621 色谱法（HPLC）美国药典32附录

<621>色谱法 美国药典32附录 高压液相色谱法 高压液相色谱法（HPLC），有时称高效液相色谱法，是一个基于固体固定相和液体流动相的分离技术，通过分配、吸附或离子交换过程（随固定相的类型而定）实现分离。对于有机化合物的分析，HPLC具有明显的优势，超过气相色谱法。被分析化合物以合适的溶剂溶解，大多数分离在室温进行。从而，大多数药物，不挥发的或对热不稳定的化合物能够进行色谱分析，没有分解或制成挥发性衍生物的必要，大多数药物分析基于分配色谱法，并在30分钟内完成。 同气相色谱法一样，化合物的洗脱时间可以容量因子K’描述（见符号词汇表），它们取决于被分析物的化学性质，流动相的组成和流速以及固定相的组成和表面积、柱长是解析的重要决定因素。一个化合物有不同的容量因子，用HPLC可以分离。 仪器 液相色谱由盛流动相的容器、将流动相加以高压通过系统的泵、将样品引入流动相中的注射器、色谱柱、检测器和数据收集装置，如计算机、积分仪或记录器组成。含有紧密填充固定相颗粒的短的小孔径柱供给化合物在流动相和固定相之间迅速交换。除接受和 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 检测器输出以外，计算机过去经常控制色谱设置和操作，从而为长周期自动操作做准备。 泵送系统 HPLC泵送系统将适量的流动相由溶剂储槽中通过高压管和接头计量的输送至柱中。现代的系统由一个或多个更多计算机控制的能按照梯度色谱或混合等梯度流动相（即有固定相的容积比率的流动相）的需要程序设计改变流动相组分比率的计量泵组成。无论预混合的等梯度流动相成分的比率如何都比由大多数泵系统输送的能更精确地控制。操作压力达到5000磅/平方英寸，输送速率达到约10ml/min为标准，被用来定量的分析的泵应该用对腐蚀性的流动相组分不起化学作用的材料建造并且以恒定的流量、用最小的脉动、在持久的时间周期范围内输送流动相。 注射器 供色谱分析的化合物以流动相或其它合适的溶液溶解后用注射器或环形注射器二个手工操作或者用自动进样器自动地注射至流动相内，后者由夹住带盖顶的样品瓶（盖顶有刺破的隔膜或塞子）的旋转盘或台架和将样品由瓶中转移到环中的注射装置组成，由环中被载入色谱仪中。有些自动进样器可被设计程序控制样品体积、注射数量和环冲洗周期、两个注射之间的间隔以及其他的操作变量。 当柱头压力小于70个大气压（约1000磅/平方英寸）时，注射器可用来手工注射样品穿过隔膜，在较高压力必须用注射阀，有些阀系统结合一个校准过的环。 在另外的系统中，供试品溶液由注射器输送至一空腔中，然后切换进入流动相内。 色谱柱 对于大多数药物分析是通过供试品溶液中的化合物在流动相和固定相之间的分配达到分离的目的。系统由极性固定相和非极性流动相组成称作正相。当排列相反时，极性的流动相和非极性的固定相组成则称为反相色谱，分配色谱法几乎总是用于分子量小于1000的可溶性碳氢化合物。对于固定相的化合物的亲合力，因此它在柱上的保留时间由构成流动相的程度不同的极性来控制，流动相的极性通过补充第二个，有时第三个甚至第四个组分能够改变。 现代的固定相，反相液相色谱经典地由有机相键合二氧化硅或其他材料组成。颗粒通常是直径3-10μm，但是对于制备用柱大小范围可达50μm或更大。小的颗粒用有机相薄地涂覆为低质量传递提供保证。因此，使化合物在固定相和流动相之间快速传递。色谱柱极快取决于键合官能团的极性，范围由相对非极性的十八烷基硅烷到完全极性的腈基、液相、非键合固定相必须是大部分在流动相中不互混溶。虽然如此，通常要求将流动相用固定相预饱和防止固定相从色谱柱上剥离，在担体上涂铺的聚合固定相更为耐用。 供分析分离使用的色谱柱通常有2-5mm的内径，较大直径的柱用于制备色谱法，加热色谱柱可以产生更高效的分离，但是由于潜在的固定相降解或流动相挥发性，仅有极少数在60℃以上使用，除非各论中另有规定，色谱柱应在室温下使用。 离子交换色谱法习惯于水溶性的、可电离的、分子是小于1500的化合物，固定相通常为合成有机树脂，阳离子交换树脂含带有电荷活性部位，习惯于分离碱性物质，如胺类。而阴离子交换树脂有带正电荷的活性部位供分离带有负电荷基的化合物，如磷酸盐、硫酸盐或羧酸盐等。水溶性离子或可电离化合物被吸引到树脂上，在亲和力方面的差异导致色谱分离，流动相的pH、温度、离子类型、离子浓度及有机改性剂影响平衡，这些变数可被调节获得期望的分离度。 