重组人角质细胞生长因子异构体（rhKGF2）滴眼液对角膜损伤的药效学研究（可编辑）

重组人角质细胞生长因子异构体（rhKGF2）滴眼液对角膜损伤的药效学研究（可编辑） 重组人角质细胞生长因子异构体(rhKGF2)滴眼液对角 膜损伤的药效学研究 重庆医科大学 硕士学位论文 2)滴眼液对角膜损伤 重组人角质细胞生长因子异构体(rhKGF-的药效学研究 姓名:李薇 申请学位级别:硕士 专业:药理学 指导教师:周远大 20080501重庆医科大学硕士研究生学位论文 符号说明 中文全称 英文缩写 英文全称吸光度 碱性成纤维细胞生长因 子 角膜新生血管 结缔组织生长因子 天 ’’ 改良的培 养基二甲基亚砜地塞米松 乙二胺四乙酸 胎牛血清小时角膜上皮下雾状混 浊 苏木精一伊红染色角质细胞生长因子 四甲基偶氮唑盐 分 生理盐水磷酸 盐缓冲溶液 ? 聚合酶链反应 .人重组角质细胞 . 生长因子一逆转录聚合式酶链反应重庆医科大学硕士研究生学位论文 链霉素亲和素一生物素一 .? . 过氧化物酶复合物 ? 盐酸乙二胺四乙酸缓冲 液 转化生长因子一? 星期 重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,‘论文中不包含 其他 人已经’发 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 或撰写过的研究成果,也不包含为获得重庆医科大学或其他教 育机构 的学位或证 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 而使用过的材料,与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任. 学位论文作者签名:丝日期:立堑咝:竺:厶 学位论文版权使用授权书 . 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定,即:研究生在攻读学 位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后,发 表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学.学校有权保留并向国家 有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,学校可以公 布学 位论文的全部或部分内容保密内容除外,可以采用影印、缩印或其他手段保 存论文. : 论文作者签名 指导教师签名: ’ 日 期:重庆医科大学硕士研究生学位论文 重组人角质细胞生长因子异构体一滴眼液对 角膜损伤的药效学研究 摘 要 研究背景 眼睛的视光学特征,主要依赖于角膜的透明组织结构。由于机械 伤、手术、化学烧伤及其他原因引起的角膜外伤是一种常见的眼表疾 病,损伤深达角膜的各个层面,极易感染引发溃疡。而当损伤深达角 膜基质层,修复时,活跃的角膜成纤维细胞过度增殖,生成大量胶原 填充缺损,新的胶原纤维排列不规则,在临床上留下不同程度的瘢痕, 严重影响视力。 ,属于成纤维 角质细胞生长因子 细胞生长因子家族中的第七个成员,能够介导多种组织表上 皮细胞增殖和分化?。随着研究深入,等从人肺中克隆到一种新 ,.,它的特异性受体 的生长因子 为酪氨酸激酶受体禾。.能促进角质上 皮细胞的增殖,刺激损伤组织周围上皮细胞的再生、分化和迁移,而 对成纤维细胞和内皮细胞则无直接作用,可以减轻伤口愈合反应射。 已经得到肯定的的治疗作用包括:?加速皮肤切口的损伤修复; . ?治疗溃疡;?激活角膜上皮干细胞,使其不断增值分化,从而促进 重庆医科大学硕士研究生学位论文 角膜上皮损伤的愈合。本课题组前期通过对.的氨基酸序列突 变,研制出新的变构体:人重组角质细胞生长因子..,一专利号: ,保留其促进上皮生长的作用,改变其促进成纤维细胞生长 作用为抑制,用于治疗肝纤维化,取得较好结果【。 目的 本研究通过在体实验和离体实验,研究.滴眼液在、离体 实验中对兔角膜损伤的治疗作用,并观察.对兔角膜成纤维及 上皮细胞的生长、增殖的影响,初步探讨其作用机制。 方法 .只家兔,均以 ‘的氢氧化钠溶液建立碱烧伤模型, 选左眼为实验眼,随机分成组。其中组为治疗组,分为种浓度 .%、.%、.%一滴眼液;阳性对照组:贝复舒 滴眼液;溶媒对照组:一滴眼液的溶媒。裂隙灯下观察各组角膜 上皮愈合速度率及发生,光镜观察角膜组织学形态变化。 .只家兔,均在显微镜下行双眼板层切割损伤模型,随机分 为组,其中组为治疗组,分种浓度.%、.%、.% ?一 .滴眼液;另组分别为:对照组: 滴眼液;地塞米松对照组:地塞米松磷酸钠滴眼液. ?。; 溶媒对照组:.滴眼液的溶媒。镜下观察各组兔术后角膜上皮愈 合速度率,通过裂隙灯观察角膜上皮下雾状浑浊差别,电 镜及光镜观察角膜组织学形态、超微结构变化。