鹅细小病毒强毒YBLJ分离株的分离鉴定与vp3基因的进化分析

鹅细小病毒强毒 YBLJ分离株的分离鉴定与 vp3 基因的进化分析 高 旭，张 颖，鲁 承 (延边大学农学院 动物医学系，吉林 延吉 133400) 摘 要：为分离鹅细小病毒(GPV)，本研究将疑似 GPV感染鹅的组织样品接种 SPF鹅胚进行病毒分离和鉴 定。结果显示，第 4代病毒对 12日龄鹅胚的平均致死时间为 96 h，ELD50为 10-4.6/0.5 mL，PCR和琼脂扩散试验 均呈 GPV阳性反应，负染电镜下可观察到直径 20 nm～25 nm的圆形或六角形病毒粒子，病毒可以被 GPV 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 阳性血清完全中和，回归雏鹅后表现典型的 GP临床症状和特征性病理变化，发病率和致死率均为 100 %。分离 株 GPV的 vp3基因全长 1 605 bp，编码 534个氨基酸，与国内外有代表性 11株 GPV vp3基因的核苷酸同源性为 94 %～98 %，氨基酸同源性为 96 %～99 %。将该分离病毒命名为 GPV YBLJ分离株。 关键词：鹅细小病毒；vp3基因；分离；鉴定 中图分类号：S852.65 文献标识码：A 文章编号：1008-0589(2011)12-0924-03 Isolated and identified a virulent goose parvovirus and the vp3 gene analysis GAO Xu, ZHANG Ying, LU Cheng (Department of Veterinary Medicine, Agricultural College, Yanbian University, Yanji 133400, China) Abstract: A virus was isolated from an affected goose in Jilin province and identified as goose parvovirus (GPV) by PCR detection and agar diffusion, designated GPV YBLJ. The test results showed that the virus was neutralized by standard positive serum against GPV and the ELD50 of the virus at 4th passage in 12-day-old goose embryos was 10-4.6/0.5 mL, resulting in death of goose embryos in about 96 hours. Animal tests also indicated that the isolate was a virulent virus to goose and the mortality for 8-day-old gosling was 100%. The vp3 gene of the isolate was 1,605 bp encoding a protein of 534 amino acids, which shared 94% to 98% and 96% to 99% identity for nucleotide and amino acid sequences with GPV reference strains, respectively. Key words: goose parvovirus; vp3 gene; isolation; identification 中 国 预 防 兽 医 学 报 Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine 第 33卷 第 12期 2011 年 12 月 Vol. 33，No.12 Dec. 2011 doi: 10.3969/j.issn.1008-0589.2011.12.03 收稿日期：2011-06-12 基金项目：吉林省牧业管理局项目(吉牧科字第 200902 号)；延边大学归校博士启动基金 作者简介：高 旭(1977-)，男，吉林德惠人，副教授，博士，主要从事动物病毒病分子生物学与免疫学研究. 鹅细小病毒病(Goose Parvovirusis，GP)俗称为小 鹅瘟是由鹅细小病毒(GPV)引起雏鹅的急性、亚急 性和败血性传染病 [1]。临床以渗出性肠炎、肝、肾、 心等实质器官炎症为特征，主要侵害 4 日龄～20 日 龄雏鹅和雏番鸭，具有传播快，发病率和致死率高 的特点，10 日龄以内雏鹅感染死亡率可达 90 %～ 100 %，给养鹅业造成了严重的经济损失。