角蛋白酶论文枯草芽孢杆菌角蛋白酶基因kerC在毕赤酵母中的表达研究

角蛋白酶论文枯草芽孢杆菌角蛋白酶基因kerC在毕赤酵母中的表达研究 角蛋白酶论文:枯草芽孢杆菌角蛋白酶基因kerC在毕赤酵母中的表达研究 【中文摘要】角蛋白酶(keratinase)是一种可特异降解角蛋白的蛋白酶类。近年来角蛋白酶在多个领域中具有良好的应用前景,特别是在饲料生产中,通过角蛋白酶作用将废弃羽毛降解后作为动物饲料的添加剂,充分利用废弃的羽毛蛋白资源,这将改善蛋白质饲料短缺的现状。本研究利用DNA重组技术将来自于枯草芽孢杆菌B-3的角蛋白酶基因kerC表达在巴斯德毕赤酵母X-33中,成功实现了角蛋白酶基因kerC在真核表达系统中的高效表达,并对其酶学性质进行了研究,主要研究结果如下:1.根据枯草芽孢杆菌B-3角蛋白酶基因kerC(GenBank No.:JN021789), 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 去除信号肽并含有EcoRI和XbalI酶切位点的上下游引物,PCR扩增角蛋白酶基因kerC表达片段。测序表明,扩增kerC基因表达片段中3个碱基发生错义突变,致使3个氨基酸发生改变。对编码的角蛋白酶蛋白空间结构进行分析,发生改变的3个氨基酸部位未在其活性中心。2.将重组表达载体pPICZaA-kerC线性化后电击转化巴斯德毕赤酵母X-33感受态细胞,转化子经Zeocin的抗性筛选、PCR鉴定和酶活力测定,确定6株阳性转化子。重组菌株P.X.KC-9在以1%浓度的甲醇诱导培养108 h后,其酶活力最高,达到32.31U/mL,比活力为95.43 U/mg。3.测定该重组角蛋白酶的酶学性质,结果表明,重组角蛋白酶kerC的最适反应温度为60?,在30?-65?范围内能保留最高酶活的97%以上。kerC的最适反应pH为pH7 .5,在中性和弱碱性环境中对羽毛粉具有较强的降解能力,在pH7-8范围区间内能保持最高酶活的80%以上。在0.33 mM的离子作用浓度环境中,Fe2+、Co2+和Ca2+能增强kerC角蛋白酶的活力,其中Fe2+提高36.44%。Fe3+完全抑制重组角蛋白酶的酶活力,Na+、Mn2+、Zn2+、Mg2+和Cu2+也均15.56%-77.78%范围内,不同程度上抑制了重组角蛋白酶的酶活力。经SDS-PAGE分析,重组菌株P.X.KC-9表达的角蛋白酶的分子量约为31 KDa,与预测值相近。 【英文摘要】Keratinases are a group of proteolytic enzymes that can hydrolyze insoluble keratins.In recent years,keratinases have been used in the fields of leather processing,detergent manufacture and feed production.Therefore,keratinases have displayed satisfactory application performance and economic value. Particularly in animal feed additives,the bioconversion of chicken feather keratin into animal feedstuffs will ameliorate the shortage of protein feed.The keratinase gene kerC without leader sequence from Bacillus subtilis B-3 was cloned into vector pPICZaA for extracellular expression in Pichia pastoris X-33.KerC was expressed successfully in the Eukaryotic expression system, and the expression condition was highly improved.1.According to the sequence of keratinase gene kerC from Bacillus subtilis B-3,a pair of primers containing the restriction sites of EcoRI and Xball was designed and synthesized.The sequence of kerC without peptide sequence was amplified by PCR and cloned into vector pPICZaA,recombinant plasmid pPICZaA-kerC was constructed successfully.The amplified sequence of kerC generated three bases missense mutation that resulted in the change of three amino acids.According to the analysis of spatial structure for kerC,the site where the three amino acids changed was not in the active region of kerC.2.The recombinant plasmid pPICZaA-kerC was transformed into Pichia pastoris