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chapt04DNA的复制.ppt

chapt04DNA的复制

yeye
2013-03-20 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《chapt04DNA的复制ppt》,可适用于高等教育领域

分子生物学教程分子生物学教程赵亚华编著科学出版社年月第三版第章绪论Introduction普通高等教育“十一五”国家级规划教材第章DNA的复制DNAreplicationorduplication*DNA复制概述细菌DNA的复制机制真核生物DNA的复制DNA复制的调控真核生物DNA复制的调控第章DNA的复制DNAreplicationorduplicationDNA复制概述*DNA复制概述现代生物学证明DNA是最基本的遗传物质。遗传密码-特定的核苷酸排列顺序。遗传信息-复制-转录-mRNA-蛋白质表现功能。某些病毒等以RNA作为遗传信息的基本携带者。生命的遗传实际是染色体DNA自我复制的结果。原核生物每个细胞基因组只有一个环形DNA细胞的分裂和DNA复制密切相关一但复制完成即可启动细胞的分裂。部分大肠杆菌质粒DNA的复制真核细胞器DNA的复制受基因组DNA制约称为严紧控制但也有一些不依赖与DNA染色体的复制称为松弛控制。真核细胞的DNA复制与细胞周期有密切关系受细胞周期的控制。细胞器DNA的复制不受限于核DNA合成的S期。病毒DNA进入细胞后即能进行复制如果能整合进入宿主DNA随宿主DNA复制。DNA的半保留复制DNAsemiconservativereplication*DNA的半保留复制DNAsemiconservativereplicationDNA复制(DNAreplicationorduplication):DNA在复制过程中碱基之间的氢键断裂双螺旋解旋并以分开每条单链DNA分子为模板产生互补的两条链新合成出两条与亲代DNA分子完全相同每个子代DNA分子中的一条链来自亲代DNA另一条链则是新合成的这种复制方式称为半保留复制。*三种复制假说Threereplicationhypotheses*MatthewMeselsonFrankStahl用氮的同位素证明了DNA的半保留复制。*Meselson-Stahl实验年Meselson和Stahl首先将大肠杆菌在含重同位素N的培养基中培养约十五代使所有细菌都被N标记。然后移至只含有轻同位素N的培养基中同步培养一代二代三代。分别提取DNA作CsCl密度梯度离心观察DNA的位置。*半保留复制机制SemiconservativemechanismNlabelingexperimentNlabeling:growcellsinCollectDNA:growcellsinSeparation:methodResultinterpretationNlabeledDNA*(CsCl密度梯度离心)NNDNASemiconservativereplicationMMeselsonandFWStahl,Sciences:,**年Cairns用放射自显影方法阐明了大肠杆菌DNA的复制是半保留复制且DNA是环状分子。*年Taylor用H脱氧胸苷的溶液标记蚕豆证明了真核生物染色体的复制也是以半保留复制方式进行的。●DNA分子是以半保留方式进行复制不管是原核还是真核生物。*OK!How现在要弄清的问题是半保留复制是如何复制的*)冈崎片段Okazakifragment(ReijiOkazaki)EcolitDSDNASSDNADensitygradientofsucroseMeasureHT*HTpulsechasepulselabeling’’’’’’’’’’DNAreplicationinOkazakifragmentkb*AtleastonestrandofDNAreplicationinOkazakifragmentkbDNAreplicationinOkazakifragmentkb(semidiscontinuousreplication!)?*)半不连续复制(semidiscontinuousreplication)证据DNA片段堆积实验*dUTP:dTTP=:incellATGCdutgenedUTPase少数dUTPDNA中不能有UAT突变频率=!?*UU变性denature堆积片段长度~base~Okazakifragment●     dut–ung–●dut–ung*leadingstrand(indUMPF)laggingstrand(inOF)直接证据?