1956 年， 方定一 [2]在世界范围内首次报道了该病，并于 1961 年经鹅胚分离到 GPV。本研究对发生于吉林省龙井 市周边疑似感染 GPV病死鹅病料进行病毒的分离与 鉴定，并证明分离到的病毒为 GPV强毒。为有效预 防本地区 GP的发生和蔓延提供了依据。 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1.1 病料及阳性血清 病料采自吉林省龙井市地区 散养户 GPV 病疑似病例；GPV 标准株购自中国兽 医药品监察所；GPV阳性血清由本实验室保存。 1.2 实验动物 鹅种卵购于吉林省延吉市非疫区未 经免疫农家散养户，鹅胚及雏鹅由本实验室孵化。 1.3 主要试剂 pMD18-T、DNA 连接酶、限制性 内切酶、Ex Taq DNA 聚合酶均购自 TaKaRa 公司； 质粒提取试剂盒与胶回收试剂盒购自 Omega公司。 1.4 病料处理及病毒分离 无菌采集疑似 GP病死 雏鹅肝脏，将病料与生理盐水按 1 ∶5 比例混合，经 研磨制成悬液，反复冻融 3 次， 6 000 r/min 离心 30 min，上清经 0.22 μm 滤器过滤后接种 12 日龄的 鹅胚尿囊腔，37℃孵育，连续传 4代，收集 3 d～7 d 死亡胚或活胚的尿囊液进行鉴定。 1.5 PCR鉴定 参照已发表的 B株 GPV 基因序列 (U25749)保守区 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 扩增 vp3 基因引物，上游 (1U26)： 5'-ATTGGATCCATGGCAGAGGGAGGAGG -3' (BamHⅠ )，下游 (1588L27)：5'-CGCTCGAGGTA CAGATTTTGAGTTAG-3' (XhoⅠ)，预期扩增片段为 1 605 bp，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。 1.6 琼脂扩散试验 按照常规方法制备琼脂板进行 GPV抗原检测[3]。 1.7 负染电镜观察 将第 4 代的尿囊液， 4 ℃， 1 000 r/min 离心 10 min，取上清 12 000 r/min 离心 30 min，收集沉淀，经磷钨酸负染后进行电镜观察。 1.8 病毒的中和试验 将尿囊液做 1∶100 倍稀释后 与等量标准阳性血清混合设为试验组，同时设阴性 血清对照组，37 ℃作用 60 min 后各接种 5 枚 12 日 龄鹅胚， 0.5 mL/ 胚，观察鹅胚死亡情况。按照 Reed-Muench方法[4]计算 EID50。 1.9 病毒的回归试验 取第 4代鹅胚尿囊液，接种 8 日龄非免疫健康雏鹅，采取肌肉注射 EID50 10-4.6/ 只，同时设立正常鹅胚尿囊液对照组，接种后 14 d 内观察雏鹅的发病情况，计算发病率和病死率。 1.10 vp3 基因测序与进化分析 应用 DNAStar 对 GPV的 vp3基因测序结果进行比对和进化分析。 2 结 果 2.1 病毒的分离 接种疑似 GPV 感染雏鹅肝脏病 料的 12日龄鹅胚，起初胚体病变不明显，但随着传 代次数的增加病变逐渐趋于明显，死亡时间也趋于 稳定。当传至第 4 代时，鹅胚多死于 72 h～120 h， 死于 96 h居多，死亡胚体多表现为绒毛尿囊膜水肿 且增厚，膜壁有灰白色坏死灶，胚体全身充血， 趾、翅尖、喙旁、胸部及颈部皮肤均有明显出血 点，肝脏、心肌和后脑出血，个别肝脏边缘出血， 头、颈部及两胁皮下有水肿。 2.2 PCR 检测 以 GPV 感染的鹅胚尿囊液中提取 的核酸为模版，进行 PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶 电泳，在约 1.6 kb 处有一条清晰条带 (图 1)，与预 期的全长 GPV vp3 基因大小相符。将胶回收的片段 克隆于 pMD18-T载体中进行测序，其大小为 1 605 bp。 2.3 琼脂扩散试验 琼脂扩散试验检测结果表明， 在被检样品与 GPV阳性血清之间出现明显的白色沉 淀线，而在阴性对照样品与 GPV标准阳性血清之间 没有沉淀线出现。 2.4 负染电镜观察 浓缩的鹅胚尿囊液经磷钨酸负 染，在电镜下观察到典型的细小病毒粒子(图 2)，病 毒外观呈圆形或六角形，直径约 20 nm～25 nm，无 囊膜，初步表明分离到的病毒为细小病毒。 2.5 病毒中和试验 试验组鹅胚未见死亡，对照组 鹅胚在 2 d～7 d 内全部死亡，死亡鹅胚出现典型的 GP 病变，病毒对鹅胚表现较强的致病性。但随着 高 旭，等. 鹅细小病毒强毒 YBLJ 分离株的分离鉴定与 vp3 基因的进化分析第 12期 925 [1] [2] [3] [4] [5] [6] 稀释倍数的增加，鹅胚的死亡率逐渐降低，经 Reed-Muench方法计算，EID50为 10-4.6/0.5 mL。 