应用SRAP和ITISJ标记分析苹果属种质资源亲缘关系（可编辑）

应用SRAP和ITISJ标记分析苹果属种质资源亲缘关系（可编辑） 应用SRAP和ITISJ标记分析苹果属种质资源亲缘关系 ...? ‘ 、 上 ??一 一:. . ,独创性声明 本人声明所呈交的 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名:番姻 时间:砂年舌月司日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印 或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在 不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 保密的学位论文在解密后应遵守此协议 时间:训年月司曰 研究生签名:鸯国乙礁‰ 导师签名: 时间:年/月衫日应用和 标记分析苹果属种质资源亲 缘关系 摘要 本研究应用和标记对苹果属种质资源进行了遗传多样性分析,采用 软件计算了供试材料的遗传相似系数,采用法绘制其聚类图,同时比 较了和的标记效率。 主要研究结论如下: .采用标记分析供试的份苹果属种质资源的遗传相似系数。研究表明供试 材料的遗传相似系数在.~.之间,其中相似系数最大的是东方苹果和道生苹 果,为.;最小的是窄叶海棠和湖北海棠,为.。 .基于分析获得的相似系数,绘制了其聚类图。以相似系数.为 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ,将 供试份苹果属种质资源材料分为组。第生.中有份材料,包括苹果组塞威士苹 果系 的个种类,常见的苹果砧木大部分属于本组。其中相似系数最大的东方苹果和道生苹 果,与槟子、楸子关系很近,自成一个小组。第组中有份材料,即毛山定子和大鲜果。 第组中有份材料,它们在世界苹果属植物分类系统中属于山荆子组和花楸苹果组。第 组中只有材料,即花楸苹果组的沧江海棠。第组中有份材料,包括绿苹果组中的 草原海棠和窄叶海棠。 .分别绘制了基于和标记的份苹果属砧木的聚类图。应用和 标记对份苹果属砧木进行了遗传多样性分析,分别得到了相近但不完全相同的 聚类图。出现聚类差异的原因可能与有限的引物及标记数量有关。 .比较了和分析的标记效率。在本研究中的标记指数值为 .,的值为.,标记的值是标记的值的.倍。其中, 位点平均信息量值分别为.和.,相差较小;有效多元比率值分 别为.和.,前者是后者的.倍,该差异是本研究中标己值高于 标记的主要原因。 本研究为苹果砧木育种过程中,科学选配杂交亲本,提高育种效率提供了理论基础。 关键词:苹果属;亲缘关系;遗传多样性;;?. . . : . .. .. . .豇 ., . . ..,.. . . .. . . . . ,. ,. ., .. ... .. . . . ,... .一. ... 。.. .,. . . . .. ,. ..... . .,. .: . .:; ; ; ;?目 录 前言? 文献综述分子标记技术??. .分子标记技术的发展及分类?一 .分子标记技术在果树种质资源遗传多样性和图谱构建上的应用苹果砧木培 育与使用概况. .国外苹果砧木的培育与使用?一 .国内苹果砧木的培育与使用?一 .研究目的与意义?. 研究内容苹果属部分种质资源亲缘关系的分析? .试验材料?.。仪器和试剂?一 ..主要仪器??. ..主要试剂??. .试验 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ..苹果基因组的提取?.. ..基因组纯度和浓度的 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 ...琼脂糖凝胶电泳检测??..?..?一 ...紫外分光光度计检测??一 ..苹果银染技术体系的建立?. ... 反应体系的建立... 变性凝胶电泳 ..引物的筛选? ..结果统计与数据分析. .结果与分析..基因组纯度和浓度的检测?一 ..引物用量和用量的筛选? .. 引物的筛选?.. ..苹果属种质资源亲缘关系的分析?.. ...多态性分析. ...聚类分析?. .讨论??. 苹果砧木遗传多样性和比较分析 .试验材料 .试验方法..苹果基因组的提取 .. 反应体系的建立??。 .. 反应体系的建立? .. 引物的筛选 .. 变性凝胶电泳..数据分析 .结果与分析.. .. 引物的筛选 ..多态性分析..标记效率分析? ..聚类分析 .讨论??一 .。 和分子标记技术在苹果种质资源遗传多样性研究中的可行性?~ .. 和分子标记技术标记效率比较结论..参考文献?一 附 录??..?... ?....?..?..??.??..?.?....?................??.............. ??...?...?.. .?.??: . ......?...?......?...?.?.?............ .?..........?.?....?....??.??...?............?..?.......??..??... ...??...??..?......??..??...........?..........?....?....?.. ..?.??..?.??.?.??..?....??...?......?. ....?...?.?..??.。......?。.?.?.?.......??..?..........?..?. ..??:::??.. ... .??...??.: .:;.?.??.?...??.?.?.? ..??. ...??.?...??.......??...。.?..。...。?。.?。。。? ... .??.?.?.??.??.?.: .. ........................................?..............?.............??.:? .... ... ?.?............?..........??...................................?................ .. ...??...........?.?......?........??..?.??....?........??..?.?....... .. ..?.?.?..?..........?...............?......?..................??....?..?....? 。。。.。。..。。.......。..。......。....。。??...。?.。......。.?.. 。....。...。..。..。.。。。,。。...。....。。....。。。??。?....?。..?....??. .. ...??.....??.?........??.......?.?... .. .. ............?...................??.??..?..........?.............?...?..........?.?.... .. .....?...?.?.............?..........?. ...??..?..??..?..........?.?..?.?..?.....?..........?..??.... ...?......?...??.....?...?..?.?...?..?.....?..?...?.??......?.?.?.... ...?.?................. ..??.:?.?. ..?..?..?.?... ....?.?...?......??.?.??.??....?....?.?.?..??.............??.?.....?.?.... .. ?...?.:.?...: .. ?..?......?.?............?.??.??.??.. ..??.......?..?.??...?....?.?..... . .......?.........................................?........?............................?...........................?.. ..........??......?...?.?.........??...........?.??...??.?.. ..??...........??.........??..............?.?..... ......,..。。..?..。.。..........。.。。....。....。.......??.。... .......。............。................?.?......... .......?.?....??..?....??.......??........??.......?.?.........?..?.? ..?.??..??.??.??.??.??...??:?.. ..】 ...??.??...?.??.?.?...?:;?一?:; 青岛农业大学 刚吾 .?一 刖舌 相关序列扩增多态性是年由 和根据基因组中基因外显子含量丰富,而启动子和内含子含量丰 富的特点开发出的一种分子标记方法,目前已在玫瑰【】,梅【】,百合【】,石榴‘,苹果【】 等物种上使用,在图谱构建、遗传多样性分析、比较基因组学等方面得到较满意的应用 结果。 张正圣等人在构建陆地棉的遗传图谱时,在引物的基础上设计了 ? 的正向和反向引物,用于内含子区域的扩增。该标记具有稳定性好,分析多态性强,成本低等优点。已在陆地棉,花生【,苹果【】等多种 作物上都得到成功应用,证明了标记技术的稳定性和可靠性。 本研究拟采用不同的苹果属植物为材料,应用和技术进行遗传多样性 分析,且对和标记在苹果属植物研究的可应用性进行探讨,并结合各材料 间关系分析比较两者的标记效率和多样性检测能力。以期为今后的苹果砧木遗传育种研 究提供理论基础和可靠的技术支持。文献综述 青岛农业大学 文献综述 分子标记技术 .分子标记技术的发展及分类 ,主要 目前,分子遗传标记主要分为四类:形态标记 ,主要是染色体核型和 是植物学形态特征标记;细胞学标记 带型等标记;生化标记 ,主要是同工酶和储藏蛋白等生化物 质的标记;分子标记 ,即核酸标记。理想的遗传标记应具备多 态性高、稳定遗传、遗传行为简单、能检测整个基因组、不受内外环境影响、操作经济 简单等基本特征【】。将四类标记进行比较发现,发现形态学标记、细胞学标记和生化标 记的共同之处有:信息量少、多态性不高、以基因表达结果为基础、是对基因的间接反 映。