基于群体感应系统的发光细菌水质毒性快速检测法的研究

基于群体感应系统的发光细菌水质毒性快速检测法的研究 基于群体感应系统的发光细菌水质毒性快速检测法的 研究 基于群体 感应系统 的发光细 菌 水质毒 性快速 检测 法的研究 重庆大学硕士学位 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 学生姓 名: 王 琳 指导教 师:叶 姜瑜 副教授 专 业:环 境工程 学科门 类:工 学 重庆大学城市建设与环境工程学院 二 O 一一年五 月Study on Quick Toxicity Test of Water Quality with Photobacteria Based on Quorum Sensing System A Thesis Submitted to Chongqing University in Partial Fulfillment of the Requirement for the Degree of Master of Engineering By Wang Lin Supervised by Ass. Prof. Ye JiangyuMajor: Environmental Engineering College of Urban Construction and Environmental Engineering of Chongqing University, Chongqing, China May, 2011重庆大学硕士学位论文 中文摘要 摘 要 随 着 环 境 的 恶 化 , 人类 对环 境 监 测 的 要 求 越 来 越 高 。 发 光 细 菌 法 是 利 用 发 光 细 菌 与 毒 性 物 质 接 触 时 发 光 强 度 的 变 化 来 衡 量 有 毒 物 质 的 综 合 毒 性 。在 发 光 细 菌 法 中 通常 使 用 发 光 细 菌 冻 干 粉 作 为 介 质 进 行 监 测 , 但 是 冻 干 粉 的 复 苏 时 间 长 、 复 苏 后 发 光 不 稳 定 , 以 及 发 光 细 菌 冻 干 粉 的 冷 冻 保 护 剂 保 护 效 果 不 佳 等 问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 制 约 着 其 在 环 境 监 测 中 的 应用 。 发光 细菌 的 群 体 感 应 系 统 是 利 用 细 菌 产 生 并 分 泌 到 细 胞 外 的内酯类物质(N- 酰基高丝氨酸,AHL ) 作 为 信 号 分 子 对细菌的发光进行调节 的 生 理 过 程 。 利 用 信 号 分 子 对 细 菌 发 光 的 促 进 作 用 , 将 其 添 加 到 冻 干 粉 的 复 苏 液 中 , 使 发 光 细 菌 冻 干 粉 在 信 号 分 子 的 作 用 下 更 快 速 的 复苏 ; 同 时 研 究 了 冻 干 粉 的 最 佳 复 合 冷 冻 保 护 剂 , 使 其 最 大 限 度 的 使 发 光 细 菌 免 受 低 温 干 燥 的 伤 害 , 使 之 能 够在环境监测中响应更加快速、准 确。研究主要包括以下内容: 对 实 验 室 分 离 保 存 的 发 光 细 菌 进 行 了 菌 种 鉴 定 并 研 究 了 其 生 理 特 性 。 鉴 定 结 果表明所分离的菌种为费氏弧菌, 其在接种 24 h、22 h 时分别达到最大细菌密度 和发光强度, 在细菌生长过程中 pH 值基本上维持在 6.5 左右, 在此范围内的, 信 号 分 子 的 结 构 稳 定 。 菌 液 中 的 信 号 分 子 浓 度 随 着 菌 密 度 的 增 加 而 增 加 , 并 于 接 种 14 h 后达到最大浓度,随后 维持稳 定直到细菌生长进入衰亡期。 为了改善 费 氏 弧 菌 冻干粉 的 复 苏 效 果 , 对 冻 干 粉 的 复 合 冷 冻 保 护 剂 进 行 了 研 究 。 研 究 发 现 由 15% 脱脂乳、5% 甘油、12.5% 海藻糖溶于水 后 制 成 的 复 合 冷 冻 保 护 剂 能 够 有 效 的 使 细 菌 在 经 历 了 冷 冻 干燥 过 程 后 生 存 下 来 。 在 此 冷 冻 保 护 剂 的 保 护下,冻干粉能够在-20?条件下至少保存 6 个月。 通过研究 不 同 浓 度 信 号 分 子 对 费 氏 弧 菌 生 长 、 发 光 和 冻干粉 复 苏 影 响 ,发现 信 号 分 子 的 加 入 对 细 菌 生 长 影 响 较 小 , 而 对 细 菌 发 光 强 度 有 很 明 显 的 促 进 作 用 , 能使费氏弧菌 初始发光的时间 和达到最大发光强度的时间分别 提前 6 h 和 8 h;信 号分子对 冻干粉的复苏也有作用, 不但使其复苏时的发光强度增加, 同时含有 15% 上清液的复苏液能够时冻干粉的发光 强度在 5 min 即达到 稳定, 这 使环境监测时冻 干粉的复苏时间从传统的 15-30 min 缩短到 5 min ,大大 提高监测效率。 在将 改 良 后 发 光 细 菌 法 运 用 于 环 境 监 测 时 , 先 将其 对 常 见 的 金属 化 合 物 的 毒 性进行 检 测 , 发 现 冷 冻 保 护 剂 的 加 入 对 冻 干 粉 的 毒 性 测 定 准确性 没 有 影 响 , 随后 将 其 应 用 于 工 业 废 水 的 毒 性 检 测 。 