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 原代培养兔角膜成纤维及上皮细胞,通过、等技 . 术,检测.对兔角膜成纤维及上皮细胞生长情况的影响,并初 步探讨其作用机制。 结果 .建立兔角膜碱烧伤模型,模型成功率%,并诱导。在碱 烧伤后 内,各浓度.滴眼液均能显著促进上皮愈合,与溶 媒对照组相比,有显著差异.。不同时间点比较各组上皮愈合 率,治疗组均优于溶媒对照组并有显著性差异.。且.滴 眼液低浓度也能抑制生长。 .建立兔角膜板层切割损伤模型,模型成功率%,并诱导 、 发生。术后 ,各.滴眼液治疗组评分及前岬 角膜基质层内平均角膜细胞数均明显低于及溶媒对照组 .,光镜及电镜检查结果显示.滴眼液治疗后,兔角膜成纤 维细胞活化及增殖程度明显低于贝复舒对照组及空白组。 .培养兔角膜成纤维及上皮细胞,并鉴定。实验结果显示 斌一在. ?一浓度范围,均能显著抑制兔角膜成纤维细 胞的生长,同时促进兔角膜上皮细胞增殖,并在浓度为最为适宜。结果显示经. 处理后的角膜成纤维细胞, 一、 的表达量均下调,作为内参的表达量相 、的表达抑 ,提示.可能是通过调节一 同 制角膜成纤维细胞增殖。 结论 重庆医科大学硕士研究生学位论文 ..滴眼液在. ..%浓度范围,均能够显著促进兔角 膜碱烧伤模型中上皮的愈合,抑制生长,改善角膜碱烧伤愈后。 ..滴眼液在...%浓度范围,可抑制角膜损伤后的 角膜成纤维细胞过度增殖、活化,抑制早期形成。 .在. /浓度范围,可抑制离体的兔角膜成纤 维细胞生长,同时促进兔角膜上皮细胞的增殖。 的表达,发挥作 .一可能通过调节一、 用。 关键词:角质细胞生长因子一;碱烧伤;角膜新生血管;角膜上皮 下雾状浑浊;细胞培养一 . . . . ,,旬 . 。 一. ?, .? : .’重庆医科大学硕士研究生学位论文 一 .一, ,一 ..:; ? ; , ,. , 一, , , “ , . . . : , . . .. , 一. , .. ’ 重庆医科大学硕士研究生学位论文 /%. .%,.%,. . 一 . . ? .. . %一.%,.%,. . .一, , . . . 一 , . .. ., 一 。 重庆医科大学硕士研究生学位论文. ? . ?。、. . ‘..,一 .% .%, .%. %. , .. . , 一.%. , 一.%. . 一 . . 一,, . . ’: . . . 一% . %, . .%.%一 . ,... .一. 一 ;;; ; : 重庆医科大学硕士研究生学位论文 重组人角质细胞生长因子异构体滴眼液一 对角膜损伤的治疗作用及作用机制研究 .?‘‘一 刖蟊 眼睛是心灵之窗,是我们感知外界的最重要的器官,随着我国物质生活水平 的日益提高,人们对生活质量的要求也日益提高,而眼盲及低视力等眼部疾 病严 重影响了人们的生活质量。特别是由于眼外伤引起角膜瘢痕形成,临床上缺 乏有 效简单的治疗预防手段,导致我国人群中眼盲及低视力问题日趋严重。 一、由于机械伤、手术、化学烧伤及其他原因引起的角膜外伤是一种常见的 眼表疾病,损伤深达角膜的各个层面,严重的角膜上皮缺损,愈合非常缓慢, 极 易感染发生溃疡,在临床上轻者形成云翳,重者形成永久性疤痕称为白斑。而当 损伤深达角膜基质层,在修复时期,活跃的角膜成纤维细胞过度增殖,生成大量 胶原填充缺损,新的胶原纤维排列很不规则,在临床上也留下不同程度的瘢痕。 这些瘢痕组织的形成也就是角膜纤维化,严重影响视力。现在临床上仍缺乏安全 有效的预防和治疗药物。 现在临床上眼外伤性疾病的主要治疗手段包括手术和药物治疗两大方面。虽 然进行角膜移植手术后可恢复视力,但是面临角膜供体缺乏,不可避免的术后并 发症,手术费用昂贵等问题。近几十年来,临床常用药物治疗。比较传统的药物 为皮质类固醇类药物【,它能减少及蛋白质合成,抑制成纤维细胞的增生, 但临床应用中发现皮质类固醇类药物有许多并发症和副作用,甚至导致更严重的 疾病【】,如:激素性青光眼、类固醇性白内障、激素性视神经萎缩、黄斑水肿、 诱发感染致角膜溃疡穿孔、创面延迟愈合等。因此,如何找到能够促进角膜创 伤的修复而又能有效抑制成纤维细胞活性的药物,成为研究中的重点和焦点问题。 二、多年以来许多学者的研究结果证明,细胞生长因子在角膜损伤修复中起 到重要的作用 .。如果从参与角膜上皮和基质层修复相关的生长因子入手, 研 究其在疾病变化过程中的调节作用,有可能抓住引起角膜损伤后上皮修复以及其 重庆医科大学硕士研究生学位论文 纤维化发展的主要环节,我们已经筛选出在角膜中有受体高表达 的角质细胞生长因子一作为我们研究的重点。 生长因子是一组相对低分子量蛋白质,对哺乳动物细胞的发育、维持和修复 具有重要作用。在眼球组织中发现了数种生长因子。如角膜基质,房水中均发现 了碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子等【】。它们的共同作 用是调节正常角膜的发育和损伤修复过程。其中研究比较成熟的为重组牛碱性成 ,,贝复 纤维细胞生长因子 舒,已上市销售,且年销量近亿元。