抗体的标记

抗体的标记 在绝大多数情况下，当抗体分子被应用于研究时均需要被标记。依据实验目的之不同，所采用的标记 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 和标记物通常也是不同的。 一、抗体的标记的直接法与间接法 （一）直接法 直接法是将纯化后的抗体先与一标记物直接结合，然后再与靶分子（抗原）结合，通过检测抗体所携带的标记物来对靶分子（抗原）进行定性、定位、定量测量的方法。 （二）间接法 间接法与直接法不同，抗体既不需纯化也不需标记，而是在抗体与相应靶分子（抗原）结合后，洗去未结合抗体，然后通过利用已标记好的第二抗体（二抗）与一抗的结合来间接标记出靶分子（抗原）的存在情况。此方法带有比直接法更多的标记物，因此较直接法灵敏。 二、标记物的选择 无论是直接法还是间接法，标记物的选择至关重要。 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1-2-1所列出的就是一些常用标记物及其相应的检测方法和优缺点等。 表1-2­-1 标记物的选择 标记物 检测方法 优点 缺点 应用 生物素 与各种标记物偶联的亲和素与链霉亲和素 保存时间长，灵敏度高，检测手段多样 步骤过多，存在内源性生物素干扰，有些底物对人体有害 免疫组化、免疫印迹 荧光色素 荧光显微镜或荧光计 保存时间长，分辨率高 自发荧光，易淬灭 免疫组化 酶 底物显色 保存时间长，灵敏度高，肉眼直接可见，检测手段多样 步骤过多，存在内源性酶的干扰，分辨率低，有些底物对人体有害 免疫组化、免疫印迹 125I或131I γ计数仪、放射自显影 易于直接标记，灵敏度高 半衰期短，对人体有害 免疫印迹、定性定量免疫 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 生物合成 放射自显影、β计数仪 不损伤抗体、操作简便 半衰期短，敏感性低，需杂交瘤细胞 免疫印迹、定性定量免疫分析 胶体金 显微镜、电镜、肉眼 特异性强、灵敏度高、应用范围广、可用于双重和多重标记 对试剂、玻璃器皿内的要求极高，标记物浓度较高 免疫组化、流式细胞术、定性定量免疫分析 第二节 免疫组织（细胞）染色技术 一、基本概念 免疫组织化学技术（immunohistochemistry）或免疫细胞化学技术（immunocytochemistry）是用经标记的特异性抗体在组织细胞原位通过特异性抗原抗体反应和化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。它将抗原抗体免疫反应的特异性、组织化学的可见性结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像与放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种细胞组织成分，如蛋白质、多肽、核酸、部分类酯、多糖、激素、病原体（寄生虫、细菌病毒）、受体、神经介质、肿瘤的标记物（抗原或相关抗原）等。是免疫学、病理生理学和蛋白质研究的重要技术手段。 免疫组织化学的全过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将显色剂与抗体结合形成标记抗体；④组织细胞标本的制备；⑤免疫细胞化学反应及呈色反应；⑥结果的观察与分析。 二、组织（细胞）标本的制备 （一）细胞标本的取材 1．体细胞取材方法 （1）印片法：主要用于从活组织检查标本和手术切除标本中获取细胞。首先将标本剖开，最大程度暴露组织病变区，然后将载玻片轻压于病变组织区，吸附脱落的细胞。 （2）穿刺取样涂片法：用细针穿刺从实质性器官（如肝、肾、脾、淋巴结、软组织、骨髓）的病变区吸取病变区的体液，然后进行涂片。 （3）体液沉淀涂片法：主要适用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等含细胞较少的标本，先通过离心获取细胞沉淀，经适当稀释后再进行涂片。 2．培养细胞取材方法 （1）细胞爬片法：适合于贴壁生长的培养细胞。将干净（消毒处理）的盖玻片放置入培养液中，细胞便会自然贴附在其上。 （2）涂片法：适合于悬浮生长的培养细胞。直接取悬浮生长的培养细胞或通过离心收集细胞，再经适当的洗涤和稀释后进行涂片。 3．组织材料的获取 主要通过组织切片技术获得。根据包埋剂的不同可分为：冰冻切片、石蜡切片、塑料切片、超薄切片、碳腊切片等类型。 （二）细胞和组织的固定 固定的目的是为了更好地将细胞和组织的原有形态结构及成分保留下来，让蛋白质变性，使内源性消化酶失活。对免疫组化而言，可用的固定剂种类多样，性能也不尽相同，在使用时应注意考虑不同固定剂对抗原的影响，防止抗原的弥散以及活性的丢失。 常见的固定剂有醛类（如10％的中性缓冲福尔马林，4％的多聚甲醛等）、非醛类（如碳化二亚胺、对苯醌等）、丙酮及醇类固定剂。常见的固定方法有浸入法和灌注法等。 三、免疫荧光细胞化学技术 免疫荧光细胞化学技术是利用抗原与抗体可发生特异性结合的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，进而再利用这种荧光抗体（或抗原）去检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。根据检测目的以及待检物的不同特点，免疫荧光细胞化学技术有直接法、间接法、补体法、双重荧光标记法等不同形式。 （一）荧光抗体的制备 常用的荧光素分子主要有异硫氰酸（fluorescein-5-isothiocyanate，FITC）、四乙基罗丹明（tetraethylrodamine B200，RB200）、四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamine isothiocyanate）、藻红蛋白（phycoerthrin，PE）等，它们在不同波长激发光的作用下可发出不同颜色的荧光。 1．异硫氰酸荧光素标记抗体的制备 （1）所需试剂及设备 1）试剂：被纯化过的单克隆抗体或多克隆抗体、FITC、pH 9～9.5的碳酸盐缓冲液（Na2CO3 4.3g、NaHCO3 8.6g溶入到终体积为500ml的蒸馏水中）、PBS缓冲液（pH7.2）、DMSO； 2）材料与设备：透析袋、紫外分光光度计、Sephadex G25柱等。 （2）操作步骤 1）将纯化过的抗体放入透析袋中，在加有pH 9～9.5的碳酸盐缓冲液容器中4℃透析过夜，透析后抗体被转移到一小烧杯中备用。 2）配制FITC-DMSO溶液：称取适量FITC，加入DMSO溶解，使FITC终浓度保持在1mg/ml左右。 3）按照适当比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入到透析后的抗体溶液中。（通常，当IgG的浓度为1mg/ml时，FITC的加入量为50µg／ml；当IgG的浓度为5～10mg/ml时,FITC的加入量则降为25µg／ml）。 4）将上述标记物用PBS稀释至2.5ml，室温下避光搅拌2h。 5）用Sephadex G25柱除去游离荧光素分子，收集第一个PBS洗脱峰（荧光素蛋白结合峰），按照下式计算F/P值。 F/P＝2.87×A495/A280-0.35×A495，其中A495、A280分表代表495nm、280nm下的光吸收值, 适当的F/P值应在2～4之间。 6）分装，4℃避光保存备用。 2．四乙基罗丹明标记抗体的制备 （1）所需试剂与设备：四乙基罗丹明（RB200）、无水丙醇、生理盐水、pH 9～9.5的碳酸盐缓冲液（同上）、透析袋和Sephadex G50柱等。 （2）操作步骤 1）称取1g RB200和2g PCl5（五氯化磷）于研钵中仔细研磨5min后加入10ml 无水乙醇不断搅拌5min，再用滤纸过滤上述溶液，所得滤液将被用于抗体标记。（注：RB200可在 PCl5的作用下转变成磺酰氯SO2Cl，后者在碱性条件下可与蛋白质的ε-氨基结合从而实现对抗体的标记。） 2）取抗体（浓度一般在20mg/ml左右）适量，按照每ml抗体各加入1ml生理盐水和碳酸盐缓冲液的比例稀释，然后逐滴加入0.1ml RB200溶液,边加边搅拌。 3）0～4℃结合12～18h，再用生理盐水透析5～7h。 4）经Sephadex G50柱层析，除去游离荧光素。 5）分装，4℃避光保存备用。 3．藻红蛋白标记抗体的制备 （1）所需试剂与设备：纯化过的抗体（2.5mg/ml）、纯化过的藻红蛋白、异双功能试剂（SPDPH和SMCC）：SPDP[3-（2-pyridyldithio）propionic acid N-hydroxysuccinimide ester]、SMCC [succinimidyltrans-4-（N-maleimidylmethy）cyclohexane-1-carboxlate]（注：SPDP用甲醇配成1.3mg/ml浓度，SMCC用甲醇配成1.7mg/ml浓度备用）、77mg/ml二硫苏糖醇（DTT）、0.1mM N-乙基顺丁烯二酰亚胺（N-ethy maleimide，NEM）、不含Ca2＋、Mg2＋的PBS、甲醇、DMSO、Sephadex G25柱和Sephacryl S-300柱等。 （2）操作步骤 1）取0.25ml保存在60％(NH)4SO4中的PE（4mg/ml），经离心弃掉上清，并用0.25ml PBS重悬。 2）将上述重悬的PE溶液在室温下用150ml PBS透析30min，期间换液两次。 3）调整透析后的PE溶液浓度在1.4mg/ml（共约有0.7ml体积），加入16µl SPDP，室温孵育2～3h。 4）取纯化的抗体1ml（2.5mg/ml），加入20µl SMCC溶液，室温孵育1h，制备SMCC-抗体交联物。 5）加入30µl DTT溶液到第三步交联好的SPDP－PE中，室温孵育30min。 6）用Sephadex G25柱层析纯化SPDP－PE和SMCC-抗体交联物。 7）将纯化后的SPDP-PE和SMCC-抗体交联物混合，4℃振荡过夜。 8）加入80µl的0.1mM N-乙基顺丁烯二酰亚胺室温振荡孵育30min，终止反应。 9）利用Sephacryl S-300柱层析分离纯化PE标记的抗体，用PBS洗脱，收集第一个洗脱峰。 10）分装，4℃避光保存备用。 4．四甲基异硫氰酸罗丹明标记抗体的制备 （1）所需试剂与设备：纯化过的抗体、四甲基异硫氰酸罗丹明、0.01M PBS（pH 8.0）、DMSO、pH 9-9.5的碳酸盐缓冲液（同前）、透析袋、Bio-Gel P-6层析柱等。 （2）操作步骤 1）取10ml抗体（6mg/ml）入透析袋在pH 9-9.5的碳酸盐缓冲液中透析过夜，将透析后的抗体转移自一小烧杯中。 2）称取四甲基异硫氰酸罗丹明1mg，用DMSO溶解制成浓度为1mg/ml的溶液。 3）取上述四甲基异硫氰酸罗丹明溶液300µl逐滴加入到透析过的抗体溶液中，室温下避光搅拌2h。 4）Bio-Gel P-6层析柱，用PBS洗脱，收集先流出的红色结合物。 5）分装，4℃避光保存备用。 （二）免疫荧光细胞化学染色方法 1．直接法 （1）染色：给经过固定的细胞或组织材料滴加稀释至染色效价的荧光标记抗体，在室温或37℃孵育30min。染色的整个过程，切片应被放置在湿盒中。 （2）洗片：首先倾倒掉存留的荧光抗体，然后用pH 7.2或pH 7.4的0.01M PBS洗涤两次，每次5min，最后再用蒸馏水洗去结晶盐。 （3）用50％缓冲（0.5M的磷酸盐缓冲液，pH 9～9.5）甘油封固玻片，镜检。 2．间接法 常用的间接法主要有两种：双层法和夹心法。 （1）双层法 1）吸取经适当稀释的一抗加在经过固定的组织细胞切（涂、爬）片上，在染色用的湿盒中37℃孵育30min。 2）用pH 7.2的0.01M PBS洗涤两次，每次5min，最后再用吸水纸洗去残留的液体。 3）滴加荧光标记的二抗，置于湿盒中37℃孵育30min，再用 PBS洗涤两次，每次5min，用吸水纸吸去残留的液体。 4）缓冲甘油封固，镜检。 （2）夹心法：是一种用未标记的抗原检测组织或细胞中的抗体的方法。 1）滴加经适当稀释的特异性抗原于经过固定的组织细胞切（涂）片上，在染色用的湿盒中37℃孵育30min。 2）用pH 7.2的0.01M PBS洗涤两次，每次5min，最后再用吸水纸洗去残留的液体。 3）滴加可与抗原结合的特异性荧光标记抗体，置于湿盒中37℃孵育30min。 4）用pH 7.2的0.01M PBS洗涤两次，每次5min，最后再用吸水纸洗去残留的液体。 5）缓冲甘油封镜，镜检。 （三）免疫荧光染色的检测 免疫荧光标记的组织细胞玻片可用荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜等进行检测。 四、免疫酶细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术是最常用的免疫细胞化学技术，借助于酶细胞化学技术而非荧光标记来检测抗原的存在。主要有酶标抗体法和非标记抗体酶法两种主要形式。 （一）酶标抗体法 1．酶标抗体的制备 可用于抗体标记的酶一般应具有以下几点：①酶催化的底物必须是特异性的，容易被显示，易于在光镜下或电镜下观察；②用于免疫化学的酶要易于获得，便于商品化和 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 化；③在中性pH值时，酶应比较稳定，标记在抗体上的酶应在1～2年内活性不变；④所形成的终产物沉淀必须稳定，不能从酶活性部位向周围组织弥散，而影响组织学定位；⑤酶与抗体的连接不能影响抗体的活性；⑥在被检测的细胞或组织中，不能存在与标记酶相同的内源性酶或作用相似的酶。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）等。 酶标抗体的制备与荧光素标记抗体的制备不同，它需借助偶联剂的作用将酶链接到抗体分子上。常用的偶联剂有戊二醛、过碘酸钠、maleimide等。这些偶联剂与抗体的结合借助于共价键相互作用，因而是不可逆的，同时，偶联剂的加入还应不影响酶和抗体的活性，不会导致酶标抗体与细胞组织的其他成分发生非特异性结合。 2．染色方法 酶标抗体的染色同样包括直接法和间接法两种，以间接法为主。间接法的染色程序主要包括以下步骤。 （1）细胞组织切（涂、爬）片的准备与固定。 （2）用PBS或其他缓冲液洗涤切片三次，每次2min，溶解除去冰冻切片上的OCT包埋剂。（但当应用ALP标记的抗体时，应禁用二甲胂酸钠缓冲液洗涤，因为后者可使ALP失活。石蜡切片在洗涤后直接进行第四步）。 （3）根据需要，用甲醇＋0.3%过氧化氢处理切片15～30min，封闭内源性氧化酶的作用，PBS洗涤两次，每次2min。（应用ALP标记的抗体时可省略此过程）。 （4）在室温条件下，将切片放入到含0.05%Tween-20的PBS缓冲液中处理5min，以增强组织的通透性。 （5）用4％的Block Ace或0.01%～1%的BSA在适合中孵育切片15～25min，以阻断抗体与组织的非特应性结合。 （6）轻轻弃掉上述孵育液，根据需要滴加含0.2%BSA，0.05% NaN3的经PBS稀释的一抗。通常，每片滴加50～80µl，室温下湿盒中孵育1～2h，免疫电镜标本需要在4℃下过夜。（注：此处漂洗时应与对照组分开洗涤以防交叉污染）。 （7）PBS洗涤三次，每次2min，以除去非特异性结合的吸附抗体。 （8）用含0.05%Tween-20的PBS缓冲液洗涤2min后，滴加含0.2%BSA，1％正常血清的经PBS稀释的HRP酶标二抗，室温下湿盒内孵育45～60min。 （9）PBS洗涤三次，每次2min。 （10）显色：HRP标记抗体的显色剂为含有0.01-0.1%H202、0.01-0.05%DAB、0.01-0.1M Tris-HCl（pH7.4）的缓冲液。切片经PBS漂洗后，在室温黑暗条件下置入上述显色液中显色，镜检控制显色时间与速度。 （11）流水或PBS终止显色。 （12）系列乙醇脱水、Hemo-De透明、DPX封固、镜检。 （二）非标记抗体酶法 非标记抗体酶法由Sternberger等在酶标法的基础上发展而成，能有效降低背景，能最大程度保留抗体的活性，灵敏度高。主要有酶桥法（enzyme bridge method）和过氧化物酶抗过氧化物酶法（peroxidase antiperoxidase method, PAP），又以后者的应用较为广泛。 这两种方法均需先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后在第二抗体（亦称桥抗体）的作用下，将抗酶抗体与和组织抗原结合在一起的第一抗体连结起来，进而再将酶结合在抗酶抗体，最后经呈色反应来显示抗原的分布。所不同的是，在PAP法中，通常先让抗酶抗体与酶形成复合物（如PAP复合物），然后在桥抗体的帮助下，一次性将抗酶抗体、酶与一抗结合。 在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，同时还提高了方法的敏感性，且能节省第一抗体的用量。 1．PAP的制备 在离体条件下制备HRP与抗HRP的复合物（PAP复合物）的主要步骤如下。 （1）按常规免疫学方法制备抗HRP血清。 （2）制备PAP复合物。所需试剂包括：1mg/ml HRP溶液、2mg/ml HRP溶液、生理盐水、0.1M HCl、1M HCl、0.1M NaOH、1M NaOH、饱和硫酸铵溶液、50％硫酸铵溶液、透析液（48.6g NaCl, 1.5M NaOOCCH3 30ml, 1.5M (NH4)2SO4 30ml, 水5.94L）等；其步骤为： 1）取10.50ml抗HRP血清，加7.60ml HRP水溶液（1mg/ml），混匀后，室温放置1h。 2）4℃，16000g离心15min，小心弃掉上清。 3）用预冷的生理盐水溶解沉淀，4℃，16000g离心15min，重复4次。 4）加15.3ml HRP水溶液（2mg/ml），室温，持续搅拌1h。 5）用1M HCl及0.1M HCl调pH至2.3，沉淀物全部溶解变清，立即用1M及0.1M NaOH调pH至7.2。 6）慢慢加等体积的饱和硫酸铵，0℃放置45min。 7）0℃，35000g离心15min，所得沉淀用50%硫酸铵洗涤两次。 8）用10.50ml水溶解沉淀，置入透析袋中4℃透析过夜。 9）4℃离心，收集上清，加适量透析液使体积至10.50ml，分装后于4℃保存。 2．PAP染色方法 染色步骤包括：①切片准备及第一抗体孵育前处理步骤同酶标抗体染色间接法的1～5步；②切片与特异性一抗4℃孵育24h；③用过量的桥抗体孵育；④用离体制得的PAP复合物（常作1:30～300稀释）室温下孵育1～1.5h，使其能够被桥抗体连结在第一抗体上；⑤用DAB-H2O2液显色，镜下控制显色程度；⑥系列酒精脱水，二甲苯透明，DPX封固，镜检。 五、亲合组织化学 随着免疫组织化学方法的广泛应用，一些新的技术创新也不断涌现。其中最具代表性的就是一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素（lectin）、生物素（biotin）和葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A，SPA）等被应用于免疫细胞化学技术，从而建立了SPA-HRP法、ABC法、BRAB法和LAB法等一些新的细胞组织化学技术。