在 群 体 感 应 系 统 的 作 用 下 , 发 光 细 菌 法 能 够 快 速、准确的响应水质综合毒性,其测定结果 与废水的可生化性 呈一定的相关性。 关键词 : 发光细菌,群体感应,信号分子, 环境监测 I 重庆大学硕士 学位论文 英文摘要 ABSTRACT Along with the decrease of environmental quality, the demand for environmental monitoring is higher. Luminescent bacteria test can reflect compositive toxicity of pollutant quickly by detecting the changes of relative luminescent unit, so it is widely used in environmental monitoring field. Photobacterium freeze-dried powder was used in luminescent bacteria test, commonlyBut the disadvantages, such as long resuscitation time and unstable luminescence, restrict the employ of it. In photobacteria quorum sensing systemQS, N-acyl-homoserine lactones AHL was used to regulate the luminescence of bacteria as signaling molecules, which was exudated by bacteria and could diffuse in and out of bacterial cells. In the study, signaling molecules were added to advance the luminescence of bacteria; at the same time, the optimumcryoprotectants was studid to keep bacteria from the damage of hypothermy and dryness during the process of freeze-dried powder made, both of these were in order to make the freeze-dried powder used in environmental monitoring can make it more quickly and accurate. All the content in study were following:The physiological character of vibrio fischeri which was purificated in the lab was studied first: imum of OD and RLU appeared at the time cultured for 24 h and 600 22 h, and the pH fluctuated around 6.5. Under the condition the AHL can show good stability. The concentration of AHL cumulatd along with the increased of the bacteria population, reached the imum after 14 h, and then keep steady till the entering of decline phaseIn order to improve the resuscitation quality of photobacteria freeze-dried powder, the optimizing complex cryoprotectants was study. The cryoprotectants which was made up of 15% skimmed milk, 5% glycerol, 12.5% trehalose got the highest resuscitation rate 99%. Under the protection of it, photobacterium freeze-dried powder can conservat for at least 6 months at -20?The effect of signaling molecules on grouth and luminescence of vibrio fischeri and the resuscitation of vibrio fischeri freeze-dried powder was study. The addition of AHL