*DNA半不连续复制DNAsemidiscontinuousreplicationleadingstrand,laggingstrand均有dUMP的掺入Okazaki片段在某种意义上为dUMP片段先导链按dUMP片段连续复制后随链按Okazaki片段不连续复制(Prokkb,Eukkb)*半保留复制Semiconservativereplication半不连续复制SemidiscontinousreplicationDNA复制的一些概念DNA在复制过程中碱基之间的氢键断裂双螺旋解旋并以分开每条单链DNA分子为模板产生互补的两条链新合成出两条与亲代DNA分子完全相同每个子代DNA分子中的一条链来自亲代DNA另一条链则是新合成的这种复制方式称为半保留复制。DNA复制时因为复制的方向必须是从’到’一条链可以连续复制而它的反义链复制则是不连续的会产生冈崎片断所以称为半不连续复制。*复制子Replicon复制小体ReplisomeThemultiprotein(±)structurethatassemblesatreplicatingforktoundertakesynthesisofDNA是指基因组DNA中能够独立复制的单位含有DNA复制的起始区和终止区的一个DNA复制单位。在复制叉处组装成形成的多蛋白结构承担DNA的复制。AunitofthegenomeinwhichDNAisreplicatedcontainsanoriginforinitiationofreplicationandaterminustostopthereplication*复制起点:参与DNA复制起始的一段特殊序列。复制起点OriginofReplicationOriginofReplication:anoriginforinitiationofDNAreplicationilvthrlacattλtrphistyrmalAilv*(bp)bp±inProkaryote(Ecoli称为OriC)()大肠杆菌ori的分离IsolationoforiofEcoli*在oriC区域内含有一系列对称排列的反向重复序列即回文结构(palindrome)它富含AT。与复制酶系统的识别有关。在oriC区域内含有两个转录启动子区这暗示转录可能在DNA复制时起着重要的作用。oriC包含个bp反向重复序列TTATTCACA和个富含AT的bp重复序列GATCTNTTNTTTT。个bp反向重复序列是起始蛋白DnaA的结合位点DnaA的合成与大肠杆菌的生长率相偶联所以复制的起始也与大肠杆菌的生长率相偶联。DnaA分子形成复合分子后使DNA链弯曲DnaB结合使之解链。oriC也包含有个GATCA被甲基化则复制起点被活化复制才能开始。()复制起点的结构特征**DNA复制在细胞周期的S期DNAreplicationatphaseSofcellcycleShs*复制机理的复杂性DNA复制起始控制机理知之甚少*()真核生物复制起点的研究是以酵母为基础*真核生物复制起点的研究是以酵母为基础ARS(automaticReplicationSequence)自主复制序列年从trp基因中分离得到具有ARS功能的bp的片段称为ARS(A,B,B,B)A区具有高度保守性TATTTATCAGTTTTA(yeast)B区变化较大-不同生物复制起始位点的B区的核苷酸的变动较大。AATTTCGTCAAAAATGCTATTTAAGTATTGTGAAAAGCAAGCACTAAACATAAAATCTBBBA*在环状DNA复制从OriC开始双向进行复制叉向两个相反方向沿环状DNA前进最后两个复制叉相遇在一个位点停止该部位称为复制终点(Ter)。结构特点:有个ter序列terA,terC,terD,terB,terE,terF。它们含有一个bp的共同序列。Tue蛋白与之结合具有抗解旋酶活性阻止DNA解旋抑制复制叉前进。复制终点TerminusofReplication*“DNA复制的呼吸现象”真核生物DNA在复制过程中在复制原点处氢键迅速断裂与再生导致两条DNA链不断解链与聚合形成瞬间的单泡状结构的过程成为“呼吸现象。在富含AT的区域内尤为明显复制叉replicatingfork*复制叉replicatingfork复制开始时在复制起点处形成的一个特殊的叉形结构是复制有关的酶和蛋白质组装成的复合体和DNA新链合成的部位这个部位称为复制叉。复制的速度replicationspeed*复制的速度replicationspeed复制子大小:酵母或果蝇DNAkb哺乳动物DNAkb原核细胞的DNA:>kb冈崎片段大小:原核细胞的DNA:nt真核细胞的DNA:nt复制速度:真核细胞的DNA:,,bpmin(sec)原核细胞的DNA:,bpmin(sec)*复制的方向单起点、单方向复制多起点、单方向复制单起点、双方向复制多起点、双方向复制相向复制*Cairns℃,cimMHT,min℃,cimMHT,min℃,T,onecircle复制多模式的证据模式?Ecolithyslowstopmutts复制发动温度敏感突变型℃不能发动DNA复制、但可完成DNA延伸慢停突变(slowstopmutation)当温度升高复制停止在下一周期开始快停突变(faststopmutation)当温度升高复制立即停止?*模式?