免疫捕获PCR快速检测阳性血培养瓶中的金黄色葡萄球菌-临床医学论文

免疫捕获PCR快速检测阳性血培养瓶中的金黄色葡萄球菌-临床医学论文 作者:周义正李向阳杨锦红 【关键词】阳性 金黄色葡萄球菌(S.aureus)是引发社区感染和院内感染的重要致病菌，其所致感染常以急性、化脓性为特征。以其引发菌血症而致的脓毒血症最为严重。作者采用免疫捕获PCR法(ImmunocapturedPCR，icPCR)检测S.aureus，即应用抗体包被微量PCR管免疫捕获阳性血培养瓶中的S.aureus，再用PCR法快速检测ssa基因和mecA基因，以期建立一种快速准确地检测阳性血培养瓶中S.aureus的方法。 1材料与方法 1.1材料本实验所用的标准菌株均购自卫生部临床检验中心，其它非标准菌株是本实验室保存的临床菌株，均分离自患者的血培养标本并得到Vitek-32全自动细菌鉴定仪的鉴定。引物:(1)ssa基因:ssa-F:5'-TCGGTACACGATATTCTTCAC-3'，ssa-R:5'-ACTCTCGTATGACCAGCTTC-3',,,。(2)mecA基因:mecA-F:5'-GCTAGAGTAGCACTCGAATTAGGC-3'mecA-R:5'-GATTGAAAGGATCTGTACTGGGT-3'。 1.2方法(1)抗体包被微量PCR管:人IgG以0.1mol/L的Na2CO3缓冲液(pH=9.6)稀释至20μg/ml，取500μl加至0.6ml的PCR管中37?孵育3h，再放置4?过夜，然后倒掉包被液，加入500μl10%小牛血清在37?孵育1h，最后以PBST洗3次，包被好的PCR管置4?冰箱备用,,,。(2)免疫捕获和 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 DNA制备:以无菌方式抽取 阳性血培养瓶中的带血球菌液置无菌试管以2，000r/5min离心，取500μl上层菌液加入包被有人IgG的PCR管中在37?孵育30min，然后倒掉菌液以PBST洗涤6次，每次2min，最后在吸水纸上扣干残液，以上完成免疫捕获，接着在捕获完后的PCR管中加入100μl双蒸水并在PCR仪上以99.9?裂解10min，然后参照《精编分子生物学实验指南》上的醋酸钠-异丙醇法,3,沉淀DNA并用70%乙醇洗涤，待自然干燥后加入10μl双蒸水即得到PCR反应所用的模板DNA。(3)PCR扩增反应体系和参数:反应体系包括10×Buffer5μl，2.5mmol/LdNTP4μl，Taq酶1U，20μmol/L正反向引物各1μl，25mmol/LMgCl23μl，模板DNA10μl，最后补ddH2O至50μl。ssa基因和mecA基因的PCR扩增参数如下:先94?预变性5min，再按94?，30s?53?，30s?72?，1min，共35个循环;最后72?，10min。目的基因片段大小分别为180bp和210bp。(4)最低检测限检测:先将在绵羊血琼脂平板上生长24h的S.aureus(菌株ATCC43300)纯菌落用无菌蒸馏水调置成1McFarland的菌液，然后以无菌操作方式将调好的1ml菌液加入血培养瓶中，再以无菌操作方式将5ml正常人无菌血加入同一血培养瓶中，最后将血培养瓶放入BacT/Alert全自动血培养仪直至阳性报警，接着以无菌操作方式从阳性血培养瓶中抽取5ml置无菌试管中2，000r/5min离心,再取上层菌液3ml作原始菌液并以新血培养瓶中的无菌培养液10倍系列稀释观察icPCR的最低检测限，每个稀释度做5管，重复试验3次，原始菌液和各稀释菌液均以琼脂倾注法作活菌记数。(5)特异性试验:按照与最低检测限检测中相同 的方法用 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1中1-20号菌株制作模拟标本，分别用icPCR法检测ssa基因和mecA基因以鉴定S.aureus和MRSA，重复试验3次。