这些技术一方面区别于古老的组织化学的分解、置换、氧化和还原，另一方面在本质上又不属于抗原抗体反应。因此，Bayer在1976年将其命名为亲合组织化学（affinity histochemistry）。 目前，亲合组织化学包括植物凝集素与糖类、抗生物素与生物素、葡萄球菌A蛋白与IgG、阳离子与阴离子、激素、维生素、糖及类脂质作用部位和受体等。由于抗原与抗体的相互作用从本质上讲也是一种亲和作用，所以，抗原抗体反应亦属于亲和组织化学范畴。亲合细胞化学引入免疫细胞化学后使得免疫细胞化学的敏感性得到进一步提高，更有利于在细胞或亚细胞水平对微量抗原（或抗体）的定位进行研究。 现以抗生物素-生物素免疫细胞化学染色为例，简要介绍亲和组织化学技术。 （一）抗生物素-生物素免疫细胞化学染色的原理 人们对抗生物素-生物素亲和作用的发现源于养殖实践。研究发现，来自饲料中的鸡蛋白成分中的抗生物素（又称卵白素，avidin）能和生物素（又称维生素H）结合，从而导致“维生素H缺乏症”的发生。进一步研究发现，抗生物素与生物素的这种亲和力远比抗原与抗体间的亲和力要高出100万倍，且不会影响彼此的生物活性。免疫细胞化学工作者受这一特殊现象的启发，便建立起来了抗生物素-生物素免疫细胞化学染色方法。 （二）抗生物素-生物素免疫细胞化学染色方法 常见的抗生物素-生物素免疫细胞化学染色方法主要有抗生物素-生物素-过氧化酶复合物技术（avidin biotin-peroxidase complex technique，ABC法）、桥抗生物素-生物素技术（bridged avidin-biotin technique，BRAB法）、标记生物素-抗生物素技术（labelled avidin-biotin technique，LAB法）三种，其中以抗生物素-生物素-过氧化酶复合物技术最为常用。 1．抗生物素-生物素-过氧化酶复合物技术（ABC）的原理 利用抗生物素分别将生物素标记的二抗和生物素标记的酶连接起来。与LAB法和BRAB法不同之处在于：①一抗不被标记物所标记；②生物素标记的二抗与ABC复合物相连接。ABC复合物是通过先将过氧化酶结合在生物素上、再将生物素-过氧化酶连接物与过量的抗生物素蛋白反应而制备的。 ABC法具有特异性强、敏感度高、背景染色浅等优点。 2．所需试剂 特异性抗体（单克隆或多克隆）；生物素标记的二抗；ABC复合物〔经验表明，当生物素与抗生物素的摩尔浓度之比为1：4时，能获得最佳满意效果，宜在应用前30min用0.05M 的Tris-HCl液（pH7.6）进行配制〕；丙酮；0.01M PBS（pH 7.2-7.6）；DAB-H2O2液〔含0.05％DAB、0.05M的TB液（0.5M Tris-HCl液+8.5g NaCl, 加水定容到1000ml， pH7.6）、0.01% H2O2〕；0.05M Tris-HCl液（pH7.6）；抗体稀释液（含0.1%BSA、0.02%KH2PO4、0.29%Na2HPO4·12H2O、0.8%NaCl、0.02%KCl、0.05%Tween-20溶液 50μl）；DPX（Distren 10g+5ml酸二丁+35ml二甲苯）。 3．操作步骤 （1）切片的处理：细胞涂（爬）片用含丙酮的福尔马林固定液固定30s；冰冻切片可用丙酮固定10min左右，0.01M PBS洗涤3次，每次5min；石蜡切片需先经脱蜡，然后用系列酒精脱水。 （2）加入一抗，室温孵育15min或4℃孵育24h。 （3）用PBS洗涤3次，每次5min。 （4）加生物素标记的第二抗体，室温孵育2h。 （5）用PBS洗涤3次，每次5min。 （6）加ABC复合物室温作用30min。 （7）用PBS洗涤3次，每次5min。 （8）用DAB-H2O2液显色，镜下控制显色程度。 （9）苏木素复染。 （10）系列酒精脱水，二甲苯透明，DPX封固，镜检。 1