但是基因表达过程是受内外环境与基因之间的多重作用,因此形态学标记、细胞学 标记和生化标记检测的结果都不够全面和稳定。广义的分子标记一般是指可遗传并可检 测的序列、序列或蛋白质标记;而狭义的概念即被广泛采用的概念是 标记【。分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的 片段,是水平遗传变异的直接反映。标记具有数量多,多态性高;不受组织 类别、发育时期、环境条件等干扰;表现为中性,不影响目标性状的表达,与 不良性状 无必然的连锁遗传现象;检测手段简单、迅速等优点。标记以其显著的优点广泛 应用于动植物遗传育种、基因组作图、基因定位、基因测序、物种亲缘关系鉴定、基因 库构建、基因克隆等诸多研究领域,在植物遗传育种和基因组研究中发挥着越来越重要 的作用【。 通过分析锚定基因组中不同种类的位点或序列,应用一定的检测方法,已研究出多 种分子标记技术。大部分分子标记都以电泳谱带的形式表现个体之间的 差异【 。最先是以杂交为核心的分子标记技术,例如限制性片段长度多态性,标记多态性一般,共显 性标记,可靠性较高,重复性较好,但是试验周期较长,成本比较高。基于的 分子标记,根据所用引物的不同可以分为两类:随机引物标记和特异引物标 记,随机引物主要包括 随机扩青岛农业大学 文献综述 增多态性和勾部简单重复序列等;特异引物 包括 ,标记简单重复序列和 序列标记位点等。基于与限制性酶切技术结合的标记,有限制性片段长度多态性、 切割扩增片段长度多态性、 等。基于单核苷酸多态性的分子标记有标记 单核甘酸多态性。 抗病基因类似物、随机微卫星扩增多态标记、相关序列扩增多态性、 .内含子外显子拼接位点、标记 靶位区域扩增多态性标记是几种较新型的分子标记技术,各有 其优点和应用前景。 是年】和分别领导的个研究小组几乎同时发展起来的 一种分子标记技术,科学研究应用最早的标记技术之一。它采用随机的寡聚 核苷酸序列通常为作引物,对研究对象基因组进行扩增,扩增产物通 过电泳分离来显示扩增片断产物的多态性。的发展历史比较长,是应用最早 的标记技术之一,它以快捷、简便、不易受外界环境影响以及不需要预知基因组序 列,引物通用性强的特点与优势,己被广泛应用于动植物群体遗传结构分析、种质资源 的遗传基础研究、基因连锁标记、遗传图谱的构建、分子标记辅助育种等领域。但 易受实验条件影响,稳定性和重复性差等缺点限制了的应用发展【酬。年 等【】将’端锚定的微卫星核心序列与凡心引物结合起来进行基因组的多态性扩 增,并将这种方法称为随机扩增微卫星多态性 为了进一步改善的实践应用性,进一步将 ,。张永德等【 廿引物和微卫星上游引物或者下游引物结合进行基因组的扩增,并命名为随机 微卫星扩增多态,,同时应 用这种方法对只人工饲养朱鹃群体进行了遗传多样性分析,结果显示技术的 稳定性与多态性都较有所提高。 技术是由荷兰科学家和等人在和的基础上创建的, 年获得了欧洲专利局专利【】。利用了的可靠性和的高效性,它 用的引物在不知道序列的情况下,对基因组酶切片断进行选择性扩增,扩 增产物进行电泳分离检测,根据扩增产物片段长度的不同检测多态性。能够检测 出亲缘关系很近的材料之间的差异,是构建基因组的特定区段的高密度遗传连锁图谱很文献综述 青岛农业大学 有效的方法。标记多态性较好,显性或者共显性标记,可靠性较高,重复性也较 好,但是试验周期较长,成本也比较高。 标记 简单重复序列又称 短串联重复序列或微卫星 ,主要由串联重复单元组成,每个 单元长度一般在 之间。年,和扩增到了人类基因组序列, 并把这种序式定义为微卫星们。常见是双核苷酸重复,即和 每个微卫星的核心序列结构相同,重复单位数目.个,其高度多态性主要 来源于串联数目的不同及重复程度的不完全。标记的基本原理:尽管分布于基 因组的不同位置,但其两端多是保守的单拷贝序列,因此可以根据两端的序列设计一对 特异引物,通过反应扩增微卫星片段,由于核心序列串联重复数目不同,因而能够 用的方法扩增出不同长度的产物,将扩增产物进行凝胶电泳,根据分离片段的 大小决定基因型并计算等位基因频率【?。 总的来说具有以下几条优点: 检测快速、信息量大、多态性较好: 检测到的一般都是一个单一的多等位基因位点; 微卫星是共显性标记,因此可以 鉴别杂合子和纯合子; 所需量少,即便降解了也能有效地分析鉴定出。同时 分析的也有自身的缺点:在采用技术分析微卫星多态性时必须知道重复序 列两端的序列的信息,如不能直接从数据库查寻,必须针对每个染色体座位 的测定并找到其两端的单拷贝序列设计引物并筛选,因而使其开发成本高、工作量 大【。相关序列扩增多态性是年由 并根据基因组中基因外显子含量丰富,而启动子和内含子含量丰富 ,开放阅读框 的特点开发出的一种分子标记方法。提出了对 架进行扩增的标记。标记利用一个 的正向引物和一个 的反向 引物对基因组进行扩增。目前标记在不少物种的种内品种间及其不同种间的 图谱构建、遗传多样性分析、比较基因组学等方面得到了广泛的应用。此技术具有简便、 稳定、中等产率和容易得到选择条带序列的特点,在基因组中分布均匀,适合于不同作 物的基因定位、基因克隆和遗传图谱构建【】与技术相比更加稳定,较技术 在反映形态学变异和进化历史方面提供的信息更丰富【、更适于检测亲缘关系比较近的 品种之间的差别【。李慧芝【】应用技术对个葱品种进行鉴定和遗传关系分析。 