单起点、双方向两个复制叉*RLRodriguezEcolithyslowstopmutts℃℃,cimMHT,min℃,cimMHT,min*()Ө型复制(Өformreplication)ProDSDNA,质粒DNA→在复制起点oriC解链双方向复制。→两条链通常同时进行对称复制。→也有一些不对称复制即一条链复制后再进行另一条链的复制。复制的方式*共价延伸方式(covalenceelongation)或滚环方式rollingcircle)或δformDSDNA→链DNA产生Nick→链DNA为模板链’OH为引物合成leadingStrand→Elongation→rolling→LaggingStrand合成*cyclingamplification’’’’共价延伸方式(covalenceelongation)或滚环方式(rollingciecle)InSSDNAorλPhage*置换式或DLoop(Displacementform)DSDNAInmitochondrialDNAalsoinchloroplasmDNA→SSDNAastemplate→NewSSDNA→Displacement→DLoop复制的速度replicationspeed*复制的速度replicationspeed复制子大小:酵母或果蝇DNAkb哺乳动物DNAkb原核细胞的DNA:>kb冈崎片段大小:原核细胞的DNA:nt真核细胞的DNA:nt复制速度:真核细胞的DNA:,,bpmin(sec)原核细胞的DNA:,bpmin(sec)*引物primer(DNA聚合酶不能发动子链DNA的复制起始)SSDNAvirusRF无MRFRifalmpinMRifalmpin有MRF有MRFMRifalmpin*Rifalmpin是EcoliRNApolymerase的抑制剂MRF的形成需要RNApolymerase发动合成一段RNA分子作为引物RF启动后RNA引物已经形成,Rifalmpin的抑制无效结论ConclusionThefirstevidencesupportingRNApriming*BeforeDNasedigestionAfterDNasedigestionDNARNA引物DNase不能完全降解Okazaki片段TunekoOkazakiJMolBiol()pP标记的ntRNA引物Okazaki片段上带有αpGTP标记的完整RNA引物用DNase降解DNA后会留下标记的RNA引物ae无RNaseH处理bf无Dnase处理(用RNase处理)cg没有两种酶处理dh野生型两种酶多有作用进一步证明DNA复制的引物!*DNA复制的转录激活(transcriptionalactivation)RNApolymeraseRifSNtRNAprimerforleadingStrand*后随链DNA中子链的合成SynthesisofprogenystrandinlaggingDNA**RNApol(RNApolymerase)RifSdnaG(primase)RifR完成对后随链引物的合成完成±NtRNA引物合成后DNApolII进行DNA链的延伸DNApolI对RNA引物切除并聚合填补连接酶(ligase)将Okazaki片段dUMP片段连接完成对先导链引物的合成实现DNA复制的转录激活起始较先导链的启动落后一个Okazaki片断结论Conclusion*、DNA聚合酶催化的反应DNA复制的酶系EnzymesforDNAreplication*子链DNA延伸方向DNA聚合酶只在双链DNA的’端起作用DNA新和成链的延伸从’到’方向ppi进化中保留的深刻的、选择与适应的、化学及功能的根源**因能量的需要DNA的’端必须带有PPP游离dNTP具有ppp在MNacl的生理环境中磷酸基团间的强电负性使dNTP难以聚合到DNA的‘端而且双链DNA的’端碱基配对困难。OH*碱基发生错配后的校正……费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗ppDNA聚合酶*DNA聚合酶()DNA聚合酶І(DNApolymeraseI)*()DNA聚合酶І(DNApolymeraseI)DNA聚合酶I分子量KD,由一条单一多肽组成含有一个Zn,Ecoli,℃活性ntminDNA聚合酶I是多功能酶:’→’聚合酶活性’→’外切核酸酶活性’→’外切核酸酶活性蛋白酶水解后得到KD和KD两个片段KlenowFKD’’聚合酶活性和’’外切核酸酶活性,小片段有’’外切酶活性。不是DNA复制的主要聚合酶*蛋白酶水解PolI’→’外切核酸酶活性切除冈崎片段的RNA引物。再通过’→’聚合酶活性填补缺口。切除紫外线引起的嘧啶二聚体突变。()DNA聚合酶П(DNApolymeraseП)*()DNA聚合酶П(DNApolymeraseП)DNA聚合酶II为多亚基酶聚合酶亚基由一条分子量为KD的多肽组成。活性比DNA聚合酶I高约ntminEcoli。DNA聚合酶I是多功能酶:’→’聚合酶活性’→’外切核酸酶活性不参与DNA的复制与DNA修复有关*DNA聚合酶III全酶:由多个亚基组成约kDa复合体其生物活性形式为二聚体。