had little effect on the growth of photobacterium, but boosted the luminescence a lot, the addition of AHL can bring the time when photobacteria luminece preliminarily 6 hours forword, and the time when the imum of luminous intensity reached 8 hours earlier. Resuscitation solution which had signaling molecules can not only strengthen the luminescence, but also stabilized the luminescence in 5 min, which can make the II 重庆大学硕士 学位论文 英文摘要 resuscitated time reduce from 15-30 min in the standard method to 5 min Wheather the addition of cryoprotectants influence the veracity of freeze-dried powder used in environmental monitoring, four metals had been tested first, and the results were the same as standard method, so the cryoprotectants had little influence on the use of freeze-dried powder. Used the freeze-dried powder in the monitoring of industry waste, on the effect of QS system, luminescent bacteria test can reflect compositive toxicity of pollutants quickly, and the outcomes revealed that the results of luminescent bacteria test had relativity with wastewater's biochemical ability in a certain extent Keywords: Photobacteria, Quorum sensing, Signaling molecules, Environmental monitoring III 重庆大学硕士 学位论文 目 录 目 录 中文摘 要. I 英文摘要II 1 绪 论 1 1.1 环 境 监测方 法 研 究现状. 1 1.2 发 光 细菌在 环 境 监测中 的 应 用. 2 1.2.1 发光细 菌的种类. 2 1.2.2 发光细 菌的发光及毒性监测的原理2 1.2.3 发光细 菌在环境监测中的应用. 2 1.2.4 发光细 菌毒性测试结果的表示 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 3 1.2.5 发光细 菌法在环境监测中遇到的问题. 4 1.3 细 菌 的群体 感 应 系统4 1.3.1 革兰氏 阳性菌的群体感应系统. 5 1.3.2 革兰氏 阴性菌的群体感应系统. 5 1.3.3 细菌之 间的群体感应系统 7 1.4 群 体 感应的 信 号 分子8 1.4.1 信号分 子的影响因素8 1.4.2 信号分 子的检测方法9 1.5 发 光 细菌的 群 体 感应系 统. 10 1.6 课 题 研究目 的 与 研究内 容. 11 1.6.1 研究目 的11 1.6.2 研究内 容11 2 发光细菌 生 理 特 性 的 研 究 12 2.1 材料. 12 2.1.1 菌种. 12 2.1.2 菌株培 养基及培养条件12 2.1.3 试剂和 仪器. 12 2.2 方法. 13 2.2.1 培养基 及试剂的制备 13 2.2.2 菌种的 活化与培养. 13 2.2.3 发光细 菌 16S rDNA 序列分析 13 2.2.4 发光细 菌生长发光曲线的测定14 IV 重庆大学硕士 学位论文 目 录 2.2.5 发光细 菌培养过程中 pH 值的测 定. 14 2.2.6 发光细 菌培养过程中信号分子的测定14 2.3 结 果 与讨论. 15 2.3.1 发光细 菌发光特征. 15 2.3.2 发光细 菌菌种鉴定. 16 2.3.3 费氏弧 菌生长发光曲线17 2.3.4 费氏弧 菌生长过程信号分子和 pH 值变化曲线18 2.4 小结. 19 3 费氏弧菌冻干粉 冷 冻 保 护 剂 的优化 20 3.1 材料. 20 3.1.1 菌种及 其培养条件. 20 3.1.2 试剂和 仪器. 20 3.2 方法. 21 3.2.1 菌种的 收集. 21 3.2.2 最佳保 护剂配比的选择21 3.2.3 冻干粉 的制作与复苏 21 3.2.4 保护剂 对冻干粉发光特性的影响测定22 3.2.5 冻干粉 保藏方法的对比和保藏时间的测定 22 3.3 结 果 与讨论. 22 3.3.1 发光细 菌冻干粉的制作22 3.3.2 最佳保 护剂的配比. 