贝复舒在治疗眼部疾病中有突出的疗效与安 全性,但是贝复舒也存在着一个巨大的缺陷,它只能促进角膜创伤的上皮细胞愈 合,而对角膜病变后期的基质层修复没有治疗效果,甚至还通过促进角膜成纤维 细胞增殖加重瘢痕形成,引起新生血管深入角膜。 .,又称为成纤维细胞生长因子. .,., 是超家族中角质细胞生长因子家族的一员。在年,由等【】首次 从人胚肺成纤维细胞培养液中纯化得到的一种细胞因子,并被证实有促进上皮来 源细胞增生的作用。实验证明,能明显地促进兔角膜上皮细胞增殖引。且在 培养的兔结膜及角膜基质成纤维细胞及角膜上皮细胞中均有存在,所 以普遍认为以旁分泌的形式刺激角膜上皮细胞增生【。随着研究的深入, 等【】从鼠的胚胎中扩增到与具有高度同源性的一种崭新的细胞因 子,称为.。.主要由间充质细胞合成,是胚胎器官发育中重要的多功 能信号分子。 三、抗角膜组织纤维化的理想药物应包含两方面的作用:?促进上皮细胞修 复;?维持角膜基质胶原纤维排列整齐及其含水量的恒定;本研究拟用的人 重组 角质细胞生长因子变异体.正是具有这两方面的作用。 .不具备抑制成纤维细胞生长的作用,本研究拟用通过对其天然 正常的 氨基酸序列的多层面改造,自行研制出适于大肠杆菌表达系统的.。这是一 种新型人角质细胞生长因子突变体,其特征在于将位的半胱氨酸突变为非极 性氨基酸,并在末端进行缺失突变。已有研究表明,.除了和天然 一样,通过与上皮细胞细胞膜上的受体作用,特异性促进上皮细胞的增殖、分 化 和迁移,还显示了与天然所不同的生物学活性??对成纤维细胞的生长具有 重庆医科大学硕士研究生学位论文 抑制作用【?。.抑制成纤维细胞生长的机制可能有以下两点:?一 与结合后可直接抑制成纤维细胞的生长。?恤.可能通过占据 引起与其受体结合减少而抑制对成纤维细胞的促生长作用。它的这一 生物学特性对于伤损伤的初期修复及其愈后有相当应用价值。因此,我们认 为 可以将一这具有特殊的生物学功能的滴眼液应用到角膜的抗纤维化治疗当 中,达到既能促进上皮细胞移行分化增殖,又能抑制基质层成纤维细胞生长 的作 用。 本实验分为离体实验和在体实验两部分。其中离体实验选择原代培养的兔角 膜成纤维细胞和上皮细胞,通过、.等实验方法。观察一是否 具有促进上皮细胞同时抑制成纤维细胞生长的特殊作用,并初步探讨一作 用的靶点及作用机制。在在体实验中,我们选择兔为实验动物并建立两个动 物模 型。动态观察所选定的三种浓度.滴眼液对兔角膜碱烧伤及机械性损伤诱 导的上皮缺损、、角膜混浊程度的影响,通过染色及透射电镜技术观察 .滴眼液在不同时相点对角膜组织学及超微结构形态变化的影响。探讨 滴眼液在治疗角膜损伤中的意义,并找出最佳治疗浓度的滴眼 . 液。为将来.滴眼液应用于临床奠定实验基础。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 第一章滴眼液对碱烧伤诱导的兔角膜上皮缺 损及新生血管的抑制作用 角膜碱烧伤是临床常见难治的致盲性眼外伤之~,角膜上皮缺损及的发 。文献报道【 生是其主要并发症【 ,眼表面碱烧伤后,迅速重建完整眼表结构对改 善其愈后有积极作用。目前,临床常用的药物为贝复舒即碱性成纤维细胞生 长 因子,,它能促进上皮增殖,但同时具有诱导发生、加重角膜瘢痕 形成的副作用。角质细胞生长因子或一,能够介导多种组织表上 皮细胞增殖和分化,且不作用于中胚叶源的组织,因而不会诱发。本课题 组前期通过对.的氨基酸序列突变,研制出新的变构体.专利号: ,保留其促进上皮生长的作用,改变其促进成纤维细胞生长作用为抑 制。本部分实验建立碱烧伤诱导的兔角膜上皮损伤及模型,通过裂隙灯显微 镜、病理学观察等方法,分析给予.滴眼液治疗后,角膜上皮愈合及新生 血管生长等情况。 实验材料 .材料 成都科龙化工试剂厂 氢氧化钠粉剂 左氧氟沙星滴眼液 朗悦制药有限公司 珠海亿胜生物制药有限公司 贝复舒滴眼液 %医用丁卡因滴眼液 重庆医科大学附一院药剂科 氯化钠注射液 重庆医科大学附一院药剂科 .% %荧光素钠溶液 重庆医科大学附一院药剂科 多聚甲醛 成都科龙化工试剂厂 苏木素溶液 重庆北碚化学试剂厂 伊红溶液 重庆北碚化学试剂厂 .主要试剂的配制 重庆医科大学硕士研究生学位论文 . ?.。氢氧化钠溶液: 取的氢氧化钠充分溶解后,加蒸馏水至。 .%中性甲醛溶液: 量取甲醛溶液,加入蒸馏水至,摇匀即可。 ..滴眼液: 取适量.配制成.%,.%及.%三个浓度的滴眼液,调 为.,渗透压为 ?~,微孔滤膜过滤除菌,备用。酶联免疫吸附法 鉴定滴眼液中一的生物活性。 .主要设备和仪器 .裂隙灯显微镜 上海美沃公司 .眼科显微镜 苏州医疗机械厂 普通光学显微镜 日本 ? ?型恒温磁力搅拌器 杭州仪表电机有限公司 梅特勒托利多上海仪器公司 型计 其余同上。 .实验动物 健康成年家兔只,雌雄不限,无眼部疾患,兔龄约个月,体重.~. 。 购自重庆医科大学实验动物中心,合格证号:一渝,环境设施合格 证号:一渝。 