GB 478935-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验

中华人民共和国国家 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 GB 4789.35—2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验 National food safety standard Food microbiological examination: Lactic acid bacteria 中华人民共和国卫生部 发布 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施 GB 4789.35—2010 I 前 言 本标准代替GB/T 4789.35-2008《食品卫生微生物学检验 食品中乳酸菌检验》。 本标准与GB/T 4789.35-2008相比，主要变化如下： ——修改了乳酸菌总数、乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的计数方法。 本标准的附录A为规范性附录。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： —— GB 4789.35-1996、GB/T 4789.35-2003、GB/T 4789.35-2008。 GB 4789.35—2010 1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验 1 范围 本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lactic acid bacteria）的检验方法。 本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。 2 规范性引用文件 本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本 适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。 3 术语和定义 3.1 乳酸菌 lactic acid bacteria 一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属（Lactobacillus）、 双歧杆菌属（Bifidobacterium）和链球菌属（Streptococcus）。 4 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 4.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 4.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。 4.3 均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。 4.4 天平：感量 0.1 g。 4.5 无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。 4.6 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 4.7 无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。 5 培养基和试剂 5.1 MRS（Man Rogosa Sharpe）培养基及莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）改良 MRS 培养基：见附录 A 中 A.1。 5.2 MC 培养基（Modified Chalmers 培养基）：见附录 A 中 A.2。 5.3 0.5 %蔗糖发酵管：见附录 A 中 A.3。 GB 4789.35—2010 2 5.4 0.5 %纤维二糖发酵管：见附录 A 中 A.3。 5.5 0.5 %麦芽糖发酵管：见附录 A 中 A.3。 5.6 0.5 %甘露醇发酵管：见附录 A 中 A.3。 5.7 0.5 %水杨苷发酵管：见附录A中A.3。 5.8 0.5 %山梨醇发酵管：见附录A中A.3。 5.9 0.5 %乳糖发酵管：见附录A中A.3。 5.10 七叶苷发酵管：见附录A中A.4。 5.11 革兰氏染色液：见附录A中A.5。 5.12 莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）：化学纯。 GB 4789.35—2010 3 6 检验程序 乳酸菌检验程序见图1。 图1 乳酸菌检验程序图 7 操作步骤 7.1 样品制备 7.1.1 样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。 7.1.2 冷冻样品可先使其在 2 ℃～5 ℃条件下解冻，时间不超过 18 h，也可在温度不超过 45 ℃的条件 解冻，时间不超过 15 min。 乳杆菌计数 乳酸菌总数减去双歧杆菌 与嗜热链球菌计数之和 挑取双歧杆菌或乳杆菌菌落接种于 MRS 琼脂平板， 嗜热链球菌接种于 MC 琼脂平板（可选做） 报告 菌种鉴定 样品 25 g（mL）+225 mL 无菌生理盐水 10 倍系列稀释 选择 2 个～3 个适宜稀释度， 各以 0.1 mL 加入到 MRS 平板 进行涂布 选择 2 个～3 个适宜稀释度， 各以 0.1 mL 加入到 MC 平板 进行涂布 选择 2 个～3 个适宜稀释度，各以 0.1 mL 加入到莫匹罗星锂盐 （Li-Mupirocin）改良 MRS 平板进行涂布 厌氧， 36 ℃±1 ℃， 48 h±2 h 需氧， 36 ℃±1 ℃， 48 h±2 h 厌氧， 36 ℃±1 ℃， 48 h±2 h 乳酸菌总数计数 双歧杆菌计数 嗜热链球菌计数 GB 4789.35—2010 4 7.1.3 固体和半固体食品：以无菌操作称取 25 g 样品，置于装有 225 mL 生理盐水的无菌均质杯内， 于 8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，制成 1:10 样品匀液；或置于 225 mL 生理盐水的无菌均 质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min 制成 1:10 的样品匀液。 