the Growth Promotion Test and the Validation Test 表1 适合用于生长促进试验和验证试验中的试验微生物的菌株 Staphylococcus aureus 1 金黄色葡萄球菌 ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518 Bacillus subtilis枯草芽孢杆菌 ATCC 6633, CIP 52.62, NCIMB 8054,NBRC3134 Pseudomonas aeruginosa 2 绿脓杆菌 ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118,NBRC13275 Anaerobic bacterium厌氧菌 Clostridium sporogenes 3 产芽胞梭状芽胞杆菌 ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532 or ATCC 11437,NBRC14293 Fungi霉菌 Candida albicans白色念珠菌 ATCC 10231, IP 48.72, NCPF 3179,NBRC 1594 Aspergillus niger黑曲霉 ATCC 16404, IP 1431.83, IMI 149007,NBRC 9455 The media used comply with the following tests, carried out before, or in parallel, with the test on the product to be examined. 所使用的培养基须符合下列试验，这些试验应在检验供试产品之前或者同时进行。 Microbiological test 微生物检测 Sterility tests: 无菌试验 STERILITY 无菌状态 Incubate portions of the media for 14 days. No growth of microorganisms occurs. 将一部分培养基培养14天，不得出现微生物生长。 GROWTH PROMOTION TEST OF AEROBES, ANAEROBES, and FUNGI 好氧菌、厌氧菌、霉菌的生长促进试验 Test each lot of ready-prepared medium and each batch of medium prepared either from dehydrated medium or from ingredients 1 . Suitable strains of microorganisms are indicated in Table 1. 检查每一批已经配制好的培养基和每一批用脱水培养基或配料制备的培养基 1 。适当微生物菌株见表1。 Inoculate portions of Fluid Thioglycollate Medium with a small number (not more than 100 cfu) of the following microorganisms, using a separate portion of medium for each of the following species of microorganism: Clostridium sporogenes, Pseudomonas aeruginosa, and Staphylococcus aureus. Inoculate portions of Alternative thioglycollate medium with a small number (not more than 100 cfu) of Clostridium sporogenes. Inoculate portions of Soybean–Casein Digest Medium with a small number (not more than 100 cfu) of the following microorganisms, using a separate po