实验方法 .碱烧伤动物模型的建立 实验动物均以%戊巴比妥钠. ?静脉注射麻醉。左眼以丁卡因滴眼 ?.的氢 液麻醉次,置开睑器,暴露角膜,用棉签拭去眼表多余水分,将 的单层滤纸片上,然后放置于兔左眼角膜中 氧化钠溶液山滴于直径为. 央, 后取下,立即用 生理盐水充分冲洗眼表面及结膜囊。观察兔角膜深 实质层水肿,混浊呈瓷白色,虹膜纹理不清,角膜缘缺血//。兔角膜中度碱 烧伤模型成功,成功率达%。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 .实验分组 将碱烧伤模型兔只随机分为组,每组只。其中组为.治疗 组,分别以种浓度体外细胞试验筛选结果:.%、.%、.%. ?一滴眼液治疗;溶媒 滴眼液治疗:阳性对照组:贝复舒, :以.滴眼液的溶媒治疗。每天滴眼次,每次滴;各实验组在 对照组 碱烧伤治疗间隙均给予.%左氧氟沙星液滴眼每天次,防止感染,直至实验结 束动物被处死。 .在体观察 碱烧伤后每天用裂隙灯显微镜检查眼前段大体情况并进行记录,重点观察畏 光、眼睑、结膜是否水肿、有无分泌物、结膜有无充血、角膜溃疡、角膜透 明度、 角膜上皮荧光素染色面积及发生的情况。 .上皮愈合情况 碱烧伤后第、、、、、、、、 荧光素染色照相,照片经计算 机图像分析系统处理,角膜上皮愈合率按以下公式计算:角膜上皮愈合率 着色面积.观察时着色面积/ 着色面积 %。并计算伤后前内上皮生长 。 速度,上皮生长速度 着色面积. 着色面积/ .的动态定量分析 于伤后、、、、、、、 ,以裂隙灯显微镜观察生长情 况。长度计算:以兔角膜点至点,点至点划线将角膜分为个象限,分 别选各象限内最长的一支血管长度,采用对应相相应长度刻度的裂隙灯光带 测量 长度。角膜新生血管面积计算: /..】,其中为累及 角膜的圆周钟点数,即所取的血管长度,兔角膜半径.:. 。总 面积等于个象限面积之和。新生血管诱导率第天每组内发生兔的例数 /%。 .组织病理标本观察 ,随机处死各组动物只,完整剪下角膜置于 分别于伤后第、、 %中性甲醛中固定, 后取出,常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色, 重庆医科大学硕士研究生学位论文 光镜下观察,照相。 .统计学分析 计量资料以士表示,采用 .软件进行单因素方差分析检验。 实验结果 .角膜上皮愈合情况 .滴眼液在. 一.%浓度均可显著促进碱烧伤后 内兔角膜上 , 皮愈合图.,在..%间有剂量依赖性表.。碱烧伤后第 .%.组上皮愈合达.%,溶媒对照组仅为.%.;第 天,.%.组上皮愈合达%,但溶媒对照组上皮愈合率仅为.% 后,各治疗组近完全愈合,几乎无上皮再脱落发生;溶媒对照组 口.;第 组直至第 ,仍表现为荧光素着色区的多次扩大及上皮层的多次脱落。 .. . ? .. . .% .%. % 弓翟惑鲎吾墨求【丞声 . 一 . : :‘.. 图 兔角膜碱烧伤后内上皮生长速率 重庆医科大学硕士研究生学位论文 表 兔角膜碱烧伤后角膜上皮的愈合率%,::, %,: ,. : : .; :”‘ .角膜新生血管生长情况 碱烧伤后 观察:各组均有新生血管伸入角膜;其中.%.及溶媒 对照组较粗短,呈毛刷状侵入角膜,无血管网形成;.%一及 .%一组程度最轻,仅见新生血管芽长出,血管细小、色淡: 组出现致密的新生血管芽,呈毛刷状侵入角膜,血管较粗,色红,有血管网生 成。 碱烧伤 后观察:.%一及溶媒对照组生长几乎停止,只留 有深达角膜中央的粗大血管,周围大部分血管纤细、稀疏,趋于消退:.% .及.%.组已停止生长,新生多数未达角膜中央, 周边均退化,消失;组仍处于稳定生长时期,多条粗大血管深入 角膜中央,并在角膜中央形成血管网,使角膜浑浊加重,在角膜中面积达. 。 碱烧伤后观察:各一滴眼液治疗组及溶媒对照组几乎完全退 化,角膜混浊变浅:组周边细小血管退化,但角膜中央仍有残留的粗大血管 网,角膜浑浊明显。 结果表明.滴眼液高浓度.%微弱促进生长;而中、低浓 度.%、.%则能抑制生长如表?;对的发生 有更明显的诱导作用如图.。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 表. 各组兔角膜碱烧伤后不同时间角膜新生血管生长面积,:孽士, 趣, , :.. : :.; 黼 苓箩乙 ..圈. :圉.圜.圈. . 墨;苎 .%.%. % . 一 图角膜碱烧伤诱导率 .病理结果观察 ..碱烧伤后. 观察: 碱烧伤后第 ,各组角膜全层坏死,基质水肿,.治疗各组及 治疗组角膜上皮再生开始,上皮缺损面积明显小于溶媒对照组。 碱烧伤后第 ,.滴眼液各治疗组及组角膜上皮完全修复,新 生上皮层有.层细胞稀松排列,但基质层仍呈坏死状,浅层有少部分炎性细胞 浸 润,以为主。而溶媒对照组角膜上皮大面积缺损,基质水肿坏死,浅层大量 炎性细胞浸润。 , 碱烧伤后第 .滴眼液各治疗组如图一、.、.