徐宗大【应用凡神技术对玫瑰个品种和份野生种质进行了遗传多样性分析和品种 指纹图谱的构建。张俊卫【】利用标记对梅份样品进行了遗传多样性分析。张 春雨【采用分析了中国新疆野苹果个种下居群的群体遗传结构和遗传多样性,并 青岛农业大学 文献综述 对其资源保护提出了科学的建议。另外在百合【、石榴【】等物种上的使用 也都得到了较 满意的结果。也有学者把此技术用于属内种间亲缘关系与分类分析【。 张正圣等人在构建陆地棉的遗传图谱时,在引物的基础上设计了 ?的正向和反向引物,用于内含子区域的扩增。具有 稳定性好,分析多态性强,成本低等优点,已在陆地棉,花生,苹果等多种作物上都得 到成功应用,证明了标记技术的稳定性和可靠性。 .分子标记技术在果树种质资源遗传多样性和图谱构建上的应用 传统的果树育种与其他作物育种相比,具有周期长、难度大和效率低的特点。这主 要是因为,果树生长周期长,自交不亲和,遗传背景复杂,许多重要的经济性状是受多 基因控制的数量性状的影响。因此,加速育种进程和提高选育效率,以培育出适合生产 需求的新品种是果树育种所面临的重要课题。随着分子生物学技术的发展,特别是 分子标记技术的发展和应用,为果树新品种的定向选育、提高选育效率提供了新的技术 手段,给果树育种带来了新的机会。 果树在农业生产上占有重要的地位,世界各国也都越来越重视果树种质资源的保 护、收集和利用。对果树自然群体和人工培育品系的遗传多样性进行评价是 有效保护、 搜集和利用果树种质资源的根本基础。较为全面准确的了解现有果树种质资源的遗传多 样性,可以有效的提高果树育种工作中亲本选配的目的性,提高果树育种效率。遗传多 样,生 主要是指种内不同居群之间或同一个居群内不同个体遗传变异的 总和【,是生物多样性的基础和重要组成部分,保护生物多样性最终是要保护其遗传多 样性,因为一个物种的稳定性和进化潜力依赖其遗传多样性。在品种的鉴定和分类方面, 应用分子标记技术,能在较大的范围内对种质资源的遗传物质进行比较,从而提 高物种分类的可靠性和准确性。分子标记技术在众多果树的遗传多样性分析中得到应 用,涉及香蕉、苹果、梨、桃、杏、柑、橘、葡萄、柿、樱桃、梅、油橄榄、番荔枝、 树梅、番木瓜、枣等多种果树。 易干军等【】采用分子标记技术以个香蕉品种为试材进行聚类分析,结果将 其分为个独立群体,易干军等【】还以香牙蕉的个地方品种系为试材,用标 记分析其亲缘关系,鉴别认为引自不同国家的个品种“几内亚”、“苹果”以及“阳江矮” 为同一个香牙蕉品种。韩蕾【】等应用技术对种苹果砧木进行了遗传多样性 分析, 得到的聚类分析结果与供试砧木己知的系谱基本上一致。徐碧玉等应用技术, 采用个随机引物对个芒果品种进行鉴定,用同一引物可以初步分出个品种,且不文献综述 青岛农业大学 份葡萄材料进行 同产地之间的品种相似系数达到,%。吴子龙等【】应用标记对 了基因组多态性分析,份葡萄材料可分为大类群,山葡萄与欧业种、美洲杂种葡萄 的亲缘关系较远,欧业种与美洲杂种之间亲缘关系较近。苑兆和等【引,以准噶尔一伊犁 生态群新疆野杏、中亚生态群新疆栽培杏和李光杏、欧洲生态群和华北生态群的 个普通杏品种或材料为试材,以梅杏、辽梅杏和辽杏做外组,利用荧光标记对普 通杏个生态群的群体遗传结构进行了研究,分别对普通杏的遗传多样性,基因交流和 起源进行了科学合理的分析。 遗传图谱 又称连锁图谱 或遗传连锁图谱 ,是指以遗传标记已知性状的基因或特定序列问重组频率为基础的染色体 , 或基因位点的相对位置线性排列副。遗传图谱在数量性状位点 定位、标记辅助选择、基因的定位克隆、比较基因组研究等研究领域都具有重要的 理论和实践意义。已构建遗传图谱的果树有:苹果、葡萄、梨、柑橘、樱桃、桃、猕猴 桃、香蕉、橄榄、市亡果、枣、龙眼、荔枝、罗汉果、杏等十多种。 高平等【,以甜樱桃 .黄红皮品种“雷尼”为母本,红皮品种“.” 为父本杂交获得的株代群体为试材,利用、和分子标记进行遗 传分析,构建了含个连锁群共个分子标记条、条、对标 记的遗传图谱,全长. ,标记间的平均距离. 。中国科学院植物种植资 源加强和特色农业重点实验室、武汉植物园园艺中心果树分子育种学科首席科学家韩月 .教授开展合 彭研究员与美国伊利诺伊大学天然资源和环境科学系主任 作研究,通过对“.”和“?”杂交代的个后代个体的基因组序列进行 标记分析,构建并整合了苹果基因组的物理图谱和遗传图谱。相关研究论文发表在国际 权威期刊《实验植物学期刊》 上。 苹果砧木培育与使用概况 砧木对提高果树抗逆性和抗病性、控制树体生长势、扩大果树品种适应范围、提高 果实品质等具有重要意义,矮化密植栽培不仅果实产量高、品质好、早果早产而且方便 生产管理,已成为现代苹果产业的必然趋势,矮化砧木的选育及利用是实现矮化密植的 主要途径【。。 青岛农业大学 文献综述 .国外苹果砧木的培育与使用 世界各国在世纪初就开始了苹果优良砧木的选育工作。其中,英国东茂林试验站 开始的最早,选育的目标侧重于控制树体大小和丰产,并且取得理想的结果,发布出 系和系等优良苹果砧木,稍后德国、加拿大、瑞典、苏联、捷克、波兰、罗马尼亚、 美国、芬兰、日本等相继提出砧木育种 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 【】。培育出多个抗寒、矮化、易繁殖的优良 品系。 英国东茂林试验站,从年就开始收集英国和整个欧洲所有的苹果砧木,及亚洲 野生苹果砧木,根据形态和解剖学特征对其进行评价,并压条繁殖进行对比选育出系 被世人所公认。