2.6 病毒回归试验 试验组雏鹅在接种后第 2 d 开 始出现临床症状，发病率为 100 %，第 3 d 出现死 亡，至第 8 d 时全部死亡。对死亡鹅胚剖检显示， 病变与自然 GPV强毒感染死亡病例相似，而对照组 雏鹅未出现任何临床症状。 2.7 vp3基因测序与进化分析 2.7.1 vp3 基因同源性比较 对 vp3 基因测序结果 证明目的基因为 GPV 的 vp3 基因，全长 1 605 bp， 编码 534 个氨基酸，将该分离病毒命名为 GPV YBLJ 株，并录入 GenBank (JN836326)。将其与 GenBank中 11株 GPV的 vp3基因比对发现，vp3基 因的同源性为 94 %～98 %，氨基酸同源性为 96 % ～99 %。在 vp3 基因的 G797、A1141、G1144、C1169 和 T1185位点具有 GPV强毒的基因特征[5]。 2.7.2 vp3 基因进化树分析 由 vp3 基因编码氨基 酸进化树分析图显示，BYLJ分离株 vp3基因在氨基 酸水平上与广州(Guangzhou)分离株较近，而与沈阳 (Shenyang)、哈尔滨 (Harbin)和长春 (Changchun)分离 株较远。匈牙利(Hungary)和美国(USA)分离株与大 庆(Daqing)分离株进化关系较近(图 3)。 3 讨 论 本研究从吉林省龙井市一散养户病死雏鹅体内 分离到一株 GPV强毒。研究表明，该分离病毒在基 因水平上具有李宝臣等所报道的 GPV 强毒株 vp3基 因特征 (G797、A1141、G1144、C1169 和 T1185) [5]，而弱毒株 vp3 基因相应位点分别为 A、G、A、A 和 A，这一 观点在 YBLJ 分离株与国内外代表性的 11 株 GPV 的 vp3 基因比对中得到认证(数据未提供)。在病毒 回归雏鹅试验中，第 4代鹅胚尿囊液病毒对 8 日龄 雏鹅的感染率和致死率均为 100 %，进一步证明 YBLJ分离株 GPV为强毒，并且毒力较强。YBLJ分 离株 GPV VP3 的核苷酸和氨基酸的进化树分析提 示，YBLJ 分离株 GPV 在遗传进化上相对独立，来 源于其它国内外 11 株 GPV 的可能性极小，应该为 本地区长期流行的 GPV强毒。之所以该养殖户雏鹅 出现大量感染死亡，其主要原因是小范围散养，未 接种 GPV疫苗所致。因此，按照正确免疫程序进行 疫苗接种是防制 GPV传播和蔓延的有效手段。 在 GPV的分离过程中，我们尝试用未接种疫苗 的鹅胚和番鸭胚同时进行分离培养，结果接种番鸭 胚至第 8 代仍未分离到 GPV，而接种鹅胚的第 4 代 就能够分离到 GPV，这与 Zadori 等报道的 GPV 初 代分离可以用鹅胚或番鸭胚培养不一致 [6]。GPV YBLJ 分离株的 vp3 基因及其编码氨基酸与国内外 11 株 GPV 的同源性在 94 %～99 %之间，变异率很 低，这可能与 GPV只有一个血清型具有相关性。本 研究分离到一株 GPV强毒，并对克隆的 vp3基因进 行了系统分析，为下一步基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 疫苗的研制和控 制本地区 GPV的传播和蔓延奠定了基础。 参考文献： Derzsy D, Dren C, Szedo M, et al. Viral disease of gosling. Iso- lation, properties and antigenic pattern of virus strains [J]. Acta Vet. Hung, 1970, 20: 194-428. 方定一. 小鹅瘟的介绍[J]. 中国兽医杂志，1962，8：19-20. 余永建，胡世君，黄伟，等. 利用琼脂免疫扩散试验检测小 鹅瘟病毒抗原及抗体的研究 [J]. 畜牧与兽医，1987， (5)： 202-204. 殷震，刘景华. 动物病毒学[M]，2 版，北京：科学出版社 . 1997，1165-1168. 李宝臣，齐岩，马波，等 . 鹅细小病毒不同毒株 VP3 序列 分析比较[J]. 中国预防兽医学报，2003，25(6)：430-433. Zadori Z, Stefancsik R, Rauch T, et al. Analysis of the complete nucleotide sequence of goose and muscovy duck parvoviruses indicated common ancestral origin with adeno-associated virus 2 [J]. Virology, 1995, 212(2): 562-573. (本文编辑：赵晓岩) 中 国 预 防 兽 医 学 报 2011年926