22 3.3.3 保护剂 对冻干粉复苏的影响 23 3.3.4 冻干粉 保藏方法及保藏时间 24 3.4 小结. 25 4 信 号 分 子 对 费 氏 弧 菌 发 光 的 影 响26 4.1 材料. 26 4.1.1 菌种及 其培养条件. 26 4.1.2 试剂和 仪器. 26 4.2 方法. 27 4.2.1 信号分 子溶液的制备 27 4.2.2 费氏弧 菌冻干粉的制作27 4.2.3 信号分 子溶液对费氏弧菌生长发光的影响 27 4.2.4 费氏弧 菌冻干粉毒性测试条件的确定27 4.3 结 果 与讨论. 27 V 重庆大学硕士 学位论文 目 录 4.3.1 所配制 溶液中信号分子的浓度27 4.3.2 信号分 子对费氏弧菌生长发光的影响28 4.3.3 最佳毒 性测试条件. 29 4.4 小结. 33 5 发 光 细 菌 在 环 境 水 质 监 测 中 的 应 用 34 5.1 材料. 34 5.1.1 菌种及 其培养条件. 34 5.1.2 试剂和 仪器. 34 5.2 方法. 34 5.2.1 冻干粉 制作方法34 5.2.2 毒性测 定方法 34 5.2.3 工业废 水指标测定方法35 5.3 结 果 与讨论. 36 5.3.1 金属毒 性测定 36 5.3.2 工业废 水毒性测定. 37 5.4 小结. 40 6 结论与建议41 6.1 结论. 41 6.2 建议. 42 致 谢. 43 参考文献. 44 附 录. 49 作者在攻读硕士学位期间发表的论文 目录. 49 VI 重庆大学硕士 学位论文 1 绪 论 1绪 论 1.1 环境监测方法研究现状 随 着 工 业 、 农 业 的 快 速 发 展 , 排 出 的 “ 三 废 ” 物 质 日 益 增 多 , 且 成 分 复 杂 , 危 险 性 大 。 目 前 已 有 大 量 的 空 气 、 水 体 、 土 壤 受 到 了 严 重 的 污 染 , 已 经 影 响 到 人 类 的 生 活 和 生 产 , 人 类 面 临 的 环 境 环境 问题 也 日 益 严 峻 , 于 是 环 境 监 测 越 来 越 受 到 重 视 。 环 境 监 测 是 通 过 对 影 响 环 境 质 量 的 代 表 值 的 测 定 , 确 定 环 境 质 量 ( 或 污 染 程 度 ) 及 其 变 化 趋 势 , 目 的 是 准 确 、 及 时 、 全 面 地 反 映 环 境 质 量 现 状 及 发 展 趋 势 , 为 环 境 管 理 、 污 染 源 控 制 、 环 境 规 划 等 提 供 科 学 依 据 。 常 用 的 环 境 监 测 的 方 法分为化学监测、物理监测和生物监测。 化 学 物 理 监 测 法 是 以 化 学 物 理 方 法 为 基 础 对 环 境 中 的 指 标 进 行 测 定 。 如 利 用 重量法测 定残渣、 降尘、 硫酸盐等, 利用容量分析法测定水中酸碱度、COD 、DO 、 硫 化 物 、 氰 化 物 等 ; 利 用 仪 器 分 析 方 法 对 环 境 中 的 污 染 物 进 行 定 性 和 定 量 分 析 , 利 用 分 光 光 度 法 测 定 金 属 、 无 机 非 金 属 ; 利用 气 相 色 谱 法 测 定 有 机 物 的 含 量 ; 利 用紫外光谱、 红外光谱、 质谱及核磁共振等技术对污染物的状态和结构进行分析; 等离子体发射光谱可以用于对 20 多种元素的分析; 原子荧光光谱可用于一切对荧 光具有吸收能力的物质。在有毒有害有机污染物分析方面,GC-MS 用于 VOCs 和 TVOCs 及 氯酚类、 有机氯农药、 有机磷农药、PAHs 、 二?英类、PCBs 类 的 分析; HPLC 用于 分析 PAHs 、 苯胺类、 酞酸酯类、 酚类等的分析;IC 法用于 AOX 、TOX 的分析;化学发光分析对超痕量物质的分析也已 应用到环境监测中。 由 于 环 境 污 染 不 仅 是 化 学 因 素 , 还 有 物 理 因 素 , 如 噪 声 、 振 动 、 光 、 热 、 电 磁 辐 射 、 放 射 性 联 合 作 用 的 结 果 , 对 环 境 污 染 情 况 的 监 测 仅 对 某 一 地 点 、 某 一 时 刻 、 某 一 种 类 或 几 类 物 质 的 监 测 是 不 够 的 , 所 以 用 生 物 的 受 害 症 状 等 的 变 化 作 为 环境质量的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 更为准确可靠。 生 物 监 测 是 利 用 植 物 、 动 物 、 微 生 物 在 污 染 环 境 中 所 产 生 的 各 种 反 映 信 息 来 判 断 环 境 环 境 质 量 的 方 法 , 是 一 种 最 直 接 也 是 最 综 合 的 方 法 。 生 物 监 测 包 括 生 物 体内污染物质含量的测定, 观察生物在环境中受伤害症状, 生物的生理生化反应, [1] 生物群落结构和种类变化等手段来判断环境质量 。 传统的生物监测法是用鱼类或蚤类与有毒物质接触, 通过测定生物的 LC (半 50 致 死 浓 度 ) 判 断 毒 性 的 大 小 , 这 种 方 法 往 往 耗 时 长 、 费 用 高 、 灵 敏 度 低 , 造 成 环 境 污染 的 生 物 监 测 方 法 可 操 作 性 差 , 应 用 起 来 比 较 困 难 。 