其中和应用较为广泛,为世界苹果生产做出了巨大贡献【。 系 砧木能使树体矮化,抗病,早实,提高品质且能明显增加产量,但它们繁殖较困难,根 系较浅,固地性差,易倒伏需要支撑,因此建园的投资较大。属于矮化砧木,也可 作中间砧,最早是法国人于年发现的偶然实生苗,压条繁殖易,硬枝扦插生根难, 根系弱,固地性差,树体易倾斜,嫁接树易折,需支柱,土壤适应性较差,易生根孽, 其不抗火疫病。俄罗斯、德国、美国、英国、波兰、加拿大、中国等多个国家都应用 和的自然实生选育或杂交选育筛选出了优良砧木品系。 是英国东茂林试验站的泰地曼和普瑞斯顿用和杂 交所得, 年发布,属于矮化砧木,树冠为嫁接在苹果实生砧上的.%,生长势和 固地性强于,无根孽,不耐湿地,耐冬季低温性好,耐土壤缺素;通过和杂 交选育出,矮化性强于,抗火疫病,比产量高‘】。 前苏联米丘林试验站,用当地的“红色标准”品种与杂交,选育出抗寒性强的 系砧木。矮化性近似,以其嫁接的苹果树丰产、早实,能抗.?低温,抗颈腐 病,压条生根较差,固地性中等,强于,适合做中间砧。用和?杂 交选育,属半矮化砧木,干性明显比大两倍左右,嫁接亲和力较强,压条生根良好, 抗寒性很强,.?无冻害。以和嫁接的树丰产性、早果性和固地性均较好。 但是,系砧木除外,有一个共性就是根蘖较多,嫁接口处容易膨大。我国先后引 进了、、、等与国内栽培品种进行嫁接鉴定。俄米丘林农大培育的 砧木为在极端寒冷的地区,建立耐寒集约型苹果园奠定了基础,不仅被俄罗斯及临近国 家的个地区采用,在国外如芬兰、加拿大、美国、波兰、荷兰及波罗的海国家也都 在研究和栽培。目前俄罗斯园艺业中部地区约%苹果园采用米丘林农大培育的砧木并 且新的集约型果园也以此为基础。主要采用的是?和?砧木。采用这些砧木 的果园:亲和力强,高度耐旱抗冻根系耐寒可达.。,可提前在第.年结果无需文献综述 青岛农业大学 支撑及补充灌溉。 加拿大利用和当地品种进行杂交选育出渥太华号。美国应用自然授粉选 育出系列,将脱毒后的矮化砧木命,在多个国家广泛应用。 系列是的自然授粉后代。德国的,波兰的系列也都以为亲本。 .国内苹果砧木的培育与使用 我国果树种质资源十分丰富,中国绵苹果自古就用无性繁殖,根据现有文字的记载, 已有多年的历史,最早用分株或压条,而后采用嫁接,砧木用苹果属小果类或共 砧。到世纪,开始引进西洋苹果后,砧木种类越来越多。各苹果产区应用的砧木品 种或类型接近种,但其中最常用的仅有多种协。 我国苹果园%以上为乔化栽培,常造成树冠大、园子密、光照差、成花少,对苹 果的产量和品质影响较大,而且管理成本较甜】。世纪旺年代,我国从国外引进 了多种优良苹果矮化砧木【,例如:英国的系和系、波兰的系、原苏联的系、 美国的系、加拿大的系等。并在全国开展苹果矮化砧木研究和推广应用工作取得了 不错的成果。山西省果树研究所自上世纪七十年代起先后选育出系、系、系、 系苹果矮化砧木。其主要性状可与英国的、、相媲美,几年来推广面积不断 扩大;是吉林省农科院果树所育成,目前为东北地区主要的矮化中间砧;牡 丹江园艺所培育的,通过三十多年观察,具有抗寒、树体矮小特点用其做中间砧 有致矮作用,与根砧和其上的栽培品种亲合好,接口无肿瘤,且丰产。 虽然我国积极引进国外优良砧木品种,国内亦大力开展砧木选育工作,但我国苹果 矮化砧木发展依然缓慢。苹果矮化砧木育种周期较长,从杂交组合的配置至优良砧木的 释放需要约年,仅是评价砧木的矮化性能需要约年【,很大程度的影响了苹果矮化 砧木在生产上的推广应用及其更新换代。从国外引进的大部分矮化砧木具有对肥水要求 高、根系浅的特性,不太适合我国果园的种植条件和栽培管理模式;而国内推出的几个 矮化砧木系列因苗木繁殖成本高、砧木整齐性差等问题尚未有大面积推广。李丙智 等多地调研后总结出缓慢的原因,主要可以概括为:矮化整形修剪技术跟不上导致树形 不适宜、中间砧入土深度不合适、没有很好地能适宜当地的矮化砧木良种、结果早树体 早衰等原因。 研究不同苹果砧木之间的亲缘关系,为矮化砧木的亲本选育提供科学的理论支持; 探索迅速准确的苹果矮化砧木预选方法,利于苹果杂种实生苗的早期筛选,降低田间管 理成本、加快矮化砧木育种进程【;培育适应我国气候条件、土壤类型和栽植方式的苹 青岛农业大学 文献综述 果矮化砧木;加强苹果矮化砧木繁育体系建设,完善矮化栽培技术推广等措施都能很好 的改善我国苹果矮化栽培落后的局势。 .研究目的与意义 苹果是高度杂合的物种,遗传背景十分复杂,品种繁多【】。关于应用形态学、细胞 学、同工酶【】以及分子标记技术研究苹果亲缘关系的研究已有很多报道【石】。本 研究拟采用和标记对苹果属植物进行遗传多样性分析,为科学配置苹果砧 木育种亲本的选择,杂交后代早起选择,缩短育种周期,提高育种效率等提供理论依据。 同时对和两者在苹果属植物研究中的可应用性进行探讨,并结合各材料间 关系分析比较两者的标记效率和多样性检测能力 砧木对提高果树抗性、控制树体生长势、扩大果树品种适应范围、提高果实品质等 具有重要意义。近年来苹果砧木育种使用的亲本材料主要集中在几个少数优良品系如 、系【,同时砧木的育种目标越来越倾向于解决区域性问题,例如高纬度地区培 育矮化、抗寒砧木等。杂交优势理论【】指出亲本亲缘关系越远,其后代中出现优良个体 的几率越大,越有利于提高育种效率。应用分子标记技术较准确地对苹果砧木进行亲缘 关系分析和遗传图谱的构建是做好苹果砧木育种工作的基础。