石蜡切片的制作程序
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采集病料要及时,以防组织变质发生自溶。病理组织材料要采取病变典型突出的
部分,最好选病变与健康组织的交界处,以识别和探讨病变的发生和发展。组织块一
般不宜过大,以3~5mm×3~5mm×10~15mm为宜。过大过厚的组织块容易影响固定和
浸蜡的质量,不易切出较好的切片。采取病料时应保持器官组织的原来形状,用锋利
的刀剪切取,切勿挤压,损伤或扭折,以免造成人为的损伤。
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固定的目的是使组织和细胞的较粗大的结构尽量保持正常状态,避免发生形态学
结构变化,使细胞保持一定的硬度,以利于切片。采取的病料组织块应及时投入固定
液内进行固定,以防腐败。并做好标记,便于识别。固定液用量一般为组织块体积的
10~20倍。
固定剂的种类很多,一般能凝固或沉淀蛋白质及脂肪等成分的药品都可以做固定
剂。如:酒精、甲醛、冰醋酸、苦味酸、升汞等等。可以按照不同的目的来选择使用
固定剂,常用的固定剂主要是福尔马林(formalin 37~40%的甲醛),最适合固定的浓度为10%福尔马林(3.7%~4%甲醛),固定和保存时所用的溶液是指福尔马林的百分比,
而不是甲醛,例10%福尔马林溶液是10毫升的福尔马林加上90毫升的水配成。所以10%的福尔马林,实际上仅含3.7~4%的甲醛。
福尔马林易被氧化为甲酸,故常带酸性,为得到中性福尔马林可加吡啶、碳酸钙或
碳酸镁的方法使之中和。例如在100毫升的25%福尔林中加5毫升的吡啶;可使它的pH上升到7.0;10%的福尔马林可被过量的碳酸钙中和为pH6.4;如果用碳酸镁则为pH7.6。冲淡的福尔马林(10%)更易氧化,为了保持它的中性,可于其中放入几小块大理石。
福尔马林必须为无色透明,若贮藏时间较长或存放在温度太低会变混浊,呈絮状
物。为防止该现象的发生可提前加少许甘油以阻滞其聚合,沉淀物则可加热溶解,如
加热仍不能溶解,则可加等量热的0.8%碳酸钠或0.4%氢氧化钠(约60~70?)溶液,在室温放置2~3天,沉淀物就会消失。此时福尔马林淡了一倍,稀释时要相对地减少一
半,含有杂质的福尔马林,通常加热至98.7?蒸馏,可得30%的纯净福尔马林,稀释再用。
福尔马林作为单纯固定液,以贝克氏(Bakers’)改良为好。其配方如下:
蒸馏水 90毫升
福尔马林(37~40%)甲醛 10毫升
无水氯化钙 1 克
加氯化钙可改变固定液的渗透效应,更好地保存细胞原形。
材料自固定液中取出后,须立即冲洗,使其中含有的固定液全部除去,一直到洗
净为止。常用的冲洗方法如福尔马林固定的组织可用自来水缓缓冲洗,冲洗时间视固
定时间和组织块大小不同而异。一般挂于水笼头上冲洗6~24小时。
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脱水的目的在于使组织中的水分完全除去,并使组织变硬。各种材料经固定与冲
洗后,组织中就含有大量水分,而材料又逐渐变软,不能直接投入石腊中包埋,因为
水和石蜡是不相溶合的,一定要经过脱水剂将水分脱净,透明剂透明后,才能进行包
埋。
一般常用脱水剂为酒精、丙酮、二氧六环等。
脱水的方法是在室温下将脱水剂用水配成不同的梯度浓度,然后将组织块置入其
逐级进行脱水。如50%、70%、80%、90%、95%(各2小时),100%(?)100%(?)各1.5小时。
脱水时应注意每级中停留的时间依材料的大小、性质以及固定液的性质而定。但
不十分严格,柔软组织每级可停1~2小时,坚韧组织可停1~4小时。如需过夜,应停留在70%酒精中。
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组织块脱去水分之后,需经透明才能浸蜡。因为酒精等脱水剂与石蜡不能溶合,
必须经过一种既能与酒精等脱水溶合又能与石蜡溶合的溶剂的处理,才能使石蜡易于
浸入组织。
常用的这种溶剂有二甲苯、甲苯、苯、氯仿等。
一般过程是100%酒精“+”二甲苯(1:1)20分钟、二甲苯(?)15分钟、二甲苯(?)15分钟。
如果组织块有局部不能透明有呈白色混浊状态时,则是因脱水不彻底所致,应退
回重新脱水,然后再透明。
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组织块经透明之后,即可浸入已溶化之石蜡中使石蜡渗入组织内部,这一过程即
称为浸蜡,浸蜡的全过程应在恒温设备中进行,应注意控制温度。温度过低则石蜡凝
固成固相,不利于渗入组织;温度过高则组织受损变脆,不利于切片。
一般常用以54~56?溶点的石蜡为宜。如能在石蜡中掺入一些纯蜂蜡,更有利于
切片。将恒温箱(或锅)调至58?。
一般是二甲苯“+”石蜡(1?1)的混合液进行预处理约30分钟(亦在溶蜡的温度中进行),然后浸入纯石蜡(?)2~3小时、纯石蜡(纯石蜡?)2~3小时。