发 光 细 菌 法 是 利 用 发 光 细 菌 发 光 的 生 理 特 性 , 当 细 菌 与 有 毒 物 质 接 触 时 发 光 强 度 会 发 生 改 变 , 利 用 发 光 强 度 的 变 化 程 度 来 判 断 毒 物 毒 性 的 大 小 。 作 为 一 种 新 型 的 环 境 监 测 手 段 发 光 细 菌 法以其操作方便、价格低廉、实验周期短等优点受到越来越广泛关注和应用。 1 重庆大学硕士 学位论文 1 绪 论 1.2 发光细菌在环境监测中的 应用 1.2.1 发 光细菌的 种类 目前 , 发现 存 在 发 光 现 象 的 有 某 些 真 菌 和 细 菌 。 已 发 现 并 命 名 的 真 菌 大 约 有 100 多种 ,分属 19 个属中, 多在枯叶、树上、植物果实、甜菜等机体上 发现。发 光细菌 的数量远远多于真菌, 约有 200 多种。常见的发光细菌有以下几种: 发光 异短杆菌Xenorhabdus luminescens ; 明亮发光杆菌Photosbacterium phosphoreum 、 鳆发光杆菌P. 1eiognathi ; 羽 田 希 瓦 氏 菌Shezoanella hanedai ; 哈维氏菌Vibrio harveyi 、 美丽弧菌V. splen ?didus biotype I 、火神 弧菌V. 1ogei 、费氏弧 菌Vfischeri 和 东 方 弧 菌V .orientalis 、 地中海弧菌V. mediterranei 、 霍乱弧菌Vcholerae 、 青海弧菌 (V. qinhaiensis ) 。 大多数 发光细菌生活在 浩瀚的大海, 它们既 可 以 附 着 在 海 水 中 的 有 机 物 质 上 , 也可以 寄 生 在 在 鱼 、 贝 等 动 物 体 上 , 同 时 为 宿 主提供光线 。 1.2.2 发 光细菌的 发光及 毒性监测的 原理 研 究 表 明 , 不 同 发 光 细 菌 的 发 光 机 理 是 相 同 的 : 是 特 异 性 的 荧 光 酶 (LE )在 有氧(O )参与的条件下,将 还原性的黄素核苷酸(FMNH )和 八碳以上长链脂 2 2 肪醛 (RCHO ) 氧化为 FMN 及长链脂肪酸 , 同时释放出最大发光强度在波长为 450~ 490nm 处 的蓝绿光的过程。 大致历程如下: FMNH + LE?FMNH ?LE+O ?LE?FMNH ?O+RCH?LE?FMNH ?O ?RCHO?LE + FMN 2 2 2 2 2 2 2 + HO + RCOOH + 光 2 环 境 监 测 中 使 用 的 发 光 细 菌 法 是 利 用 灵 敏 的 光 电 测 量 系 统 测 定 毒 物 对 发 光 细 菌 发 光 强 度 的 影 响 , 毒 物 浓 度 与 菌 体 发 光 强 度 呈 线 性 负 相 关 , 即 毒 性 物 质 毒 性越 强, 则发 光 抑 制 越 明 显 。 在 测 定 过 程 中 通 常 用 相 对 抑 光 度 表 征 毒 物 所 在 环 境 的 综 合 急 性 毒 性 , 这 一 方 法 具 有 快 速 、 简 便 的 特 点 , 同 时 具 有 很 好 的 重 复 性 。 有 毒 物 质 对 发 光 细 菌 的 作 用 , 往 往 是 通 过 以 下 两 种 途 径 : 直 接 抑 制 参 与 细菌 发 光 反 应 的 各种 酶类 的 活性; 阻碍 细 胞 内 与 发 光 有 关 的 代 谢 过 程 的 进 行 。 凡 能 够 干 扰 或 破 坏 发 光 细 菌 呼 吸 、 生 长 、 新 陈 代 谢 等 生 理 过 程 的 任 何 有 毒 物 质 都 可 以 根 据 发 光 细 菌 的发光强度的变化来测定。 1.2.3 发 光细菌在 环境监测 中的应用 在 环 境 监 测 中 , 相 比 物 理 、 化 学 以 及 传 统 的 生 物 方 法 , 发 光 细 菌 法 具 有 操 作 简单、 成本低、 响应快等优点。 直至上世纪 80 年代初, 美国 Backman 公司率先推 出发光细菌 生物毒性监 测仪(L.B.T)以后, 发光细菌法 才越来越广 泛的在世界 范 围内得到了应用。 江敏等人分别用小球藻、大型蚤、斑马鱼、发光细菌分别对 6 种含氮杂环化 合 物 的 毒 性 进 行 了 研 究 , 获 得 了 了 吲 哚 、 吡 啶 、 喹 啉 、 异 喹 啉 、2- 甲 基 喹 啉 和 8- 2 重庆大学硕士 学位论文 1 绪 论 羟基喹啉对小球藻 的 48h EC 、对大型蚤的 48h LC 、对斑马 鱼的 96h LC 及对 50 50 50 发光细菌的 15min EC 值;6 种物质对大型蚤、斑马鱼及发光细菌 的 毒 性 与 其 价 50 分 子 连 接 性指 数 、 辛 醇/ 水 分 配 系数 显 著 相 关; 发 光 细 菌毒 性 结 果 与大 型 蚤 、 斑 马 [2] 鱼的毒性结果显著相关,而与小球藻不相关 。这说明发光细菌法 在环境监测中, 不 但 能 够 得 到 其 与 他 生 物 监 测 方 法 ( 大 型 蚤 、 斑 马 鱼 ) 相 关 的 毒 性 测 试 结 果 , 而 且相对于其他生物监测方法,发光细菌法的监测速度更快 。 [3-5] 在国外不但利用 发光 细菌 进 行单 一重 金 属和 复合 重 金属 的毒 性 评价 ;发光 [6] 细菌也常被用于环境中的有机化学物、 杀虫剂等毒性的评价 ;还直接利用 发光细 [7] 菌对废水进行综合毒性的监测 。 近年来, 发光细菌在国内监测领域也得到 越来越 广泛的应用。研究者利用 发光细菌快速分析大气污染程度、研究了 6 种含氮杂环 化 合 物 的 毒 性 、 监 测 废 水 的 综 合 毒 性 。 此 外 , 朱 文 杰 等 人 成 功 的 在 我 国 最 大 的 淡 水 湖 青 海 湖 分 离 出 了 第 一 株 淡 水 发 光 细 菌 , 避 免 了 海 洋 发 光 菌 在 进 行 检 测 时 必 须 [8] 加入 NaCl 而引起的误差;至今,青海弧菌已多次被用于环境监测中 。 由 于 发 光 细 菌 独 特 的 生 理 特 性 , 能 完 美 的 与 现 代 光 电 技 术 相 结 合 。 国 内 学 者 利 用 发 光 细 菌 作 为 毒 性 敏 感 材 料 , 研 制 出 污 染 物 毒 性 监 测 传 感 器 , 并 对 环 境 中 的 [9] 有毒污染物进行了检测 。 李百祥等人将明亮发光杆菌固定成菌膜, 制成了急性毒 [10, 11] 性快速测定仪, 其中菌膜经过复苏后可以反复多次使用 。Alison M. Horsburgh [12] 等 人 也 利 用 发 光 细 菌 传 感 器 对 工 业 废 水 进 行 了 检 测 。 随 着 研 究 的 进 一 步 深 入 , 发光细菌检测技术与 Ames 致突变 实验、 色谱、 质谱分析等方法也结合起来了, 为 环境中毒物的检测提供了更多的手段。 Esther van der Grinten 等人将六种抗生素分别与费氏弧菌、蓝藻和绿藻作用, 结 果 发 现 抗 生 素 几 乎 对 发 光 细 菌 没 有 影 响 , 而 蓝 藻 和 绿 藻 则 对 抗 生 素 有 更 加 灵 敏 [13] 的毒性反应 。黄甫鑫 研究不同发光细菌对 5 种金属化合物的毒性,结果发现不 [14] 同发光细菌对毒物的毒性效应存在差异 。 1.2.4 发 光细菌毒 性测试结 果 的表示 方法 随 着 对 毒 物 对 发 光 细 菌 的 作 用 机 理 研 究 的 越 来 越 深 入 , 发 光 细 菌 法 的 毒 性 测 试 结 果 的 表 示 方 法 也 得 到 了 极 大 的 丰 富 。 在 标 准 方 法 中 常 用 氯 化 汞 浓 度 表 达 样 品 毒性和用 EC 表达毒性的方法。前者首先要建立氯化汞与其相对发光强度的相关 50 方 程 , 将 测 得 样 品 的 相 对 发 光 强 度 代 入 到 相 关 方 程 中 , 求 出 与 样 品 急 性 毒 性 相 当 的氯化汞的浓度(一般用 mg/L 表 示) ,测试结果报告的时候同时列举相对发光强 度及其 相当的氯化汞的浓度值, 这种发发适用于相对于发光度在 1% 以上, 特别是 在 50% 以上(即不可能出现 EC 值)但低于 100% (即仍有中、低水平毒性)的 50 样品的毒性测定;EC 表示方法 首先要建立合格的(P ?0.05 )的样品稀释液浓度 50 与其相对发光强度的相关方程, 将相对发光强度等于 50%代入相关方程求出样品的 3 重庆大学硕士 学位论文 1 绪 论 EC ,这是的 EC 以样品的稀释浓度(一般用百分比浓度)表示,这种方法适用 50 50 于相对发光值在 50% 以下, 特别是零 (即毒性水平较高或很高) 的样品毒性测定, [15] 后 者 无 法 以 相 当 的 氯 化 汞 浓 度 表 达 毒 性 的 样 品 。 这 两 种 毒 性 的 表 达 方 法 原 理 清 晰、 使用范围广 (几乎所有的毒性物质都可以利用这两中方法来表达毒性) , 所以 得到了广泛的应用。 同时, 为了满足各种需要, 其他的毒性表示方法也逐渐被使用。Nina Immonen 等 人 利 用 食 品 中 不 同 浓 度 的 乳 酸 链 球 菌 素 对 应 不 同 的 发 光 细 菌 生 物 传 感 器 的 发 光 强度抑制量(发光强度抑制量 空白的发光强度- 样品的发光强度) ,快速判断食 品 [16] 中乳酸链球菌素 的含量 。zhu 等 人发现 pEC (log (1/EC ) )和有机物的辛醇- 50 50 水分配系数(logK )j 的相关关系,并使用该关系利用青海弧菌对有机物进行了 ow [17] 急性毒性和慢性毒性的研究 。 Peter R. Fielden 等人通过对费氏弧菌与毒性作用时 的 机 理 研 究 , 得 出 发 光 强 度 与 作 用 时 间 呈 指 数 关 系 , 可 以 用 指 数 来 表 示 毒 性 的 大 [18] [19] 小 ,国内 学者将这一原理运用到了发光细菌环境毒性的在线监测中 。 1.2.5 发 光细菌法 在环境监 测中遇到 的问题 [8] [20] [16] 发 光 细 菌 法 中 的 发 光 细 菌 在 环 境 监 测 中 通 常 以 菌液 、 菌 膜 、 冻 干 粉 等 形 式 出 现 。 