随着生物分子技术的发 展,在苹果种质资源上的应用也取得了很大的成绩,应用两种标记联合分析 不同物种遗 传多样性的报道国内外也都有报道【彤】。但是将和标记联合应用到苹果属 植物的研究还未见报道。本研究应用和技术联合对种苹果砧木进行遗 传多样性分析,比较两者在苹果属植物研究中的可应用性,以期为分子标记 技术的有效 应用提供可靠地建议。 青岛农业大学 婴堂 .??. ?????????????????????????????????????????????????????????????? ??????????一一一 研究内容 苹果属部分种质资源亲缘关系的分析 .试验材料 供试材料表.中前份采自青岛农科院果茶所崂山资源圃,后份采自莱州 小草沟园艺场,材料中共包括个种或者种间杂交种。年月采集供试材料无虫 无病害的幼嫩叶片,冰盒保存带回实验室,。保存备用。 表.供试苹果属种质资源材料 . 系统分类归属 编号 种质名称 李育农, 青岛农业大学 研究内容 . .... 沧江海棠. . .绿苹果组 草原海棠.. .. 窄叶海棠. 栽培种 . 多花海棠.槟子. . . 楸子. 大鲜果.. 海棠花.? 未知 . 崂山柰子. 砧木 来源 .× 酸果红海棠 . . 口. 自然实生苗 . 自然实生 . . .自然实生 ?. 且 自然实生. 国光×河南海棠 . . . 国光×河南海棠 . . ..布达戈夫斯基乐园苹果. . 不详 . . .’ 布达戈夫斯基乐园苹果. .仪器和试剂 ..主要仪器 电子天平、磁力搅拌器、高速冷冻离心机、微量移液器、水浴锅、 扩增仪、微波炉、 型分光光度计、型琼脂糖水平电泳槽、 型稳压稳流电泳仪、摇床等。 ..主要试剂 本研究使用的所有引物都由上海生工生物技术服务有限公司合成,使用由宝 生物工研究内容 青岛农业大学,的 程大连有限公司生产的,其它试剂均购自青岛赛尚科贸有限公司。主要有溴 酚蓝、二甲苯青、 、 甲酰胺、 硼酸、、冰醋酸、过硫酸铵、剥离硅烷、亲和 硅烷、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、尿素、硝酸银、无水乙醇、 冰醋酸、氢氧化钠、甲醛等。 .试验方法 ..苹果基因组的提取 本试验对供试材料的幼嫩叶片采用法进行提取。 ..基因组纯度和浓度的检测 ...琼脂糖凝胶电泳检测 取溶解后的原液 ,加入 .稀释后。用稀释后的溶液 加入溴酚兰,在含. 溴化乙锭的浓度为.%琼脂糖凝胶,倍 电泳缓冲液,电压下进行电泳。待电泳?分钟后停止,取出凝胶,在 成像仪下观察电泳条带,并照相纪录。 ...紫外分光光度计检测 取原液稀释至 用 型紫外分光光度计测 定和下的吸光值,根据/的比值判断的纯度,并根据 备用。 仪器读数和稀释的倍数计算出的实际浓度,并将稀释至约为/ ..苹果银染技术体系的建立 苹果银染体系的建立,包括扩增、高压电泳和银染三部分。在反应体系 的配制过程中,为了保证酶的活性,应在冰浴上进行。反应体系应尽量做到现 配现用, 如果不立即进行反应,应将配制好的体系放置在冰箱中保存。 .。. 反应体系的建立 的反应体系:模板,/的正反引物各., 青岛农业大学 研究内容 的 .,补充至 。的 扩增程序为:预变性 ;。变性 ,。退火 ,延伸 , 进行个循环;。变性 ,。退火 ,。延伸 ,进行个循环; 延伸 ,保存。 ... 变性凝胶电泳 玻璃板的准备 取一套平板长短各一块,依次用双蒸水喷洒冲洗欲处理的一面次,然后使用% 的乙醇淋洗次。清洗后将玻璃板置于桌面上,用擦镜纸擦干,再干燥分钟。 待玻璃板干燥后,使用北京鼎国公司产生生物技术有限公司生产的剥离硅烷 和亲和 硅烷进行涂板工作,要注意戴手套操作,手套不可混用且两玻璃板应分开涂 布。将亲和 硅烷工作液涂布到长板上,剥离硅烷工作液涂布到短板上,涂布时应先横向再竖向均匀 地进行,玻璃板室温放置以上,使工作液完全晾干。待玻璃板完全晾干后,把长 板和短板的处理面贴合到一起,并放置到一个事先准备好的凹槽内,使用夹子将长板和 短板夹紧,将事先准备好的琼脂溶液灌入凹槽内至短板侧边的底部为止以防止漏胶而产 生气泡,待琼脂溶液完全凝固后可进行灌胶。 凝胶的制备 取%聚丙烯酰胺胶液加入 , %过硫酸铵溶液和 四甲基乙二胺并迅速轻摇混匀灌胶。 灌胶 将装配好的长板和短板置于水平的桌面上,使用水平仪将玻璃板调至水平状态。把 胶液沿短板上沿缓慢而连续地灌入玻璃板内,并且使用吸耳球轻轻拍打玻璃板,以保证 胶液均匀灌入并且不产生气泡。灌完后,将玻璃板调至水平,并将梳子平齐段插入胶液 深约处,插入时小心,不要将气泡带入胶液内。灌胶结束后让其聚合.小时, 待胶聚合之后将梳子轻轻地匀力拔出,使用蒸馏水将清洗胶面口和玻璃板, 冲洗掉碎胶, 以防止碎胶阻碍点样或 是电泳条带变形。将玻璃板擦干,防止电泳时短路或者漏电。 电泳槽的装配 胶凝聚合后将夹子卸掉,把玻璃板从凹槽中取出并组装到电泳槽上。上槽加入 缓冲液至没过梳孔,下槽加入 缓冲液至没过胶的下表面。上槽连接负极, 下槽连接正极。 预电泳研究内容 青岛农业大学 将电泳仪电源打开,恒定功率下电泳,可随机在部分点样孔内加入 以观察泳道是否出现偏离的状况。 电泳 预电泳结束后关闭电源,使用注射器将点样孔内残余的尿素吹打干净。将扩 增产物中加入. 并轻轻摇晃混匀。用移液器吸取产物加入点样 孔内。上样结束后,恒功率电泳小时。电泳结束后关闭电源,将缓冲液放出, 取下玻璃板。