(6)临床标本检测:以本实验室2006年7至8月收到的血培养标本中的106例阳性报警瓶为检测对象，分别采用传统方法和icPCR法进行检测S.aureus和MRSA。 2结果 以菌株ATCC43300为试验菌株的最低检测限检测显示，icPCR法检测阳性血培养瓶中S.aureus的ssa基因和mecA基因的检测限均在4.3×104cfu/ml左右。icPCR法在10例由S.aureus模拟的阳性标本中检测到ssa基因，其中有6例还检测到mecA基因;其它10例非S.aureus模拟的阳性标本中均未检测到ssa基因和mecA基因。传统方法在106例阳性报警瓶中检测到9例S.aureus，其中3例S.aureus的苯唑西林MIC?4μg/ml;icPCR法检测到的S.aureus与传统方法的结果相同，但在1例苯唑西林MIC仅为2μg/ml的S.aureus中也检测到mecA基因。若以传统方法为金标准，icPCR法检测阳性血培养瓶中S.aureus的灵敏度和特异度均达100%。此外，用传统方法检测阳性报警瓶中S.aureus的时间约为48,72h，而免疫捕获PCR法的检测时间仅为5h左右。 3讨论 免疫捕获PCR法是一种快速检测病原菌的方法，其根据特异性 抗体与与病原菌菌体特异性结合的免疫学原理，将特异性抗体包被于磁珠或PCR管壁上，富集或捕获菌悬液和标本中的病原菌，再进行PCR反应检测目的病原菌。 icPCR的检测灵敏度取决于抗体的捕获效率和PCR扩增效率等因素。抗体的亲和力及纯化程度直接影响包被后的捕获效率，在本实验中由于采用IgG的Fab段能与S.aureus表面的SPA蛋白非特异结合的原理来捕获S.aureus，故其捕获效率不高，这直接导致本实验中icPCR的检测灵敏度仅为104cfu/ml，这远低于牛建军等,4,运用icPCR检测E.coliO157:H7的最低检测限10cfu/ml，但由于在阳性血培养瓶中的菌液浓度已达108cfu/ml，因此灵敏度并不影响icPCR在检测阳性血培养瓶中S.aureus的应用。在本实验中对icPCR检测S.aureus的特异度的保证依靠两个因素:一是IgG捕获S.aureus，二是采用ssa基因来鉴定S.aureus。ssa基因是Martineau等,1,采用大规模的基因比对在S.aureus中发现的一种特异基因，其较过去用来鉴定S.aureus的fem基因和nuc基因具有更高的种特异性和基因的保守性，因此更适合用来鉴定S.aureus。另外，在本实验中还采用检测mecA基因来判断MRSA，这是目前公认的检测MRSA的最可靠方法，它能避免传统表型法筛查MRSA因S.aureus的异质性表达而造成的漏检。但是，本组采用的icPCR也存在一些不足，首先是灵敏度还有待提高，其次是不能检测临床日益增多的凝固酶阴性葡萄球菌引起的菌血症，其实这两点都与包被用的抗体有关，在接下来的研究中作者 将致力于开发一种针对葡萄球菌属共有菌体抗原的单克隆抗体。 【参考文献】 1MartineauF，PicardFJ，RoyPH，etal.Species-specificandubiquitous-DNA-basedassaysforrapididentificatio nofStaphylococcusaureus.JClinMicrobiol，1998,36:618,623. 2黄留玉.PCR最新技术原理、方法及应用.北京:化学工业出版社，2005.181,187. 3AusubelFM，KingstonRE，SEidmanJG，etal.精编分子生物学实验指南.马学军，舒跃龙，颜子颖，等编译.北京:科学出版社，2005.46,47. 4牛建军，黄健炜，李莉，等.免疫捕获PCR法快速检测大肠埃希O157:H7的研究.中国人兽共患病杂志，2004，20(11):896,897. 5LuoW，WangS，PengX.Identificationofshigatoxin-producingbacteriabyanewimmuno-capt uretoxingenePCR.FEMSMicrobiolLett，2002，216:39,42.