其 中 使 用 新 鲜 菌液 时 , 由 于 细 菌 保 持 旺 盛 的 生 命 力 , 处 于 持 续 生 长 的 状 态 , 发 光 波 动 性 大 , 所 以 在 毒 性 检 测 只 能 在 菌 液 培 养 好 后 的 短 时 间 内 进 行 ; 同 时 在 进 行 检 测 时 , 一 般 是 要 将 发 光 细 菌 离 心 , 去 除 培 养 基 后 才能 使 用 , 这 样 不 但 耗时 长 , 而 且 离 心 的 过 程 会 对 细 菌 的 活 性 造 成 一 定 的 影 响 。 将 发 光 细 菌 制 成 菌膜 使用时, 菌膜通常只能在 4?下保存, 且保存的时间较短, 这造成了菌膜携带不便 的 缺 点 ; 且 毒 性 检 测 时 每 块 菌 膜 只 用 使 用 一 次 , 消 耗 大 , 费 用 高 。 相 比 以 上 两 种 方式, 由于 冻干粉 是 经 历 了 低 温 干燥 后 制 成 的 , 细 菌 呈 干 粉 状 密 封 于 安 瓿 管 中 , 在 这 种 条 件 下 能 够 有 效 地 抑 制 细 菌 的 新 陈 代 谢 , 常 温 下 可 以 进 行 短 时 间 的 运输 , 满足了发 光细 菌 法现 场监 测 的需 要; 冻 干粉 的保 存 时间 长, 在-20 ?的 条 件下 能够 保存 6 个月以上; 并且每支干粉能够满足 20 次左右的测试, 方便快捷, 价格低廉, 所 以 冻 干 粉 最 常 用 的 保 存 手 段 。 但是 冻 干 粉 的 制 作 要 经 历 菌 液 预 冻 、 菌 液 水 分 升 [21] 华和细菌组织水分解析 3 个过程 。由于 预冻和干燥过程对细菌细胞活性影响很 大,所以在冻干粉复苏的时候时间较长(15-30 min ) ,且复苏后发光稳定性不强, 一 定 程 度 上 影 响 到 发 光 细 菌 法 在 环 境 中 监 测 中 的 应 用 。 为 了 解 决 这 些 问 题 , 将 发 光 细 菌 的 群 体 感 应 系 统 引 入 到 发 光 细 菌 检 测 方 法 中 , 以 便 对 发 光 细 菌 的 发 光 情 况 进行调节。 1.3 细菌的群体感应系统 通 常 认 为 细 菌 都 是 独 立 生 活 的 单 细 胞 生 物 , 它 们 被 动 的 响 应 外 界 的 刺 激 , 如 4 重庆大学硕士 学位论文 1 绪 论 如 趋 化 性 、 趋 光 性 、 趋 磁 性 等 ; 而 细 菌 与 细 菌 之 间 、 细 菌 与 环 境 之 间 却 无 法 进 行 沟 通 。 随 着 科 技 的 飞 速 发 展 , 直 到 上 个 世 纪 末 , 人 们 才 发 现 在 许 多 种 属 的 细 菌 之 + - 间, 不管是革兰氏阳性菌 G , 还是革兰氏阴性菌 G 都 被证实了细菌之间是可以互 相沟通的,沟通的工具是被称作信号分子(Autoinducer ,简称 AI 或自动诱导物) 的 小 分 子 物 质 。 这 些 小 分 子 物 质 是 由 细 菌 在 胞 内 产 生 , 并 不 断 的 释 放 到 细 胞 外 , 随 着 细 菌 数 量 的 增 多 , 环 境 中 的 信 号 分 子 浓 度 也 会 不 断 地 积 累 。 细 菌 通 过 感 知 环 境 中 信 号 分 子 的 浓 度 来 判 断 群 体 的 数 量 , 当 信 号 分 子 浓 度 达 到 某 一 阈 值 , 细 菌 将 会 产 生 某 些 生 理 特 性 , 如 生 物 发 光 、 抗 生 素 的 合 成 、 生 物 膜 的 形 成 、 固 氮 基 因 的 调控、 致病 基因的 表达 、Ti 质粒 的表达 、细 菌运动 等。 细菌的 这种 调节系 统被 称 为群体感应系统。 1.3.1 革 兰氏阳性 菌的群体 感应系统 革 兰 氏 阳 性 细 菌 群 体 感 应 系 统 依 赖 的 信 号 分 子 是 由 细 胞 体 内 产 生 的 前 导 肽 经 过 一 系 列 的 加 工 和 修 饰 而 成 的 寡 肽 信 号 分 子 (AIP ) 。 不 同 菌 体 产 生 的 前 导 肽 的 长 短 以 及 组 成 有 较 大 的 差 异 , 所 以 形 成 的 寡 肽 信 号 分 子 也 不 同 , 但 是 其 氨 基 酸 残 基 的数量大多是在 5-17 之间。 革兰氏阳性细菌的群体感应系统是利用 AIP 作为信号分子对革兰氏阳性细菌 的 生 理 功 能 进 行 调 节 的 。 这 种 寡 肽 分 子 能 穿 透 细 胞 壁 , 但 是 必 须 借 助 ATP-binding-cassette (ABC ) 转运 系统或者其他膜通道蛋白的帮助才能完成, 继而 释 放 到 细 胞 外 行 使 其 生 理 功 能 。 当 胞 外 的 寡 肽 信 号 分 子 随 着 细 菌 数 量 的 增 加 而 增 加,浓度达到某一阈值时,就能被细胞膜上的 AIP 信号识别系统识别。具体识别 过程如下: 首先, 当寡肽信号分子达到相应浓度时,AIP 信号识别系统上的双组份 磷 酸 激 酶 中 的 组 氨 酸 残 基 会 被 磷 酸 化 , 随 后 经 过 天 冬 氨 酸 残 基 把 磷 酸 基 团 传 递 给 受体蛋白, 被磷酸化的受体蛋白就能与 DNA 特定的靶位点相结合, 起到调控细菌 生理特性的作用。 1.3.2 革 兰氏阴性 菌的群体 感应系统 在 革 兰 氏 阴 性 细 菌 的 群 体 感 应 中 , 最 常 见 是 由 高 丝 氨 酸 内 酯 和 一 个 酰 基 侧 链 的信号分子 (AHL ) 组成的。 