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Apx_包涵体蛋白纯化和变性条件的研究.doc

Apx_包涵体蛋白纯化和变性条件的研究

yuan辉h
2017-10-14 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《Apx_包涵体蛋白纯化和变性条件的研究doc》,可适用于综合领域

Apx包涵体蛋白纯化和变性条件的研究()第卷总第期Vol,No自然科学版西北民族大学学报)年月JournalofNorthwestUniversityforNationalities(NaturalScienceSep,Apx包涵体蛋白纯化和变性条件的研究王冬梅,董开忠,蔡勇,刘翊中,杨具田()西北民族大学实验中心,甘肃兰州摘要为摸索重组ApxIII蛋白的纯化条件,采用IPTG诱导pETapxIIIAJM,表达产物以包涵体形式存在收集诱导后菌体,经冻融超声破菌得到粗包涵体,经mmolLTrisHCl、TritonX和molL尿素依次洗()涤包涵体沉淀分别用含有molL尿素和molL盐酸胍的溶液变性溶解聚丙酰胺凝胶电泳SDSPAGE分析结果表明:经洗涤包涵体纯度提高molL尿素和molL盐酸胍都不能使ApxIII包涵体完全溶解关键词ApxIII包涵体纯化变性(()文章编号中图分类号Q文献标识码A()胸膜肺炎放线杆菌Actinobacilluspleuropneumoniae,App是猪传染性胸膜肺炎的病原,该病给全球养猪业造成严重的经济损失App毒力因子复杂,Apx毒素被认为是其最主要的免疫原和保护性抗迄今App的个血清型可分泌四种Apx,常规的分离纯化技术很难从细菌的培养上清中得到数原量和含量相当的Apx,但可利用大肠杆菌表达系统来获得大肠杆菌表达系统具有经济、易操作、表达高效和稳定等优点,但表达的外源基因产物通常以无生物活性、不可溶的包涵体形式存在,需经洗涤纯化、溶解和复性,才能得到有天然构象和活性的蛋白质本文将阳性重组表达质粒pETapxA在大肠杆菌JM中进行表达,对重组Apx包涵体蛋白的纯化和溶解变性条件进行探索,以期找到有效的纯化方法材料与方法菌株和质粒()表达宿主菌EcoliJMDE和重组表达质粒pETapxA由西北民族大学实验中心微生物实验室保存主要试剂β()()异丙基硫代D半乳糖苷IPTG、溶菌酶、Tris、巯基苏糖醇DTT、尿素、EDTA等购自上海生工生物工程技术服务有限公司,其他常用试剂均为国产分析纯溶液()细菌裂解液:mmolLTrisHClpH、mmolLEDTA、mmolLNaCl、TritonX()vv()洗涤液:mmolLTrisHClpH,mmolLEDTA()()洗涤液:lmmolLTrisHClpH,mmolLEDTA,TritonXvv收稿日期()基金项目西北民族大学中青年科研基金XBMUBD()作者简介王冬梅,女,甘肃兰州人,副教授,硕士,主要从事微生学与免疫学方面的研究()洗涤液:mmolLTrisHClpH,mmolLEDTA,molL尿素()变性液:molL尿素,mmolLTrisHClpH,mmolLDTT()变性液:molL盐酸胍,mmolLTrisHClpH,mmolLDTT基因的表达()用阳性重组表达质粒pETapxA转化宿主菌EcoliJMDE感受态细胞挑取单个菌落接(μ)种至mLYT培养液含gmLKan中,振摇过夜取培养物uL转接于mLYT培养液中,OD达,时加入IPTG至终浓度mmolL,诱导表达,收集不同时间表达产物行SDSPAGE电泳分析菌体的破碎和粗包涵体的提取将h诱导的mL菌液rmim离心min,收集菌体沉淀并称重先用pH的PBS洗μ涤次,每克菌体中加入细菌裂解缓冲液mL、mgmL溶菌酶L,混匀,温育min反复()冻融min,min次,冰浴中W超声功率破菌min,间隔s,rmim离心min收获粗包涵体分别取破碎后总样、离心后上清及沉淀,进行SDSPAGE检测,观察目的蛋白的存在情况包涵体的洗涤按质量体积比的比例,向粗包涵体中先后加入三种洗涤液依次室温下洗涤,每次在搅拌下洗涤约h,离心取沉淀包涵体的变性溶解按质量体积比的比例,向所得包涵体沉淀中分别加入含molL尿素和molL盐酸胍的溶液,室温下变性溶解h,、rmim离心min,收集上清对离心的上清和残余沉淀分别取样,做SDSPAGE电泳分析,观察包涵体蛋白的溶解情况结果与分析apxA基因在大肠杆菌JM中的表达用SDSPAGE电泳检测表达产物,对pETapxAJM诱导前和诱导后进行比较,发现pETapxAJM诱导后在ku左右有一条明显的新生蛋白带,与预计的融合蛋白大小基本一致表明目的基因在大肠杆菌中获得了表达在IPTG浓度相同的情况下,诱导第h的表达效果最好,增加()诱导时间无助于增加目的基因的表达量见图粗包涵体的提取诱导后菌体经溶菌酶反复冻融超声破菌处理,可见表达产物主要以包涵体形式存在于沉淀中,()上清中目的蛋白很少见图离心破菌处理的菌体收获粗包涵体图pETapxA表达蛋白的SDSPAGEApx包涵体的纯化图M:蛋白分子质量标准,:诱导后,,,h的表达产物:诱导h后的表达产物,,,:细胞裂解:未诱导时的表达产物后的沉淀:细胞裂解后的上清包涵体的洗涤和溶解粗包涵体经含Triox的TE和molL尿素的TE依次洗涤后纯度有所提高分别经molL尿素和molL盐酸胍变性溶解,SDSPAGE结果显示:都仅约,的Apx包涵体被()溶解,在上清和残余沉淀中均有蛋白存在,说明包涵体溶解不完全见图()图Apx包涵体的纯化二M:蛋白分子质量标准,,:包涵体洗涤后的沉淀,:包涵体洗涤后的上清,:尿素溶解后的沉淀与上清,:盐酸胍溶解后的沉淀与上清讨论大肠杆菌表达系统表达的外源基因产物常以不可溶的包涵体形式存在包涵体中主要含有重组蛋白,也有一些细菌成分,如外膜蛋白、质粒DNA和其他杂质包涵体中重组蛋白的一级结构正确,但其立体结构是错误的,所以没有生物活性,需经洗涤、溶解和复性才能得到有天然构象和活性的蛋白质包涵体的洗涤是纯化中重要的一步因为大肠杆菌的