X-33,and the recombinant strains was screened by the zeocin,by PCR using genomic DNA as template and by keratinase activity assay.A maximum keratinase yield of 32.31 U/mL with specific activity of 95.43 U/mg was obtained in the culture supernatant when P.X.KC-9 transformant had grown for 108h with 1% methanol induction.3.The recombinant keratinase kerC showed activity at 30?-65?temperature range and the pH range is 7-8.5. However,the optimal temperature and pH value was respectively 60?and 7.5. For all the tested metal ions,the presence of 0.33mM of Fe2+,Co2+and Ca2+ could improve significantly the keratinase activity of kerC.About 1364.44% enhancement of keratinase activity was observed in the presence of Fe2+.Fe3+could inhibit completely the activity of kerC,and Na+,Mn2+,Zn2+,Mg2+and Cu2+had negative influ ence on the keratinase activity.The recombinant keratinase showed a molecular mass of 31 KDa as determined by SDS-PAGE. 【关键词】角蛋白酶 毕赤酵母 异源表达 酶学性质 【英文关键词】keratinase Pichia pastoris heterologous expression enzymatic characteristics 【目录】枯草芽孢杆菌角蛋白酶基因kerC在毕赤酵母中的表达研究 摘要 4-5 Abstract 5-6 1 前言 9-20 1.1 角蛋白的研究进展 9-12 1.1.1 角蛋白的分子结构 9-11 1.1.2 角蛋白的资源化利用 11-12 1.2 角蛋白酶的研究进展 12-16 1.2.1 产角蛋白酶的微生物 12-13 1.2.2 角蛋白酶的理化性质 13-14 1.2.3 角蛋白酶的降解机理 14-15 1.2.4 角蛋白酶编码基因的克隆及其异源表达 15-16 1.2.5 角蛋白酶的应用前景及展望 16 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统 16-19 1.3.1 巴斯德毕赤酵母表达系统的优点 16-17 1.3.2 巴斯德毕赤酵母表达菌株和载体 17-18 1.3.3 影响外源基因在巴斯德毕氏酵母中表达的因素 18-19 1.4 本研究的前期工作、目的及意义 19-20 2 材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 20-37 2.1 材料 20-24 2.1.1 菌株与质粒 20-21 2.1.2 主要试剂 21-22 2.1.3 常用缓冲液 22-23 2.1.4 角蛋白酶酶活力测定试剂 23 2.1.5 培养基 23-24 2.1.6 主要仪器 24 2.2 方法 24-37 2.2.1 角蛋白酶基因kerC重组表达 载体的构建 24-31 2.2.2 重组表达载体pPICZαA-kerC的电 击转化 31-32 2.2.3 高效表达菌株的筛选 32-34 2.2.4 重组菌株的诱导时间和甲醇浓度的优化 34 2.2.5 重组菌株的遗传稳定性分析 34 2.2.6 P.pastoris X-33诱导表达的角蛋白酶的酶学性质分析 34-36 2.2.7 重组角蛋白酶的SDS-PAGE分析 36-37 3 结果 37-47 3.1 重组表达载体pPICZα A-kerC的构建 37-40 3.1.1 kerC基因表达片段的高保真酶扩增 37 3.1.2 T-kerC阳性转化子的筛选 37-39 3.1.3 pPICZαA质粒与kerC基因的连接 39-40 3.1.4 大肠杆菌DH5α中重组表达载体pPICZαA-kerC阳性转化子的筛选 40 3.2 重组表达载体pPICZαA-kerC的转化和毕赤酵母X-33阳性转化子的筛选 40-41 3.3 重组菌株P.X.KC-9的诱导表达 41-43 3.4 重组菌株的遗传稳定性分析 43 3.5 P.X.KC-9表达的角蛋白酶的酶学性质分析 43-46 3.5.1 重组角蛋白酶最适反应温度的测定 43-44 3.5.2 重组角蛋白酶热 稳定性的测定 44 3.5.3 重组角蛋白酶最适反应pH的测定 44-45 3.5.4 重组角蛋白酶pH稳定性的测定 45-46 3.5.5 金属离子对重组角蛋白酶的影响 46 3.6 重组角蛋白酶的SDS-PAGE分析 46-47 4 讨论 47-51 4.1 角蛋白酶酶基因的克隆及表达 47-48 4.2 重组菌株的筛选及其诱导表达 48-49 4.3 重组角蛋白酶的酶学性质分析 49-51 5 结论 51-52 参考文献 52-56 致谢 56