这类物质的共同特点是都含有一个高丝氨酸内酯环, 不同的信号分子是由酰基侧链中的碳链长度和第三的 C 上的取代基的不同而区分 的 , 取 代 基 通 常 为 氢 、 羟 基 、 羧 基 、 酮 基 。 碳 链 较 短 的 信 号 分 子 能 够 自 由 的 穿 梭 于细胞内外, 一旦酰基侧链上的碳链过长 (超过 8 个碳原子时) , 就必须在细菌 细 胞 膜 上 的 转 运 蛋 白 的 协 助 下 才 能 通 过 细 胞 膜 。 直 到 某 一 特 定 环 境 中 的 细 菌 逐 渐 增 多, 环境中的 AHL 不 断累积, 达到一定浓度阈值时, 便能与受体蛋白结合, 从而 启动相关基因的转录使某些生理功能得到表达。 细菌一般只能识别自身所分泌的信号分子, 一种 AHL 信 号分子一般也只能与 5 重庆大学硕士 学位论文 1 绪 论 相 应 的 受 体 蛋 白 结 合 , 使 细 菌 感 知 到 同 类 细 菌 所 提 供 的 信 息 。 这 种 特 异 的 结 合 并 不是绝对的, 仅仅在酰基侧链的碳链上减少或增加 1-2 个 C , 这并不会破坏其与受 体蛋白的良好的结合性; 但是如果是对 AHL 信号分子进行较大的改动, 如更改第 三 个 碳 原 子 上 的 基 因 : 次 甲 基 替 代 羧 基 、 酮 基 替 代 羟 基 或 者 是 加 入 大 基 团 , 这 都 会影响信号分子的活性; 然而保持 AHL 性 质的最重要的基团还是高丝氨酸内酯环 (HSL ) , 任何结构的 改变都会产 生显著地影 响。在研究 中发现,将 铜绿假单胞 菌 的 自 诱 导 物 质 LasA ? (3-oxo-C12-HSL ) 内 酯 环 上 的 酮 基 用 羟 基 替 换 其 酮 基 , 能 够 使 其 活 性 增 强 , 并 且 合 成 的 与 铜 绿 假 单 胞 菌 相 似 的 物 质 能 够 促 进 假 单 胞 细 菌 群 体感应的作用; 但是其它的一些对信号分子的改动都降低了 AI 的活性, 可以作为 [22] 群体感应系统的抑制剂 。 在革兰氏阴性菌中,AHL 信号分子一般是以脂肪酰基载体蛋白和硫腺苷甲硫 氨酸为底物,LuxI 、LuxM、AinS 、HdtS 几类蛋白酶为催化剂化合而成的。 在革兰 氏阴性细菌的群体感应系统中, 除了 AHL 作 为信号分子外, 还有其他分子承担起 信号分子的 职责 岗位职责下载项目部各岗位职责下载项目部各岗位职责下载建筑公司岗位职责下载社工督导职责.docx , 如青枯菌 (Raldtonia solanacearam) 利用三羟棕榈酸 甲酯作为信 号分子, 并与 AHL 一 起作用控制细菌毒性基 因的表达。 近年来在不同的细菌中还 发现了二酮吡嗪 DKP (Diketopiperazine)、2- 庚基-3 羟基-4 喹啉、γ 一丁酸内酯起 [23] 着信号分子的作用 。 群 体 感 应 现 象 是 最 早 在 费 氏 弧 菌 中 发 现 的 , 因 此 对 费 氏 弧 菌 的 群 体 感 应 细 菌 研 究 得 最 为 详 细 , 其 调 节 机 制 也 已 基 本 阐 明 , 后 续 对 革 兰 氏 阴 性 细 菌 的 群 体 感 应 的 研 究 常 以 费 氏 弧 菌 作 为 参 照 , 进 行 对 比 。 研 究 发 现 , 除 了 黄 色 粘 球 菌 和 夏 威 夷 弧菌外, 已发现的其他革兰氏阴性细菌的群体感应系统的机制都与费氏弧菌类似, 都是由 LuxI 和 LuxR 调控蛋白组成的 LuxI/LuxR 类型的群体感应调控系统,因此 [24] LuxI/LuxR 系统被认为是革兰氏阴性细菌生物模式系统 。 除此之外革兰氏阴性细 菌还存在其他形式的群体感应信号传导途径, 如: 铜绿假单胞菌含有 LasI/LasR 和 RhlI/RhlR 两 套 群 体 感 应 系 统 , 都 是 用 来 进 行 中 间 交 流 的 ;AHL 信 号 分 子 首 先 使 Las 系统激活, 大量产生毒性因子, 随后激活 Rhl 系统, 使两个系统都加入到调节 细菌毒性的生理功能中; 本身不能产生 AHL 信号分子的肠道沙门菌, 依靠受体蛋 白 SdiA 感知其他细菌释放出的 AHL 发挥自 己的功能。 很 多 革 兰 氏 阴 性 菌 会 造 成 人 体 病 变 、 食 物 的 腐 败 、 农 作 物 的 病 虫 害 等 , 通 过 阻 断 细 菌 群 体 感 应 系 统 使 细 菌 的 毒 性 减 小 , 甚 至 丧 失 毒 性 成 为 许 多 学 者 研 究 的 重 点。如刘晓岚等人研究发现美罗培南对 PAO1 野生型和 PAO1 lasR rhlR 、PAO1 las ? rhl ?基因缺陷型铜绿假单胞菌形成生物膜的敏感性不同,QS 系 统中的 las/ rhl [25] 基 因 影 响 铜 绿 假 单 胞 菌 生 物 膜 对 美 罗 培 南 的 敏 感 性 。 邱 健 等 人 通 过 研 究 群 体 感 应淬灭酶时发现苏 云金芽孢杆菌可以通过产生 AHL 内 酯酶来抑制植物病原菌欧文 6 重庆大学硕士 学位论文 1 绪 论 氏胡萝卜软腐病菌致病因子的表达; 苏云金芽孢杆菌能产生由 aiiA 编码 的 AHL 信 号