7.1.4 液体样品：液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品 25 mL 放入装有 225 mL 生理盐 水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成 1:10 的样品匀液。 7.2 步骤 7.2.1 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢注于装有 9 mL 生理盐水 的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀， 制成 1:100 的样品匀液。 7.2.2 另取 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做 10 倍递增样品匀液，每递增稀释 一次，即换用 1 次 1 mL 灭菌吸管或吸头。 7.2.3 乳酸菌计数 7.2.3.1 乳酸菌总数 根据待检样品活菌总数的估计，选择 2 个～3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取 0.1 mL 样品 匀液分别置于 2 个 MRS 琼脂平板，使用 L 形棒进行表面涂布。36 ±1℃ ℃，厌氧培养 48 h±2 h 后计数平 板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在 15min 内完成。 7.2.3.2 双歧杆菌计数 根据对待检样品双歧杆菌含量的估计，选择 2 个～3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取 0.1 mL 样品匀液于莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）改良 MRS 琼脂平板，使用灭菌 L 形棒进行表面涂布，每个 稀释度作两个平板。36 ±1℃ ℃，厌氧培养 48 h±2 h 后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂 布要求在 15 min 内完成。 7.2.3.3 嗜热链球菌计数 根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计，选择 2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取 0.1 mL 样品匀液分别置于 2 个 MC 琼脂平板，使用 L 形棒进行表面涂布。36 ±1℃ ℃，需氧培养 48 h±2 h 后计 数。嗜热链球菌在 MC 琼脂平板上的菌落特征为：菌落中等偏小，边缘整齐光滑的红色菌落，直径 2 mm±1 mm，菌落背面为粉红色。从样品稀释到平板涂布要求在 15 min 内完成。 7.2.3.4 乳杆菌计数 7.2.3.1 项乳酸菌总数结果减去7.2.3.2 项双歧杆菌与7.2.3.3 项嗜热链球菌计数结果之和即得乳杆 菌计数。 7.3 菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落 形成单位（colony-forming units，CFU）表示。 7.3.1 选取菌落数在 30 CFU～300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU 的 平板记录具体菌落数，大于 300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平 均数。 7.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释 度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以 2，代表一个平板菌落数。 7.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 GB 4789.35—2010 5 7.4 结果的表述 7.4.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平 均值乘以相应稀释倍数，作为每 g（mL）中菌落总数结果。 7.4.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算： …………………………………………(1) 式中： N——样品中菌落数； ∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d——稀释因子（第一稀释度）。 7.4.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可 记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 7.4.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于 30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计 算。 7.4.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。 7.4.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在 30 CFU～300 CFU 之间，其中一部分小于 30 CFU 或大于 300 CFU 时，则以最接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 7.5 菌落数的报告 7.5.1 菌落数小于 100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。 7.5.2 菌落数大于或等于 100 CFU 时，第 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前 2 位数字，后 面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。 7.5.3 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。 8 结果与报告 根据菌落计数结果出具报告，报告单位以CFU/g（mL）表示。 9 乳酸菌的鉴定（可选做） 9.1 纯培养 挑取 3 个或以上单个菌落，嗜热链球菌接种于 MC 琼脂平板，乳杆菌属接种于 MRS 琼脂平板，置 36 ℃±1 ℃厌氧培养 48 h。 9.2 鉴定 9.2.1 双歧杆菌的鉴定按 GB/T 4789.34 的规定操作。 9.2.2 涂片镜检：乳杆菌属菌体形态多样，呈长杆状、弯曲杆状或短杆状。