浸蜡必须彻底,否则组织内残留透明剂会造成切片过程的困难和影响切片的质
量。控制时间和温度,既要彻底浸蜡,又要时间短。
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将浸蜡完毕的组织块凝封在小蜡块中,这一过程你为包埋。在一定容器内(小纸盒、包埋框、小玻璃皿等)注入溶化之石蜡,将已浸的组织块置入其内(应使欲切之组织面向下),使蜡块迅速冷却硬固,组织块在蜡块中可长期保存。
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整修蜡块的目的在于使切成的蜡带成一直线,不发生弯曲,以便于镜检或作连续
切片,为了达到这一目的,整修时,须将石蜡块上下两面修成平等的面,这样切成的
蜡带就成直线。整修时应将上下左右多余的石蜡修掉,但也必须注意不要太靠近组织,
把组织裸露在外又会造成切片时易破碎的不良后果,所以组织四周的蜡层不应少于2毫米。此外,为了便于在蜡带上分开每一切片,可将石蜡块的一角切去。
旋转式切片机的切片方法:
先进行用具的准备:滑行切片机,切片刀,毛笔二枝,培养皿一套。然后将带有
蜡块的木块固定在切片机的标志夹内。将切片刀安装妥当,与组织块成15?夹角,调节切片机上的微动装置,使厚度计达到所需切的厚度,一般为6~8um,调节好刀口与组织块的距离便可开始切片。转动旋转轮柄,摇动一转可切下一片,弃去前几刀的切片,
待切片均匀平展时,用毛笔将切片粘下,置于温水(42~45?)中展片,切片完毕后,
切片刀和切片机必须注意清理和擦洗干净。
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待石蜡切片自然伸展平之后,用预先均匀涂一层贴片液(1?1蛋白甘油液)的载玻片轻轻地从水中捞取切片,拨正位置,控干水分,然后放入温箱内烘干(37~45?)约需2~4小时,或在温室中自然干燥(约需一夜),亦可将切片置于玻片上,再加少量
水,然后持玻片在灯上加温切片伸展。
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染色的目的在于使组织或细胞的不同成分之间有明显的对比色,以利于显微镜下
观察。石蜡切片常用苏木精,伊红对比色法(简称H?E染色)进行染色。
苏木精本身不是染料,需经氧化以后形成氧化苏木精才有染色作用。苏木精染料
一种配方如下:
哈里斯(Harris’s)苏木精:
配方:甲液
苏木精 0.5克
95%酒精 5毫升
乙液:
甲矾或铵矾(硫酸铝铵) 10克
蒸镏水 100毫升
氧化汞 0.25克
冰酸酸 几滴
配法:
(1)将0.5克苏木精溶解于5毫升95%酒精中。
(2)溶解10克钾矾或铵矾于100毫升的蒸镏水并加热煮沸。
(3)将上述两液混合煮沸半分钟,并加入0.25克氧化汞。
(4)很快地在冷水浴锅中冷却。
(5)冷却液过夜后用双层滤纸过滤,并加入冰醋酸几滴,以加强核的染色。此液
配制后可保存一、二个月。
伊红为染胸浆,胶原纤维,肌纤维及嗜酸性颗粒等常用染料,是一种酸性染料,
伊红的种类很多,名称也不统一。有伊红Y,乙基伊红(醇溶伊红)、伊红W(水溶性)等。
使用浓度一般用0.5~1%,染色时间30秒至数分钟。
脱蜡:将欲染的切片(贴附于载玻片上)浸入二甲苯(?)以溶去石蜡(15分钟),
再入二甲苯(?)洗涤(15分钟)、二甲苯“+”100%酒精(1:1)2分钟
用无水酒精(?)2分钟、无水酒精(?)2分钟以除去二甲苯。
依次在95%、85%、70%、50%各级酒精中浸泡各2分钟,再入蒸馏水2分钟,使
切片不致从高浓度酒精中骤然进水而脱落。
切片以Harris氏苏木液染10分钟。
用自来水泡洗2分钟,以洗去多余的染液及浮色。
用盐酸酒精分化(约1分钟,需摸索条件),使切片呈砖红色,然后水洗(约
1分钟),以脱去细胞质染上的苏木色素。
1%氨水兰化(约1分钟)或自来水15min,使组织返回兰色,镜下检查可见细
胞核染成兰色,胞浆无色,用蒸馏水泡洗约1分钟。
将玻片置于50%、70%、85%、95%酒精逐级脱水(约2分钟)。
浸入95%醇溶伊红染色5分钟,再经两次无水酒精各2分钟,以彻底脱水。
经二甲苯(?) 、二甲苯(?)透明,各8分钟,以除尽组织中的酒精成分,并
使切片呈透明状,以利观察。
树胶封固:切片在二甲苯(?)中取片,不等二甲苯干燥即滴上一滴中性加拿大
树胶,用右手持细镊轻轻地夹住盖玻片的右侧,并把它的左边放在树胶的左边,然后
左手持一解剖针扶住盖玻片的左边,右手将镊子松开逐渐下降,慢慢抽出,这样树胶
在盖玻片均匀地展开并将其中气泡排出。甲二甲苯擦干净出盖片周边多余溢出的树胶,
将切片置于平稳,干燥之处,稍加重压,待树胶干燥凝固,切片即可长期保存观察。
观察时应注意的事项:
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