角膜上皮 层已完全愈合,在角膜缘及基质层可见白细胞浸润,角膜中央炎性细胞较少。而 重庆医科大学硕士研究生学位论文 角膜上皮层仍有大面积的缺损,缺损部分 及溶媒对照组如图、., 及其周围上皮下基质层中可见大量白细胞浸润。 ..碱烧伤后第 观察: ,.滴眼液各治疗组如图.、.、.角膜上皮 碱烧伤后第 层已完全愈合,基质层内炎性细胞减少,成纤维细胞略有增生。及溶媒对照 组如图.、一,角膜上皮层仍有部分缺损,基质层内仍有大量炎性细胞及 成纤维细胞。 观察: ..碱烧伤后第 碱烧伤后 ,斌.滴眼液各治疗组如图.、.、?愈后良好, 角膜上皮层完全愈合且有.层细胞紧密排列,基底膜完整,细胞核和形态稍不规 则,基质层胶原纤维略有增生,紧密排列;组如图?上皮层也完全愈 合,新生的上皮层覆盖区有.单层细胞排列,基质层胶原纤维纤明显增生,维排 列紊乱;溶媒对照组如图.角膜上皮虽已完全愈合,但新生上皮层仅有单 层细胞排列,且并未形成完整基底膜。 小结 .滴眼液在.%一.%浓度范围,能显著促进兔角膜碱烧伤后上皮 愈合,效果明显优于,低浓度.滴眼液.%、.%还具有 抑制角膜新生血管生长,改善角膜碱烧伤愈后的作用。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 第二章滴眼液治疗兔角膜损伤的实验研究 角膜机械伤或手术后,通过其自身的修复过程虽可以恢复角膜组织的正常结 构,但常导致瘢痕形成。角膜创伤修复过程极其复杂,包括损伤后的炎症反应、 损伤邻近细胞的移行、成纤维细胞的激活、细胞外基质的重构和排列等。细胞间 信号传递的细胞因子提供了上皮与基质问作用的基础,不同的角膜损伤其创伤愈 合反应是不同的。之前的实验中已经证实.在兔角膜碱烧伤模型中能促进 上皮生长,但有文献报道【】外源性.在角膜机械性损伤中,能抑制上皮生长。 因此我们建立兔角膜板层切割模型,通过裂隙灯观察角膜上皮愈合率,角膜上皮 下雾状浑浊,通过电镜及光镜观察角膜组织学形态、超微结构变化。以判 断.滴眼液在角膜机械损伤后对上皮愈合的影响,以及它能否减轻组织修 复时瘢痕的产生。 实验材料 .材料 .%地塞米松磷酸钠滴眼液 安徽芜湖三益制药有限公司 戊二醛 成都科龙化工试剂厂 其他试剂同前。 .主要试剂的配制 .%中性戊二醛溶液 ...取%戊二醛,加入蒸馏水 ,摇匀即可。 及.磷酸缓冲液 其他试剂配置同前。 .主要设备和仪器 型荷兰 透射电镜 手术显微器械 苏州医疗器厂 其他仪器同前。重庆医科大学硕士研究生学位论文 .实验动物 健康成年家兔只,雌雄不限,无眼部疾患,兔龄约个月,体重..蚝。 购自重庆医科大学实验动物中心,合格证号:渝,环境设施合格 证号:.渝。 实验方法 .角膜损伤动物模型的建立 家兔均采用%戊巴比妥钠. ?‘’静脉注射麻醉。以.%左氧氟沙星滴眼 液冲洗结膜囊,.%丁卡因滴眼液表面麻醉次,缝线开眼,暴露角膜,用棉签 拭去眼表水分,在手术显微镜下以角膜为中心,直径. 的环钻行压迹划痕, 用剔须刀片剥除上皮及其部分角膜基质层厚达 ,切割面平滑,立即以 .%左氧氟沙星滴眼液冲洗眼表面,防止感染。所有手术模型均为同一人操作 完 成。 .各组用药 将角膜板层切割模型成功动物只随机分为组,每组只:其中组为 .治疗组,分种浓度体外细胞试验筛选结果:.%、.%、.% 一滴眼液;另组分别为:对照组: ?。滴眼液; 地塞米松对照组:地塞米松磷酸钠滴眼液. ?一;溶媒对照组:一 , 上 滴眼液的溶媒。首次给药各组以其相应治疗药物“滴于滤纸直径. 后移去,之后每只眼滴眼液频率为;每天次,每次滴, 贴付于角膜切削区 直至实验结束处死动物。各实验组在术后治疗间隙均给予.%左氧氟沙星液滴 眼 每日次,防止感染,至 后上皮完整覆盖眼表。 .在体观察 术后每天用裂隙灯显微镜检查眼前段大体情况并进行记录,重点观察畏光、 眼睑肿胀程度、分泌物、虹膜充血、角膜溃疡、角膜透明度。 .上皮愈合情况观察 术后第、、、、 荧光素染色照相,照片经计算机图像分析系统处理, 角膜上皮愈合率按以下公式计算:角膜上皮愈合率 着色面积.观察时着色面 重庆医科大学硕士研究生学位论文 积/ 着色面积×%。并计算伤后前 内上皮生长速度,上皮生长速度 。 着色面积. 着色面积/ .角膜的观察评分 按方法分级并记录: 分:角膜完全透明; .分:角膜轻微混浊,裂隙灯显微镜斜照法很难发现混浊; 分:角膜低密度混浊,裂隙灯显微镜斜照法可观察到点状混浊; 分:角膜轻度混浊视力受损,裂隙灯易发现混浊,但不影响虹膜纹理观察; 分:角膜中密度混浊,影响虹膜纹理观察; 分:混浊严重,虹膜纹理模糊不清。 组织学检查 . 、、 各组在观察照相后,各组分别随机处死只动物,完整剪下角 膜,均匀分成两半,其中一半经%甲醛固定,常规脱水包埋,切片,染色, 光镜观察:另一半戊二醛固定,制备超薄切片进行透射式电镜观察。 .图像分析 .?图像分析系统对染色标本进行前 角膜基质内平均角 膜细胞计数。基质内成纤维细胞数的计算:深度从基底膜开始 深,取切削 外两个 区中央岬及临近. 