排阻色谱法 色谱柱用多孔的固定相填充，被色谱化合物的分子按尺寸被过滤，那些太大的进入孔中通过，未挡住的通过柱，较小的分子进入孔中并按照分子大小减小增加保留，这些柱典型地习惯于测定大分子的聚集和降解（见空间排除色谱法章节）。 检测器 许多药典的HPLC法要求使用分光光度检测器，这种检测器包括一个在柱端安装的流通池，一束紫外光穿过流通池进入检测器，当化合物由柱中洗提时，他们穿过流通池并吸收射线，导致可测定的能量水平变化。 固定波长、可变波长和多波长检测器是广泛使用的检测器。固定波长检测器在由低压汞灯发射的典型的254nm单一波长下操作，可变波长检测器包括一个持续光源，例如氘灯或高压氙灯，和一个单色仪或者在一个由操作者选择的波长下产生单色辐射的干扰过滤器。装有单色仪的可变波长检测器的波长准确度应该用其制造商介绍的方法进行检查。假若吸收波长与正确值相差3nm以上，按规定重新校准仪器。现代的可变波长检测器能设计出程序，在分析进行中改变波长。多波长检测器在两个或更多的波长下同时测定吸收度，在二极管阵列多波长检测器中，连续的射线穿过样品池，然后分解成其组成的波长，他们由光电二极管阵列分别地进行检测，这些检测器取得全部紫外—可见光范围内的吸收度数据，于是，以复杂的、选择的波长下的色谱图和洗脱峰光谱供给分析者。二极管阵列检测器通常比固定波长和可变波长检测器有较低的信噪比，因而较小的适于低浓度存在的化合物的分析。 差示折光检测器测定只有流动相和当他由柱中流出时含供试化合物的流动相的折射率之间的差，折光率检测器习惯于检测无紫外吸收的化合物，但是他们比紫外检测器的灵敏度低，对于溶剂组分、流速和温度中小的变化是灵敏的，因此参考柱可能需要得到符合要求的基线。 荧光检测器 对于自身发出荧光或通过化合物的化学转换或通过在特殊的官能团跟荧光试剂结合可转化成荧光衍生物的化合物是灵敏的。如果需要衍生的话，它可以在色谱分离之前或之后进行，刚好在进入检测器之前，将试剂导入流动相中。 电位检测器、电量检测器或极谱电化学检测器对于在工作电极上能被氧化或还原的那类物质的定量是有用的，这些检测器是选择、灵敏和可靠的检测器。但是要求进行流动相无溶解氧和可还原金属离子，必须采用脉冲泵并必须维护，保证流动相的pH离子强度和温度保持恒定。由于反应产品和随之发生的变量响应，工作电极易于污染。 具有碳糊电极的电化学检测器可以有利于用来测定ng（纳克）量的易氧化化合物，酚类和儿茶酚类。 试图克服使用时的那些缺陷继续开发新的检测器。 数据收集装置 现代的数据工作站接收和存储检测器输出并印出带有峰高和峰面积、样品鉴别及方法变量的完全的色谱，他们还用来编制液相色谱程序，控制大部分变量，为长周期的自动操作创造条件。 数据还可以收集在手工测定的记录器上或独立的积分仪上，按复杂性、数据范围由提供峰面积的打印到提供具有计算的峰面积和峰高的色谱和为后来的再处理储存的数据。 方法 流动相组分重要影响色谱的进行和待色谱分析混合物中化合物的溶解，对于准确的定量工作，必须使用高纯试剂和HPLC级有机溶剂，合适质量的水应该有低导电率和低的UV吸收，适合于预期的用途。 跟特殊型号的检测器（例如电化学，质谱仪）一起使用的试剂可以需要建立潜在干扰物的附加容限。对于容量因子K’，组分比温度的影响更大。 在分配色谱法中，分配系数 因此分离通过把其它组分加到流动相中能够改变，在离子交换色谱法中，pH和离子强度象流动相的组成改变一样也影响容量因子。在色谱运行过程中，连续改变溶剂组成的技术称为梯度洗脱或溶剂程序。检测器对溶剂组成的变化是敏感的，例如差示折光仪和梯度洗脱技术一起使用更为困难。 检测器必须有宽的线性动态范围，被测试化合物必须同任何干扰物分离。化合物的线性动态范围是检测器信号响应与化合物的量成正比的范围，对于定量工作中的扰性最大值，这个范围应是约三个数量级。HPLC系统通过绘制峰响应与已知参比标准品浓度的比较图，用外部或内部二个标化方法进行校准。 如果使用自动注射器或自动进样器，通过外部校准得到可靠的定量结果，此方法直接影响由分别色谱测定供试品和参比标准品溶液获得的峰响应的比。如果注射器注射，在高压所涉及的是不具有重现性，较好的是定量结果是通过内部校准法获得的，将已知量的非干扰化合物、内标物加到供试品和参比标准品溶液中，比较药物和内标物的峰响应的比例。 由于在设备、供应者以及技术方面的正常变数，需要系统适应性实验确保给定的操作系统可以广泛地适用。系统适应性试验的主要特性在下面描述。 关于解释结果的信息，见色谱解释节。