a)α亚基分子量为KD具有’→’聚合酶酶催化活性b)ε亚基具有’→’外切酶活性c)θ亚基组建复合体由αεθ构成核心酶d)t亚基连结两个核心亚基形成一个二聚体组分e)β亚基作为功能“夹子”使聚合酶保持在DNA上相对滑动()DNA聚合酶Ш(DNApolymeraseШ)*F)γ具有依赖DNA的ATP酶活性参与复合体的组装g)γ复合体由γ,δ,δ’,χ,ψ五种个亚基组成主要作用是“夹子”装置器PolyIII是DNA复制的主要酶。DNAPolIII全酶的主要亚基及其组装*DNAPolIII全酶的主要亚基及其组装亚基分子量(KD)基因组装程序dnaEdnaQholEdnaXdnaX*holA’holBholCholDdnaNPolIIIPolIII’PolIII*holoenzymecomplex*FormsofDNApolymeraseIIIfrombiochemicalstudies:*FormsofDNApolymeraseIIIfrombiochemicalstudiesgdcomplexmakesbclampbindtoprimedtemplate*FormsofDNApolymeraseIIIfrombiochemicalstudies:gdcomplexmakesbclampbindtoprimedtemplateClampaeqHoloenzyme:ttd’ycdgClamploaderATPADPPgdbAsymmetricOnlyonegdcomplexgdcomplexaddsapairofbdimers*AssemblystagesforPolIIIholoenzyme:ATPADPPgdistheclamploaderbdimerclampsonDNACorejoinscomplexIncreasedprocessivitybdimergdrecognizeprimertemplateConformationchange*AssemblystagesforPolIIIholoenzyme:全酶Q:WhichsubunitsareencodedbythesameDNAA:tau(t)andgamma(g)usedifferentreadingframesofthesameDNAQ:AsymmetriconlyoneclamploaderwhyA:DifferentabilitiestodissociatefromDNAsubunitofDNApolIII(headtotaildimer)subunitofDNApolIII(headtotaildimer)TheclampbdimermakesholoenzymehighlyprocessivebdimerboundtoDNAbutslidesalongbdimerisringshapedassemblyorremovalrequiresenergy(gd)()DNA连接酶(ligase)*()DNA连接酶(ligase)MWKD,cell、NAD或ATP与酶反应形成腺苷酰化的酶(酶-AMP复合物)AMP的磷酸基与酶的赖氨酸-氨基以磷酰胺键结合、然后将AMP转移给DNA切口处的‘膦酸形成AMP-DNA、’OH对活化P进行亲核攻击生成磷酸二酯键同时释放AMP。NADNMDAMP**HThymidinepulsechaselabelingandalkalinesucrosegradient:discoveryofsemidiscontinousreplicationDNAligasenascentnt(prok)andnt(euk)DNA的半不连续复制DNAsemidiscontinuousreplication*半不连续复制:后随链的冈崎片段Replisome(复制小体):themultiproteinstructurethatassemblesatthebacterialreplicatingforkforsynthesisofDNAContainsDNApolymeraseandotherenzymes*DNA合成的高保真性取决于DNA合成过程中具有Proofreading。Proofreading在核酸合成过程中涉及任何纠正错误的机制包括对加入的新的核苷酸的详细审查。Proofreading源于DNA聚合酶的作用向前移动的DNApolymerases具有’’外切酶的生物学活性。Ecoli的实际错误掺入率约为~这相当于~错误每个基因组每复制周期或~每个基因组每代。如果无Proofreading功能DNA合成核苷酸错误的参入率为×具有Proofreading后×。DNA合成的高保真性DNApolymerasecontrolthefidelityofDNAreplication*拓扑异构酶(topoisomerase):可使DNA拓扑异构体互变的酶。切割DNA链使其松弛后再连接。DNA拓扑异构酶DNAtopoisomeraseIω蛋白或切口封闭酶KD单肽链含-个Zn不需ATP切割双链DNA中的一链使DNA松弛后连接切口消除负超螺旋。