宽度内成纤维细胞数,平均数即为 的成纤维细胞数。 .统计学方法 计量资料以表示,采用 .软件进行单因素方差分析检验。 实验结果 .在体观察 术后每天用裂隙灯显微镜检查眼前段大体情况,均无畏光、流泪,上皮脱落 等刺激反应。 .角膜上皮愈合情况观察重庆医科大学硕士研究生学位论文 由图一所示,角膜板层切割术后 内各用药组角膜上皮再生长速率无显 著性差异.。术后兔眼角膜上皮愈合平均时间天.滴眼液.%、 .%、. %组分别为:.?. 、.. 、.?. ;滴眼液 组:.?. ;溶媒对照组:.?. ,组间 ;地塞米松滴眼液组:.?. 差异无显著意义.。 。. 矗 舌. 叠 曼. 每 专. 厶 . 曩 兰. . .%.%.% ? ? ?? 图 兔角板层切割术后内上皮生长速率.~, ?一, .角膜的观察评分 由图.所示术后各时间点,药物各治疗组评分较空白组轻, 其评分与空白组比较有显著性差异.。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 口.% . 口.%一 . 口.% 叠 口 上 . 口 口 . : :。.. 图兔角膜板层切割后上皮下浑浊评分.病理结果观察 ..病理结果 术后 由光镜观察可见:.滴眼液治疗各组如图?、?、 及地塞米松组如图.角膜板层切削区再生上皮稍厚,基底细胞轻度水肿,体 积增大,基质浅层成纤维细胞稍有增殖,其中.%一组稍佳。对照 组图.角膜板层切削区再生上皮细胞增厚,上皮及基底细胞轻度水肿,可见 空泡样变性,大小不一,呈不规则柱状结构,上皮细胞连接稍疏松,基质浅层 成 形态及排列不规则。对照组动物基质浅层成纤维细胞 纤维细胞稍增殖明显, 稍有增殖。溶媒对照组图.动物角膜板层切削区上皮层厚薄不均,在切削区 可见明显增生,前基质层成纤维细胞增殖明显,胶原排列紊乱疏松。 术后 由光镜观察可见:. .滴眼液各疗各组图、.、 . 及组如图?角膜板层切削区上皮持续增厚,基底膜、基质浅层 成纤维细胞数量的增多不甚明显,其中仍以.%.组更佳。对照组 图.角膜板层切削区上皮持续增厚且明显大于.%.药物组,上 皮细胞形态不规则,基底细胞未恢复高柱状,基质浅层仍有大量成纤维细胞分布。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 溶媒组图.动物角膜板层切削区上皮层厚薄不均,在切削区可见明显增生, 上皮细胞形态不规则,基底细胞未恢复高柱状,浅层基质胶原纤维排列疏松但成 纤维细胞数量开始减少。 ..角膜浅基质层角膜才成纤维细胞数目的改变: 板层切割术后不同时间角膜基质层前肚内,平均角膜成纤维细胞数如 表一所示。正常对照组前“角膜基质内平均细胞数为.士.个。 表角膜板层切除后前角膜基质层内平均角膜成纤维细胞数趣, 工趣,: :’.;缸 :’’.. .电镜结果观察: 板层切割术后 ,.%组图? 电镜观察可见:上皮基底细 胞增大,分裂像增多,上皮细胞内可见功能活跃的细胞器存在,半桥粒连接均匀, 完整。前基质可见略有增殖的成纤维细胞。细胞肥大、胞浆丰富,胞浆内空泡形 成。扩张的粗面内质网增多,线粒体肿胀,高尔基体发达,细胞周围可见新合成 的胶原纤维,较细、排列紧密,呈一定的极向顺序排列。对照组图? 电镜观察可见:上皮基底细胞异常增大,分裂像增多,上皮细胞内大量扩张的粗 面内质网、明显肿胀的线粒体及呈网状分布的微丝;无半桥粒连接。前基质可见 大量成纤维细胞。细胞肥大、胞浆丰富,胞浆内空泡形成。扩张的粗面内质网增 多明显,线粒体肿胀,高尔基体发达,且含有丰富的微管、微丝,染色质着边, 细胞周围可见新合成的胶原纤维。较细、疏松、排列紊乱。失去了板层结构。溶 .电镜观察可见:上皮细胞形态与.%斌一组类似, 媒对照组如图 但未形成完整的半桥粒连接,前基质可见大量活跃的成纤维细胞,新分泌的细小 重庆医科大学硕士研究生学位论文 胶原纤维散乱分布在细胞周围。 板层切割术后 ,.%.组图?电镜观察:上皮基底细胞恢 复正常大小,排列整齐,半桥粒连接均匀,完整。前基质成纤维细胞,形态恢复 正常,已转为功能不活跃的细胞。细胞周围胶原粗细仍不均匀、排列紧密,呈一 定的极向顺序排列。对照组图.电镜观察:上皮基底细胞恢复正常大 小,但排列不齐,未形成半桥粒连接。前基质成纤维细胞,大部分形态恢复正常, 但仍可见增生较活跃的成纤维细胞,胞浆内仍见较多肿胀的线粒体及扩张的粗面 内质网,细胞周围可见新合成的胶原纤维。细胞周围胶原粗细仍不均匀、排 列紧 密,呈一定的极向顺序排列。溶媒对照组电镜观察图.:上皮基底细胞恢 复正常大小,排列整齐,半桥粒连接均匀、完整。前基质成纤维细胞,大部分形 态恢复正常,但仍可见增生较活跃的成纤维细胞,胞浆内仍见较多肿胀的线粒体 及扩张的粗面内质网,细胞周围可见新合成的胶原纤维。细胞周围胶原粗细仍不 均匀、排列紧密,呈一定的极向顺序排列。 小结 .滴眼液可抑制上皮细胞的过度增殖,但其再覆盖速率并 不同浓度的 未明显减慢:通过病理检查可见.