无芽胞，革兰氏染色阳性。 嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状，直径为 0.5 μm～2.0 μm，成对或成链排列，无芽胞，革兰氏染色阳性。 9.2.3 乳酸菌菌种主要生化反应见表 1 和表 2。 dnn CN )1.0( 21 += ∑ GB 4789.35—2010 6 表1 常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应 表2 嗜热链球菌的主要生化反应 菌种 菊糖 乳糖 甘露醇 水杨苷 山梨醇 马尿酸 七叶苷 嗜热链球菌（S.thermophilus） － ＋ － － － － － 注:+表示90％以上菌株阳性；－表示90％以上菌株阴性。 菌种 七叶苷 纤维二糖 麦芽糖 甘露醇 水杨苷 山梨醇 蔗糖 棉子糖 干酪乳杆菌干酪亚种（L.casei subsp. casei） ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － 德氏乳杆菌保加利亚种（L.delbrueckii subsp. bulgaricus） － － － － － － － － 嗜酸乳杆菌（L.acidophilus） ＋ ＋ ＋ － ＋ － ＋ d 罗伊氏乳杆菌（L.reuteri） ND － ＋ － － － ＋ ＋ 鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus） ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － 植物乳杆菌（L.plantarum） ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 注:+表示90％以上菌株阳性；－表示90％以上菌株阴性；d表示11%～89%菌株阳性；ND表示未测定。 GB 4789.35—2010 7 附录 A （规范性附录） 培养基及试剂 A.1 MRS 培养基 A.1.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉粉 5.0 g 酵母粉 4.0 g 葡萄糖 20.0 g 吐温 80 1.0 mL K2HPO4·7H2O 2.0 g 醋酸钠·3H2O 5.0 g 柠檬酸三铵 2.0 g MgSO4·7H2O 0.2 g MnSO4·4H2O 0.05 g 琼脂粉 pH 6.2 15.0 g A.1.2 制法 将上述成分加入到 1000 mL 蒸馏水中，加热溶解，调节 pH，分装后 121 ℃高压灭菌 15 min～20 min。 A.1.3 莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）改良 MRS 培养基 A.1.3.1 莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）储备液制备：称取 50mg 莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）加入 到 50 mL 蒸馏水中，用 0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌。 A.1.3.2 制法 将 A.1.1 成分加入到 950 mL 蒸馏水中，加热溶解，调节 pH，分装后于 121 ℃高压灭菌 15 min～ 20 min。临用时加热熔化琼脂，在水浴中冷至 48 ℃，用带有 0.22 μm 微孔滤膜的注射器将莫匹罗星锂 盐（Li-Mupirocin）储备液加入到熔化琼脂中，使培养基中莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）的浓度为 50 μg/mL。 A.2 MC 培养基 A.2.1 成分 大豆蛋白胨 5.0 g 牛肉粉 3.0 g 酵母粉 3.0 g 葡萄糖 20.0 g 乳糖 20.0 g 碳酸钙 10.0 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1 000 mL 1％中性红溶液 pH6.0 5.0 mL GB 4789.35—2010 8 A.2.2 制法 将前面 7 种成分加入蒸馏水中，加热溶解，调节 pH，加入中性红溶液。分装后 121 ℃高压灭菌 15 min～20 min。 A.3 乳酸杆菌糖发酵管 A.3.1 基础成分 牛肉膏 5.0 g 蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 5.0 g 吐温 80 0.5 mL 琼脂 1.5 g 1.6%溴甲酚紫酒精溶液 1.4 mL 蒸馏水 1 000 mL A.3.2 制法 按 0.5%加入所需糖类，并分装小试管,121 ℃高压灭菌 15 min～20 min。 A.4 七叶苷发酵管 A.4.1 成分 蛋白胨 5.0 g 磷酸氢二钾 1.0 g 七叶苷 3.0 g 柠檬酸铁 0.5 g 1.6%溴甲酚紫酒精溶液 1.4 mL 蒸馏水 100 mL A.4.2 制法 将上述成分加入蒸馏水中，加热溶解，121 ℃高压灭菌 15 min～20 min。 A.5 革兰氏染色液 A.5.1 结晶紫染色液 A.5.1.1 成分 结晶紫 1.0 g 95％乙醇 20 mL 1％草酸铵水溶液 80 mL A.5.1.2 制法 将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 A.5.2 革兰氏碘液 A.5.2.1 成分 碘 1.0 g 碘化钾 2.0 g 蒸馏水 300 mL A.5.2.2 制法 将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至 300 mL。 A.5.3 沙黄复染液 GB 4789.35—2010 9 A.5.3.1 成分 沙黄 0.25 g 95％乙醇 10 mL 蒸馏水 90 mL A.5.3.2 制法 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。 A.5.4 染色法 A.5.4.1 将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染 1 min，水洗。 A.5.4.2 滴加革兰氏碘液，作用 1 min，水洗。 A.5.4.3 滴加 95 ％乙醇脱色，约 15 s～30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。 A.5.4.4 滴加复染液，复染1 min。水洗、待干、镜检。