缓解高速旋转。作用:每次改变一个连环数结合DNA使该处溶解形成酶-DNA复合物切割双链中的一股使DNA中的一股链穿越切割点断裂单链连接**作用:使正超螺旋转化为负超螺旋。每次改变两个连接数。Ⅱ型拓扑异构酶(topoisomeraseII)又称旋转酶。切割DNA双链DNA的双链瞬间断裂此时不需ATP尔后由ATP供能使DNA分子成负超螺旋再连接切口。缓解高速解旋时DNA双链的相互缠绕**Ⅰ型:MW=kD单体蛋白不需ATPⅡ型:MW=-kD均为二聚体需ATP和Mg*SSB(SinglestrandDNAbindingprotein):是一类能够选择性结合在DNA单链上使DNA能以单链形式稳定存在的蛋白质。单链DNA结合蛋白功能:稳定DNA复制时已解开的DNA单链覆盖在单链DNA上的SSB蛋白能够阻止单链重新结合形成双链保护DNA单链不被核酸酶降解。细菌DNA复制的机制mechanismofbacterialDNAreplication*细菌DNA复制的机制mechanismofbacterialDNAreplication*ExperimentalSystemsInvitro:SmallerandsimplerbacteriophageandplasmidDNAmolecules(egfX,ntinsupercoiledcircle)TheyrelyoncellularfactorsforitscompletereplicationsBiggenomelikeT(kb)andT(kb)notsuitable大肠杆菌复制的起始BacterialDNAreplication*大肠杆菌复制的起始BacterialDNAreplication大肠杆菌DNA的复制过程包括三个阶段:复制的起始Initiation延伸Elongation终止Termination*initiationatOriC:Ecoli起始位点bp。oriC含有个bp反相重复序列(TTATCCACA)起始蛋白DnaA结合在该处。-个DnaA蛋白各携带一个ATP结合在此处DNA缠绕在DNA蛋白上使个bp富含AT的重复序列解链而成为开链中间复合物所需的能量来源于ATP。HU蛋白结合在DNA上它是一种DNA结合蛋白。DnaBDnaC在DnaC的帮助下结合于解链区的中间复合物上。*initiationatOriC:DnaB是一个解链酶在ATP供能的情况下进一步使双联DNA解链。Ssb(singlestrandedbindingprotein)结合于解链的单链DNA(ssDNAbubble)同时在DNA复制的起始位点处RNA聚合酶primase参与在前导链上合成一个短的RNA引物。Primosome的形成:DnaB解链酶(helicase)和DNAprimase*DnaA蛋白的作用有三个DnaADnaBC、与负超螺旋DNA结合在OriC处形成复合物、初始OriC中的个富含AT的bp重复序列解链需要ATP和Hu蛋白的初进作用、引导DnaBDnaC进入局部解链区。*SsbDnaAbprepeats*DnaB的功能有两个是解链酶促进DNA双链的解链促进DnaG蛋白的结合活化DnaG促使其在后随链上合成RNA引物。DnaC的功能是促进DnaB-DnaC复合体的形成起一个分子伴侣的作用帮助DnaB进入复制起始位点的作用。DnaC的功能有*RNApriming:DNAsynthesisisprimedbyRNAthatisthenremovedbeforefragmentsarejoinedDNA聚合酶不能从头开始(denovo)起始DNA的合成initiationatOriC:*)引发体(primosome)的形成引发体Primosome:Primase(引发酶)DnaBhelicase(解链酶))在起始区形成复制叉*)在起始区形成复制叉在体外研究表明有两种蛋白质参与复制:Gyrase(topoisomeraseII):actsasaswivelallowingonestrandtorotatearoundtheotherHU:(HUHU)是DNA(doublestrandedsinglestranded)结合蛋白与DNA结合后DNA发生弯曲可以使双涟DNA变得更加不稳定。复制延伸Elongation*复制延伸Elongation在复制启动时尚未解开螺旋的亲代双链DNA同新合成的两条子代双链DNA的交界处就称为复制叉(replicationfork)。两个靠得很近的复制叉之间形成的空间称为“复制泡”(replicationbubble)。复制叉的组装分两个阶段:)起始因子对复制起点的识别和结合使双螺旋DNA解链的开始)蛋白因子和解链酶以复合体的形式结合在起始位点使双链解开形成复制叉。