各剂量组的上皮细胞的形态恢复较好, 细胞层数正常,一个月时己能形成完整均匀的基底膜,而溶媒组上皮细胞体积增 大、细胞层数增多,细胞排列混乱。术后各时间点,经不同浓度.药物治 疗后角膜的评分均小于溶媒组.,并未见明显毒副作用,但抗纤维 化作用前期均不如对照组。重庆医科大学硕士研究生学位论文 第三章.对离体角膜成纤维细胞及上皮细胞的 作用及机制研究 在前面的实验中我们已初步确定.在改善角膜损伤愈后中的积极作用, 但其作用机制并不明确。在本部分实验中,我们选取体外培养的角膜成纤维及上 皮细胞,通过法鉴定.直接作用于这两种细胞,对其生长、增殖的影 响,并通过技术初步探索其作用机制。 实验材料 .试剂与药品 . 富进生物制药有限公司 富进生物制药有限公司 .试剂盒 博士德公司 一抗 博士德公司 /培养基 公司 公司 三抗青霉素链霉素两性霉素 .’ 公司 胎牛血清 杭州四季青生物工程公司 胰蛋白酶 公司 公司 上海生工进口分装 国产分析纯 国产分析纯 %乙醇 国产分析纯 公司 试剂瑚虹公司.%盐酸奥布卡因 沈阳绿洲制药有限责任公司 其他试剂同前。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 .主要试剂配制 ..%胰蛋白酶一.%溶液 . 精确称取胰蛋白酶. 溶于不完全培养基中,. , 膜过滤,除菌,分装,.?保存待用。 ./培养基 三蒸水配制/培养液,加%灭活胎牛血清及抗生素终浓度为: .。. 每 ,除菌,以 膜过滤 ?.,用调节 ,置?冰箱保存待用。 瓶分装 .溶液 称取 ,放入小烧杯中,加入 .充 . ?一, 分溶解,终浓度为 ?一。. 的微孔过滤器除菌,分装,保存。两 周内有效。 .溶液 . . . . 称取 ,? , 于 , 三蒸水。高温高压灭菌,?保存待用。 其他试剂配制同前。 .主要仪器与设备 紫外凝胶成像分析系统 美国公司 . 扩增仪 美国公司 ?型电泳仪 上海复星高科技有限公司 .恒温水浴箱 江苏太仓实验设备厂 上海天平仪器厂 电子天平 . 苏州净化设备厂 型超净工作台 .恒温振荡器 江苏太仓实验设备厂 微量进样器 德国公司 .型电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂 水平离心机 北京医用离心机厂 超级纯水仪 美国公司重庆医科大学硕士研究生学位论文 上海浦江分析仪器厂 .定时磁力搅拌器 其他仪器同前。 .实验动物 健康成年家兔只,雌雄不限,无眼部疾患,兔龄约个月,体重..蝇。 购自重庆医科大学实验动物中心,合格证号:.渝,环境设施合格 证号:.渝。 实验方法 .兔角膜成纤维胞的原代及传代培养 采用耳缘静脉注射空气法将兔致死,无菌条件下摘除眼球,生理盐水冲洗~ 次后,在超净工作台上沿角膜缘取下完整角膜不含角巩膜缘,放入?’ 溶液浸泡 。无菌条件下用眼科镊撕掉角膜上皮层,用号圆刀片刮除后弹 小块大小,均匀平 力层和内皮层,放无菌生理盐水中漂洗次。剪成约 ,待组织 铺于孔板中,将孔板倒置放入?,%培养箱中干燥 块稍干燥贴壁后,加入少量/培养液,使其刚好覆盖组织块又不使组织 ,继续置于?,%恒温培养箱培养。每天换一次液。 块漂浮 原代培养至成纤维细胞完全汇合后加入消化液.%胰蛋白酶一.% ,待大多数细胞皱缩变圆时,加入适量完全培养基终止消 溶液消化细胞约 化,离心、弃上清,用培养液将其制成细胞悬液,以血球计数板计数细胞,调整 细胞密度为.个?一,将 细胞悬液接种于培养瓶 中继续培养, 每日倒置显微镜下观察细胞的生长情况。每 更换一次培养液,待细胞大部分 长 满融合后,按上述方法再进行传代。 .兔角膜上皮细胞的原代及传代培养 将家兔以%戊巴比妥钠. 卜‘耳缘静脉注射麻醉。左氧氟沙星滴眼液 冲洗结膜囊,.%盐酸奥布卡因倍诺喜滴眼麻醉。手术显微镜下用板层刀剥 除上方浅层角膜缘组织约/周、 宽,生理盐水冲洗.遍后放入.’ 溶液浸泡 。剪成约 小块大小,均匀平铺于孔板中,将孔板倒置 放入,%培养箱中干燥 ,待组织块稍干燥贴壁后,加入少量 重庆医科大学硕士研究生学位论文 /培养液,使其刚好覆盖组织块又不使组织块漂浮,继续置于?, %恒温培养箱培养。每天换液一次。 原代培养至上皮细胞完全汇合后加入消化液.%胰蛋白酶..% 溶液消化细胞约 ,待大多数细胞皱缩变圆时,加入适量完全培养基终止消 化,离心、弃上清,用培养液将其制成细胞悬液,以血球计数板计数细胞,调整 中继续培养, 细胞密度为个/,将 细胞悬液接种于培养瓶 每日倒置显微镜下观察细胞的生长情况。每天更换一次培养液,待细胞大部 分 ,按上述方法再进行传代。 长满融合后 .兔角膜成纤维及上皮细胞的鉴定 用传.代的兔角膜成纤维及上皮细胞,作成细胞爬片,至?%汇合, . 取出。 ,.’冲洗 ..’冲洗次后,置于冷丙酮液中固定. 后空气自然干燥,置.?备用。 次。 .液漂洗 .×洗涤 ,再用洗 次。 ,以阻断内源 .加.%甲醇溶液于玻片上,置湿盒内室温处理 性过氧化物酶活性,洗 次。 .