将两板小心分开,胶会贴合在涂有亲和硅烷的长板上,将此板进行银染。 银染 首先,将附着胶的长板放入盛有蒸馏水的搪瓷托盘中,把托盘放到摇床上摇动 漂洗.。漂洗结束后把胶板取出放入盛有染色液的托盘中,把托盘放到摇床上 摇 动染色。染色结束后把胶板换到另一盛有蒸馏水的托盘中,继续摇动漂洗 .。最后把胶板放置到盛有显色液的托盘内,在摇床上摇动。显色后将胶板 放到灯箱上进行观察并照相纪录。 ..引物的筛选 使用合成好的的正向引物个,反向引物个,引物碱基序列如表.和 表.所示。将正反向引物两两组合,共形成对引物组合,以崂山柰子、海 棠花、山定子与有亲缘关系的和五份试材,对引物组合进行筛选,从中选 择出电泳谱带清晰、多态性好的引物对用于对全部材料进行扩增。 表. 正向引物序列 . 正向引物 碱基序列’ 盯乾舛西嘶酊醯毋订青岛农业大学 研究内容 表. 反向引物序列 . 反向引物 碱基序列’? ..结果统计与数据分析 观察电泳图谱照片,统计清晰的多态性条带,凝胶相同迁移率位置上,有条带 记为 “”,同一位置没有条带记为?’,缺失记为“”,形成二元数据,并将数据记 录在 . 表格内。采用法在软件?,【进行聚类分析和相似系数计算。 .结果与分析 ..基因组纯度和浓度的检测 图. 法获得的电泳结果从左到右依次为:.对应表一中序号 : .. 青岛农业大学 研究内容 本试验采用法提取基因组,琼脂糖检测图片如图.。从图片中可 以看出电泳条带清晰,无拖带现象,点样孔清晰,质量较好可以进行下一步试 验。 对所提进行浓度测定,如表.所示大部分苹果品种在/的 比值在..之间,提取的纯度较高,受、多糖以及酚类等物质的污染程 度较小可以进行下一步试验。 表.应用紫外分光光度计法检测 ...引物用量和 用量的筛选 把加入引物/的量设个梯度.,肚,此,;加入的量设个梯度.此,.此,.此,.此; 加入 用 模板/肛;补充至此。进行引物用量和 量的筛选。引物用量和 用量的筛选。进行扩增后所得产物进行电 泳染色,结果如图.。 根据图.选择模板,/的正反引物各.,的 .此,补充至此的反应体系进行试验。 青岛农业大学 研究内容 蘩垂蠹鋈弼蠢羹饔鎏鏊鋈慧滋攀攀激 锩鹫霹攀溢鞲嚣逸::蠹:罐镶鳞强霪 囊罐鏊滋 瑟嚣筵鋈戆霪鎏嚣鏊程蓉曩冀蘸溅瑟嚣 落翳疆潞器殛麓辩辫辨褥淫 疆瓣纛瓣凝爨溪踅 图.引物用量和 用量的筛选 .... 引物的筛选 图.多态性引物对筛选图片 .. 确定了标记反应体系后,使用个具有代表性的品种,,, ,平邑甜茶对共个引物组合进行了筛选,希望能够得到具有良好多态性的 引物,以便使用该引物组合对供试品种进行区分,达到聚类分析的目的。引物 筛 选结果如图.。 通过筛选共选择出多态性较高,带型丰富,条带清晰的对引物,对所有供试材 料进行扩增。 ..苹果属种质资源亲缘关系的分析 ...多态性分析 ~?图.引物.在.号材料中的扩增结果注::同表:: .. 试验从对引物中筛选出对扩增条带清晰,多态性好的引物组合,对 份材料进行扩增图.为.引物的扩增电泳图,共扩增出个多 态性位点,其中多态性条带条,平均每对引物个多态位点表.为供试材料的 扩增结果,多态性比率达到.%。 表.供试材料的扩增结果分析 . 青岛农业大学 研究内容 ...聚类分析 根据对引物的扩增数据计算遗传相似系数,利用方法进行聚类。份 材料均能分开,其相似系数在..之间,说明在分子水平上各种材料间的遗 传多样性丰富。其中相似系数最大的是东方苹果和道生苹果为.,表明两者的 亲缘 关系最近。窄叶海棠和湖北海棠的相似系数最小为.。 以相似系数.为标准,可将供试的份种质分为组。第组:塞威士苹果、 森林苹果、新疆野苹果、东方苹果、道生苹果、红肉苹果、、 、海棠花、槟子、楸子、、西蜀海棠、褐海棠、 崂山柰子、、、?、、、??、 、一、共有种材料;第组:毛山定子、大鲜 果;第组:山定子、湖北海棠、平邑甜茶、小金海棠、小 金海棠多花海棠、沙金海棠、小金海棠共种材料;第 组:沧江海棠;第组:草原海棠,窄叶海棠。研究内容 青岛农业大学 鲫 卦 鄹 譬 :奠 :; :; :一 &量::艺: 图.基于数据绘制的份供试材料间的聚类图 . 从图.可以看出各种质资源之间的亲缘关系及其在系统图中的位置。第组苹果组 塞威士苹果系的六种材料都归于此组与传统系谱一致,其中东方苹果和道生苹果关系最 近,并与槟子、楸子关系很近自成一个小组,与张宁【结果一致,国内外很多学者认为 楸子没有野生种,是杂种起源的一个栽培种,李育农【】等用过氧化物同工酶谱分析,楸 子中含有塞威士苹果和山荆子的特征带,推测它与塞威士苹果有很近的亲缘关系。槟子 作为中国品种中的多型性种类之一,很多学者认为其亲本主要是中国苹果和 花红,但也 有一些类型的亲本为槟子与花红或槟子与楸子的天然杂种,出现各种各样的变异。本 研究中槟子和楸子相似系数为.,说明本试验材料中的槟子极有可能是槟子与楸子 的天然杂种变异。大部分苹果属的砧木也都归于第组,其中亲本相同的和 亲缘关系很近相似系数为.。第组毛山定子和大鲜果相似系数为.,亲缘关系较 .的自然 近。年在.的书中认为大鲜果是草原海棠与栽培苹果. 杂交种,而本研究中大鲜果并没有和草原海棠有较近的亲缘关系。在张宁【的研究中大 鲜果与同是山荆子组山荆子系的红花丽江山荆子分在一组,关系较近,与本研究结果一 青岛农业大学 研究内容 致。第组中的种材料在世界苹果属植物分类系统中属于山荆子组和花楸苹果组【?。