有些外膜蛋白在,molL尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中会导致重组蛋白质的降解包涵体中存在的杂质影响包涵体蛋白的正常折叠纯化过程中必须先彻底破碎菌体,再用含去垢剂和低浓度变性剂的溶液来洗涤,本试验结合反复冻融溶酶体超声化学法裂解细菌等方法来破菌,使包涵体与可溶性包涵体蛋白分离,显著提高了包涵体的纯度和回收率实验选用含Triox和molL尿素的TE对包涵体依次进行洗涤,并加入EDTA来清除某些金属离子的影响经多次洗涤,包涵体相对纯度有所提高在包涵体蛋白复性前,必须先将包涵体溶解,将错误折叠的蛋白分子变性理论上盐酸胍的变性能力强于尿素,它们能打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键,消除疏水作用力,使多肽伸展而,溶解包涵体但本试验中molL盐酸胍和molL尿素都不能使包涵体完全溶解,二者溶解效果基本相当这可能与诸多因素有关首先,可能是对蛋白沉淀的原因考虑不全实验中只考虑了疏水,作用力,忽略了静电作用,今后可尝试极端pH和变温等方法,改变蛋白质表面上的电荷分布,以使蛋白质溶解另外,重组蛋白的性质、不同去污剂选用、错配二硫键的消除、变性剂浓度、作用时间、温度等对包涵体的溶解都有影响,需对其溶解条件进行进一步的摸索和优化,以期得到完全溶解的包涵体蛋白参考文献:SeahJN,JKwangLocalizationoflinearcytotoxinandproapoptoticepitopesinRTXtoxinApxIIIofActinobacilluspleuropneumoniaeJVaccine,,:萨姆布鲁克J,拉塞尔DW分子克隆实验指南M黄培堂,王嘉玺,朱厚础,等译第版北京:科学出版社,()吉清,何凤田包涵体复性的研究进展J国外医学临床生物化学与检验学分册,,:()()王艳艳,王革,乔刚等溶栓新药瑞替普酶包涵体纯化和变性条件的研究J山东大学学报理学版,,:()()陆长梅,李继影,陈阳Xyn包涵体的纯化与变复性研究J南京师大学报自然科学版,,:()陈义勇,施用晖,乐国伟重组阿片肽包涵体的溶解工艺J无锡轻工大学学报,,:StudiesonPurificationandDenaturationofApxIIIInclusionBodyWANGDongmei,DONGKiazhon,gCAIYongI,ULYizhon,gYANGJutian()NorthwestUniversityofNationalities,Lanzhou,ChinaAbstractRecombinantApxIIIwasexpressedinEcoliunderIPTGinductionItexistedasinclusionbodyCellswereharvested,freezethawed,sonicatedandcentrifugedafterexpression,andthepellet)(crudeApxIIIinclusionbodywaswashedbysuccessivestepsasfollows:mmolLTrisHCl,TritonXandmolLUreaTheprecipitatewasresolvedanddenaturedbymolLUreaandmolLGuanidineHydrochloriderespectivelyTheresultsofSASPAGEanalysisshowthatpurityofApxIIIinclusionbodyisimprovedbywashedTheApxIIIinclusionbodycouldnotbedissolvedcompletelyinmolLUreaandmolLGuanidineHydrochlorideKeywordsApxinclusionbodypurificationdenaturation()上接第页()Schirmer,A,Kotz,SA,Friederici,ADSexdifferentiatestheroleofemotionalprosodyduringwordprocessingJCognitiveBrainResearch,,()Grimshaw,GMIntegrationandinterferenceinthecerebralhemispheres:RelationswithhemisphericspecializationJBrainandCognition,,()李卫君,杨玉芳绝句韵律边界的认知加工及其脑电效应J心理学报,,()Dahan,D,Tanenhaus,MK,Chambers,CGAccentandreferenceresolutioninspokenlanguagecomprehensionJJournalofMemoryandLanguage,,()Salverda,PA,Dahan,D,McQueenMJTheroleofprosodicboundariesintheresolutionoflexicalembeddinginspeechcomprehensionJCognition,,()Salverda,PA,Dahan,D,Tanenhaus,KM,Crosswhite,K,Masharov,M,McDonough,JEffectsofprosodicallymodulatedsubphoneticvariationonlexicalcompetitionCognition,,()Snedeker,J,Trueswel,JUsingprosodytoavoidambiguity:EffectsofspeakerawarenessandreferentialcontextJournalofMemoryandLanguage,,()于泽,韩玉昌,李立洁句子语境中韵律作用的眼动特征J心理与行为研究,,

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