复制叉*TopIIHelicase(repprotein)DnaBSingleStrandBindingprotein(SSB)Helixdestabilizingprotein(HDP)HUDnaB-CproteinDnaGproteinUngaseDNAPolymeraseIIIDNAPolymeraseILigaseforprimosome复制体进化中形成了灵活的多酶复合体replisomeDnaAproteinDammethylase*复制叉处形成复制体-replisome*在复制叉处同一个DNA聚合酶III负责协同复制前导链和后随链的合成DNA聚合酶III全酶是一个二具体回环模型能够解释在连续复制和不连续复制的延伸过程中前导链和后随链之间的复制关系当两条链同时复制时后随链经过复制叉的部位就形成一个回环以适应双链同时向前进行这种复制模型称为回环模型。回环模型*AssemblystagesforPolIIIholoenzyme:全酶Q:WhichsubunitsareencodedbythesameDNAA:tau(t)andgamma(g)usedifferentreadingframesofthesameDNA*DNApolyIII*OrganizationoftheoriCReplicationFork牵拉后随链模板通过DNApolIII全酶冈崎片段的’端DnaBDnaCNote:theloadingofDnaBhelicasebyDnaConlyoccursattheoriginATP®AMPDnaB刺激DnaG引物酶合成RNA引物PolIII核心*Relatedfact:在复制起点oriC处,由DnaB和DnaG形成引发体OriCPrimosomedirectedsynthesisSchematicofonesideofthereplicationforkbPolIII核心ATP®AMP冈崎片段的’端DnaB刺激DnaG引物酶合成RNA引物*DnaB的作用:)是解链酶促进DNA双链的解链推进复制叉向前移动)促进DnaG蛋白的结合活化DnaG促使其在后随链上合成RNA引物*OriCPrimosomedirectedsynthesisPolIII的作用:)前导链的合成)在RNA引物的基础上合成后随链通过DNAPolI取代引物)后随链的合成是相对运动。拉后随链模板通过DNApolIII全酶(pullsthelaggingstrandtemplatethroughtheholoenzyme)在复制叉处t结合dnaB附着在polIII核心***DNA聚合酶I去除RNA引物填补去除引物留下的空缺(缺口)。DNAligase(连接酶)连接冈崎片段成为一条完整的DNA分子。*Replisomeincovalenceelongation*全酶二聚体的一个亚单位与前导链模板结合在RNA引物的基础上连续合成DNA行进方向与复制叉移动方向一致后随链合成分步后随链形成回环另一个亚单位和引发体与后随链模板结合准备合成引物引物合成方向‘-’由于模版呈环形回折复制方向与复制叉移动方向一致随着后随链模板的扩大在引物‘OH端开始合成DNA片段方向为’-‘。当合成离前一个片段的’端仅剩一小空隙时polIII酶的行进受阻模板链解环新合成的冈崎片段完成。复制延伸过程的归纳*终止区含有多个bp的终止序列Ecoli含有个terA到terF的终止位点Tus蛋白与它们结合阻止复制叉前移其间仍有-bp未复制由修复方式填补连锁环解环需要拓扑异构酶VI的参与复制的终止Termination*终止与分隔TerminationandSegregationApproximately°oppositeoriCTus蛋白:是ter位点结合蛋白,该蛋白具有抑制DnaB解链酶的活性拓扑异构酶(parC和parE编码)IV解开相互连结的子代DNA连锁体由拓扑异构酶参与解连锁,使两个闭环双链DNA彼此分开。terdirectional*真核生物DNA的复制EukaryoticDNAreplication*真核生物DNA的复制EukaryoticDNAreplicationExperimentalsystemsSmallanimalviruses(simianvirus,kb)aregoodmammalianmodelsforelongationYeast(Saccharomycescerevisiae):xbpinchromosomes,containingrepliconsARSisaboutbpCellfreeextractpreparedfromXenopus(frog)eggscontaininghighconcentrationofreplicationproteinsandcansupportreplicationinvitro*Mammalianchromosomehasabout,,replicons,repliconisaboutbp,humanhaspairschromosomeYeast(Saccharomycescerevisiae)andfruitfly:hasaboutrepliconsExperimentalsystems*GpreparingforDNAreplication(cellgrowth)SDNAreplicationGashortgapbeforemitosisMmitosisandcelldivisionCellcycleEntryintotheSphase:CyclinsCyclindependentproteinkinases(CDKs)signaling*复制叉为双向哺乳动物细胞的复制子大小约为kb。