花 楸苹果组的沧江海棠单独成第组,与其他种质亲缘关系较远。第组中包括绿苹果组中 的草原海棠和窄叶海棠。与其他供试材料之间距离比较远。这一组与传统系谱及其郭翎 等?。的研究结果均一致。 聚类图上分类结果和传统系谱图基本一致,但不完全相同。例如:新疆野苹果与塞 威士苹果有同祖关系【们。张宁【】的研究中认为二者亲缘关系很近,但仍存在一定差异。 本研究中的新疆野苹果与花楸苹果组滇池海棠系的西蜀海棠和沧江海棠亲缘关系较近。 分析原因可能有五:一:检测位点不足,所检测位点不能完全反应各种质之间的亲缘关 系。导致结果与传统系谱有所差异。二:苹果的高度杂合产生复杂的遗传多样性。三: 其它因素带来的相似性超过亲本的作用。四:供试品种少不足以反映各组之间较近的亲 缘关系。五:传统系谱分类有所不足,应该做出改动。 .讨论 野生苹果的历史久远,要确定其起源演化比较困难,并且即使同一种内也因地理位 置的不同而出现许多变种和变型。平邑甜茶是湖北海棠的一个变种,被聚在第三组;另 外第三组还包括了花楸组的三个小金海棠的变种小金海棠,小金海棠,小金海棠, 亲缘关系较近,三者之间小金海棠和小金海棠相似系数最小为.,小金海棠 与小金海棠和小金海棠相似系数分别为.,.。小金海棠与同为花楸苹果 组的沙金海棠关系较近。 崂山柰子作为当地很好的苹果砧木,与其亲缘相似系数在.以上的种质资源主要 是苹果组塞威士苹果系和花楸苹果组滇池海棠系,说明崂山奈子与这两组亲缘关系较 近。多花海棠花多且美,为苹果属植物中最有观赏价值的树种,且在抗性遗传基因在育 种上有的巨大潜力,本试验中多花海棠与山荆子组的几个品种关系较近,聚在一组与 高源等得研究结果一致。 砧木对提高果树抗逆性和抗病性、控制树体生长势、扩大果树品种适应范围等具有 重要意义。杂交优势理论【】指出亲本亲缘关系越远,其后代中出现优良个体的几率越大, 越有利于提高育种效率。因此较准确地对苹果砧木进行亲缘关系分析和遗传图谱的构建 是做好苹果砧木育种工作的基础。本研究试验材料中有种是杂交选育的优良苹果砧 木,其中.?、.、?是从俄罗斯引进的抗寒矮化砧木,三种材料都归于 第一组,相互之间相似系数平均为.,说明三者之间亲缘关系很近。其中. ? 与砧木和森林苹果相似系数为.; 与相似系数为.; 青岛农业大学 研究内容 .?与的相似系数为.亲缘关系较近。这对于有效的利用我国苹果属种质 资源进行良种培育具有重要的参考价值。本文聚类中,苹果组,山荆子组与花楸组的种 之间互有交叉,在郭翎【】的研究中也有这种现象。苹果属植物具多形性特点,仅 凭形态特征不能说明该属种类之间的亲缘关系。本文试验结果表明,技术对于更 好的揭示苹果属植物之间的亲缘关系,弥补传统分类学的不足,有重要的参考价值。苹果砧木遗传多样性和?比较分析 .试验材料 供试材料表.为个常用苹果砧木。 表.供试苹果砧木及其来源特性 . 序号 砧木 种名 来源 特性 . .× . 酸果红海棠 半矮化,抗寒 自然实生苗 矮化,压条繁殖 “脚【. 自然实生 矮化,抗寒,压条易.极矮化 . × 矮化,压条易 膨 . 自然实生苗 不抗寒半矮化易压 条 口.× 国光×河南海棠 矮化 .朋:口.× 国光×河南海棠 极矮化 . . 红色军旗 矮化抗寒 自然实生 矮化,抗寒,繁殖易 朋:口 自然实生 矮化,抗寒,繁殖易 ...×? 布达戈夫斯基乐园 半矮化,抗寒 苹果. . 不详 不详 抗寒 ... 布达戈夫斯基乐园 矮化,耐寒,抗旱 苹果. 山定子 . . 不详 乔木,抗寒 平邑甜茶 不详 . 抗涝抗寒,耐湿耐盐. 森林苹果 不祥 乔木 .一. 沧江海棠 不详 乔木适应高温多湿 . 环境 楸子 不详 乔木可做砧木 ... 槟子 .不详 . 小乔木可做砧木研究内容 青岛农业大学 .试验方法 ..苹果基因组的提取 苹果基因组提取同.. .. 反应体系的建立 反应体系和扩增程序同... .. 反应体系的建立.?,模板 的反应体系为: ,浓度为/的正反向引物各.,补充至此。扩增程 序为:?预变性,变性,火,?延伸,共个循 环,最后延伸, ?保存。 。. ? 引物的筛选 本试验所用的条引物均由上海生工生物技术服务有限公司合成见表., 表.。用,,,,平邑甜茶,森林苹果,进行引物筛选。 .. 变性凝胶电泳 用筛选得到的和引物分别对个苹果砧木进行扩增。扩增 产物采用%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,恒电压电泳. ,应用快速银染法进行 染色,拍照记录。银染体系的建立参照..., ..数据分析 分析图谱照片,统计各品种间的多态性条带,凝胶相同迁移率位置上,有条带 记为 “”,没有条带记为?’,形成二元数据。利用.软件中的方法分别计 算基于、的相似系数,并使用法进行聚类分析。 以分子标记指数冰 ,,“,,】比较不同标记的标记效率。 。为每次检测中有效检测位点数目。 的计算公式:/... 其中,代表样品第个扩增位点所占比例,代表扩增位点总数。 表. 正向引物序列 表. 反向引物序列 . 反向引物 碱基序列’. .. . . .结果与分析 .. 卜 引物的筛选 确定了标记反应体系后,使用个具有代表性的品种对共个引物组合进 行了筛选,得到对具有良好多态性的引物,以便使用该引物组合对供试品种 进行区分,达到聚类分析的目的。引物筛选结果图.。青岛农业大学 研究内 容 图.多态性引物对筛选图片 .. ..多态性分析 图. 引物.和引物.的扩增带纹