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植物血凝素的提取.doc

植物血凝素的提取

Yvonne晓敏
2019-06-24 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《植物血凝素的提取doc》,可适用于医药卫生领域

植物血凝素也称为植物凝集素(PHA),可自制也可购自商品。自制的方法常用生理盐水提取法。(A)干品制备法()选广东鸡子豆g,用蒸馏水冲洗,置培养皿内用酒精一次性浸洗,倒掉酒精留间隙置℃。恒温箱内小时()在无菌条件下研碎鸡子豆,加生理盐水ml,摇匀后放入℃冰箱小时,第二天再加生理盐水ml,再置℃冰箱内小时。每小时摇荡一次。(也可一次性加ml生理盐水)()无菌条件下移入ml离心管内,rpm分钟。在无菌箱内把上清液分装于ml小瓶,置冰箱冷冻层备用()效价:外周血染色体制备每ml培养基加PHA约ml。注:若整个过程未在无菌条件下进行,分装时用G玻砂漏斗除菌即可。(B)鲜品制备法:()选择完整无破皮鲜菜豆g,用酒精浸泡分钟()在净化工作中用无菌盐水或蒸馏水漂洗二次,然后置无菌乳钵中捣成糊状,用ml无菌盐水浸泡封口()移入℃冰箱中置小时,中间摇动数次,次日rpm分钟,在无菌情况下分装上清液于ml小瓶内,置冰箱冷冻层备用。()效价:正式使用前先用一定量作效价测定,按效价使用。青豌豆的提取:取青豌豆克,加含M氯化钠的MpH磷酸缓冲液ml浸泡过夜,经膨胀后用组织捣碎机捣碎,倒入布袋中压榨出水提液,在沉渣中再力入磷酸缓冲液ml搅拌,浸泡时,压榨出水提液,合并水提液,量出总体积。加叠氮钠防腐。蛋白质沉淀:边搅边加入固体硫酸铵达饱和(每升溶液加硫酸铵克)冷藏过夜。吸取上清液,沉淀再用二层滤纸抽气过滤至干,即得粗制青豌豆素蛋白沉淀物硫酸铵糊。置冰箱保存。亲和层析分离()装柱:取直径为cm,长度为cm的层析柱,按(实验十五)操作,自顶部缓缓加入稀薄的SephadexG悬液,待凝胶上升至距顶柱约cm即可,用MNaCl溶液平衡分钟。()加样并收集:称硫酸铵糊克溶于mlIM氯化钠中,离心rPm分钟,取上层悬液上柱,用MNaCl洗脱收集每管ml,在nrn紫外光上比色检测,直至吸光值下降到接近零为止。此洗脱峰为不与葡萄糖亲和的杂蛋白峰。改用含M葡萄糖的MNaCl进行洗脱。收集每管ml,也在nrn处检测、直至吸光值下降至接近零为止。此洗脱峰为青豌豆素峰,再用MNaCl洗脱,再生柱,约需分钟。青豌豆素生物活性测定。取新鲜兔血lml于抗凝管中,离心去除血浆,血球用生理盐水洗涤离心rpmmin三次,直至洗液无血色为止,加生理盐水稀释倍制成兔红细胞悬液,置冰箱中备用。取点滴板一块在三孔中分别滴入对照生理盐水、nrn吸收峰的吸光值相同的杂蛋白和青豌豆蛋白各滴(用生理盐水将二种蛋白质稀释到吸光值相同),再分别滴入兔红细胞悬液滴。置℃保温分钟,取出后分别用玻棒在孔中轻轻搅动,比较三者红细胞的凝集情况。再将杂蛋白和青豌豆素溶液进一步用生理盐水稀释成:、l:、l:、:……再用上述方法检查比较它们对兔红细胞的凝集作用,求出它们最大生物活性的稀释倍数。兔红细胞的凝集作用也可用显微镜下进行观察、比较。注意事项:不同蛋白质凝集活性的比较需在以相同nrn吸光值的蛋白质量作对比,故必需稀释PHA的提取,称取g鸡子豆,粉碎,加入ml蒸馏水于度冰箱中放置,吸胀h再加入ml蒸馏水搅拌均匀,在组织捣碎匀浆机内rmin匀浆次,每次min置度冰箱抽提h,然后用纱布过滤,弃掉虑渣,滤液经rmin离心分钟,收集上清。将上清分成份,一份度保存,直接用于活性测定,一份加入(NH)SO至饱和度,充分搅拌,置度冰箱过夜,将过夜后的抽提液rmin离心分钟,收集沉淀,在上清内加入(NH)SO至饱和度,收集沉淀,合并两次沉淀,用适量蒸馏水溶解后作活性测定,一份用截留分子量为KD的中空纤维超滤膜进行超滤,收集超滤液和浓缩液作活性测定传统方法提取:将红芸豆粉碎,过目筛,得细粉。将红芸豆脱脂,按:(wv)体积比加入石油醚,度脱脂次,每次h,温室下将石油醚挥发除去,得脱脂芸豆粉,备用。称取g脱脂云粉,与生理盐水按:(wv)混合度放置h,层纱布过滤,过滤用离心机rmin离心min,收集上清液。

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