通过FU处理培养细胞随后加入HTdR制备放射自显影图片在电镜下可观察到多复制泡。真核细胞的多复制子*ReplicationforkUnwindingDNAfromnucleosomes:bpsec,needhelicasesandreplicationproteinA(RFA)*起始位点在起始区域内的每个复制子的起始可以随机发生酵母起始区:至少有bp的保守序列:ATTTTATAGTTTAT被CDK激活的起始识别复合体结合(originrecognitioncomplexORC)。ARS:(autonomouslyreplicatingsequence),酵母的自主复制序列含有酵母复制起点。真核细胞的DNA聚合酶*真核细胞的DNA聚合酶***DNA的复制起始和延伸:涉及种DNA聚合酶DNA聚合酶a:具有引物酶的活性负责合成前导链和后随链冈崎片段的RNA引物。继续延伸DNA的合成时被DNA聚合酶d迅速取代。真核细胞的DNA聚合酶*DNA聚合酶d(replicase):在前导链和后随链上取代DNA聚合酶a后能继续合成长的DNA。PCNA:增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen)与大肠杆菌EcolipolIII的亚基相似。真核细胞的DNA聚合酶*DNA聚合酶ε:与大肠杆菌EcoliDNA聚合酶I相似当RNA引物被RNaseH和MF去除后,由DNA聚合酶ε填补DNA后随链上遗留的缺口。其他真核DNA聚合酶:用于DNA修复,负责线粒体mtDNA复制。真核细胞的DNA聚合酶*DNA连接酶I:是连接后随链冈崎片段的DNA连接酶。其他真核DNA聚合酶:用于DNA修复,负责线粒体mtDNA复制。两种复制因子RPA和RFCRPA:是真核生物的单链DNA结合蛋白相当于原核生物的SSR蛋白。RFC:是夹子装置器相当于大肠杆菌的复合体真核细胞的DNA聚合酶*真核DNA复制叉的移动速度*真核DNA复制叉的移动速度原核DNA复制的冈崎片断的长度bp真核DNA复制的冈崎片断的长度bp复制叉的移动速度为Ecoli℃h,mammaliancellhrsprokaryotebpmineukaryotebpmin真核DNA复制子-bp,原核bp*解决在复制过程中末端缩短的问题。真核生物染色体端粒的复制Telomerereplicationoneukaryoticchromosome??polymerasesrequirea’OHRNAprimerat’endoflinearchromosomecannotbereplacedChromosomebecomesshorterwitheveryroundofreplication*真核细胞的端粒:染色体末端存在的多拷贝富含G、C碱基的’突出重复短序列。端粒酶(Telomerase):是含有一段短RNA部分与DNA’突出端重复序列互补并复制染色体末端的核糖核蛋白复合体。与细胞的衰老和肿瘤有关。Humantelomere:’TTAGGGTTAGGG(TTAGGG)nTTAGGG’’AATCCCAATCCC’*’末端究竟是如何复制的真核生物通过端粒酶形成端粒(Telomere)结构防止染色体末端缩短端粒酶的组成:RNA和蛋白质的一种RNP有逆转录酶活性能够利用自身的RNA为模板以反转录的方式催化与其互补的DNA链的合成。四膜虫的重复单位为TTGGGG,人的端粒为TTAGGG端粒酶与早老症与肿瘤端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein,hTP)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)*末端复制的机制合成步骤:)端粒酶的RNA的’端AAC与DNA的’端TTG反向互补结合)端粒酶发挥反转录酶的活性以其RNA为模板合成DNA)当G足够长时引发酶合成RNA引物)DNA聚合酶用DNA为模板以RNA’端为引物合成DNA。)切除引物在富含G的端粒链上又合成碱基片段。*Repeatsequence:Tetrahymena(四膜虫)TTGGGGhumanTTAGGG端粒复制机制telomerase端粒酶的催化延长作用爬行模型DNA聚合酶复制子链进一步加工*端粒酶的功能真核生物通过端粒酶形成端粒(Telomere)结构防止染色体末端缩短端粒酶活性与早老症与肿瘤有关TelomeraseandAging*TelomeraseandAgingTheagingprocessmaysomehowbelinkedtos

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