加正常血清于玻片上,置湿盒内室温处理 ,以封闭非特异结合位点, 甩去多余液体。 .加小鼠抗兔蛋白波形蛋白单克隆抗体工作液,置湿盒内室 温处理过夜,洗 次。 .加生化素羊抗鼠二抗于玻片上,置湿盒内室温处理。 ,液 漂洗 次。 , .加入辣根过氧化物酶标记的链霉素亲和工作液,?, 次。 液漂洗 .显色,流水充分漂洗。 .中性明胶封片,显微镜下观察。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 . .及对兔角膜成纤维及上皮细胞生 比色法检测 长情况影响 .接种细胞:取传代代对数生长期兔角膜成纤维及上皮细胞,消化液 .%胰蛋白酶一.%溶液消化,用完全培养液调整细胞密度为× 个/前期预实验表明该浓度生长曲线最佳,接种于孔培养板,每孔体积 。置?、%细胞培养恒温箱培养。.处理细胞:待细胞大部分贴壁后,弃掉培养 液,每孔加入 新鲜培养液,实验组加入 药物使其分别达到所要求的终浓度,正常对照组加 入,而试剂对照组与实验组比较除不加细胞外,其余均相同。每孔均作 个复孔。 .显色:分别培养 、 及 后,加入 溶液,孵育 后,吸尽上清液,加入 ,震荡 , 使结晶物充分溶解。 .比色:用微孔酶标仪在 处测定其吸光度值。角膜成纤维细胞 的生长抑制率.实验孔值/对照孔值%。 . 检测.对角膜成纤维细胞.、 表达的影响 ..引物设计与合成 根据中兔源的.、、基因序列检测结果和 引物设计原则,设计各自的扩增引物,并委托上海生物工程有限公司合成。 :: ’. .’ : 。一下 .’ :.’ 一。 : : 一’ 用提取经处理后的细胞总 .. .制备第代角膜成纤维细胞,细胞浓度为个?~,接种于孔板中, 重庆医科大学硕士研究生学位论文 后,弃去培养基,每孔加入不含血清的 置。,%恒温培养箱中培养 使细胞同步化。将细胞分为组:实验 /培养基. ,继续培养 组及正常对照组。实验组分别加入含终浓度为 ?~的等体积不含 血清的/培养基,培养后收集细胞;正常对照组中加入不含血清的 。 /培养基. 。 .用. 直接消化组细胞,移入离心管中,室温静置 。 .加入. 氯仿,振荡混匀后室温静置 ., ,吸取上层水液置另一离心管中。 离心 。 .加入 异丙醇并混匀,室温放置 ., 离心,弃上清,沉于管底。 %乙醇,温和振荡离心管,悬浮沉淀。 .加入 ?, ,尽量弃尽上清。 . ,一储存 室温晾干,加入适量的 溶解?促溶? . 备用。 ..一步法半定量 均以下列组成配制反应液。 ×上游 下游将反应体系振荡混匀,离心处理后。 ? 反应 ? 失活 篆重庆医科大学硕士研究生学位论文 实验结果 .兔角膜成纤维及上皮细胞免疫组织化学鉴定 体外培养的兔角膜成纤维细胞经法染色可见波形蛋白表达呈阳性,阳性 表达位于胞浆,呈现与成纤维细胞长轴方向一致的棕黄色束状或网状结构图 一。证实培养细胞为角膜成纤维细胞。体外培养的兔角膜上皮细胞经法染 色可见波形蛋白表达呈阴性图.,证实培养细胞为角膜上皮细胞。 .比色法检测各浓度.及对兔角膜成纤维及上皮 细胞生长情况影晌 .. 比色法检测各浓度.及对兔角膜成纤维细胞生长情况影 响 结果显示.对角膜成纤维细胞增殖有明显的抑制作用图.。 在各时间段,随着药物浓度的增加,抑制率呈现明显的上升趋势,但 ?。 至此后增加浓度对抑制作用增加影响较小,甚至略有下降。 处是一个转折点, 而对角膜成纤维细胞增殖有明显的促进效应图.,在各时间段,从 至 ?。段,随着药物浓度的增加,促进作用明显增加,但 ? ?。 处是转折点,至此后增加浓度对促生长率降低,提示此时由于浓度过高,影 响细胞活力。 ??一 . ??一 一 暑 ???一 一 墨 . ??卜 墨. 善? 一 ?一 薯. ??一 . ? . / 图不同时间段及作用于角膜成纤维细胞的剂量.效应曲线重庆医科大学硕士 研究生学位论文 .. 及对兔角膜上皮细胞生长情况影响 比色法检测各浓度. 订结果显示.和均对兔角膜上皮细胞增殖有明显的促进作用 图。在各时间段,随着药物浓度的增加,抑制率呈现明显的上升趋势,但 以 ?‘为转折点,以 ?.为转折点,至此后增加浓 度促生长率反而降低,与文献报道一致。提示此时由于?.、浓度过高, 影响细胞活力。 . ???一 ? ?.一一 ,,? ? 一 鼍暑 ?薹 ??卜 .???一 ,? 图.不同时间段作用于角膜上皮细胞的剂量.效应曲线. .琼脂糖凝胶电泳检测经.处理后的细胞总 用提取的总鹇进行%琼脂糖凝胶电泳,可见、、三 条清晰的条带,证实的完整性,见图.。重庆医科大学硕士研究生学位论文 图琼脂糖凝胶电泳检测经一处理后的细胞总 .:~.;: ;: . . 检测.对角膜成纤维细胞?、 表达的影响 的表达量 由图可见,经一处理后的细胞,一、 均下调,而作为内参的表达量相同,提示.可能是通过调节?、 的表达抑制成纤维细胞增殖。 的检测结果 图?、 ?、:? 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