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限制性内切酶.doc

限制性内切酶

四叶草小丸子
2018-01-18 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《限制性内切酶doc》,可适用于综合领域

限制性内切酶限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease):识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。Endodeoxyribonuclease限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。它能识别外源DNA并将其降解。在指明pH与在mL反应混合物中小时消化μg的λDNA的酶量为单位。制品不含非专一的核酸水解酶(由单位内切酶与μgλDNA保温小时所得的凝胶电泳图谱的稳定性表示)。限制性核酸内切酶的命名一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成第四个字母表示菌株(品系)。例如从BacillusamyloliquefaciensH中提取的限制性内切酶称为BamH在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶可以编成不同的号如HindII、HindIIIHpaI、HpaIIMboI、MboI等。在生物体内有一类酶它们能将外来的DNA切断即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力但对自己的DNA却无损害作用这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的故名限制性内切酶(简称限制酶)。限制酶是基因工程中所用的重要切割工具。科学家已从原核生物中分离出了许多种限制酶并且已经商品化在基因工程中广泛使用。根据限制酶切割的特点可将它们分为两大类:一类是切割部位无特异性的另一类是可特异性地识别核苷酸序列即只能在一定的DNA序列上进行切割。这种能被特异性识别的切割部位都具有回文序列也就是在切割部位一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。在基因工程中使用的多数是后一类酶。限制酶在特定切割部位进行切割时按照切割的方式又可以分为错位切和平切两种。错位切一般是在两条链的不同部位切割中间相隔几个核苷酸切下后的两端形成一种回文式的单链末端这个末端能与具有互补碱基的目的基因的DNA片段连结故称为黏性末端。这种酶在基因工程中应用最多。另一种是在两条链的特定序列的相同部位切割形成一个无黏性末端的平口。在基因操作过程中除了限制酶以外还要用一系列的酶类才能完成全过程。例如碱性磷酸酯酶、DNA多聚酶、末端转移酶、多核苷酸酶、逆转录酶等。这些酶都有各自特殊的催化功能现在都有商品出售可以根据不同的需要选用。简短定义:DNA限制性内切酶:生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它可以将外来的DNA切断的酶即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力但对自己的DNA却无损害作用这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的故名限制性内切酶(简称限制酶)。限制性内切酶综述(RestrictionEndonucleases:AnOverview)多年前当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制修饰现象进行研究时首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵而这种"限制"病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoRI和EcoRII以及来源于Haemophilusinfluenzae的HindII和HindIII。这些酶可在特定位点切开DNA产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代流传开来的时候以NEB为代表的许多公司开始寻找更多的限制性内切酶。除了某些病毒以外限制性内切酶只在原核生物中被发现。人们正在从数以千计的细菌及古细菌中寻找新的限制性内切酶。而对已测序的原核基因组数据分析表明限制性内切酶在原核生物中普遍存在所有自由生存的细菌和古细菌似乎都能编码限制性内切酶。限制性内切酶的形式多样从大小上来说它们可以小到如PvuII(个氨基酸)也可以比个氨基酸的CjeI更大。在已纯化分类的种限制性内切酶中已发现了超过种的特异识别序列。其中有是在NEB发现的。对具有未知特异识别序列的限制性内切酶的研究发现工作仍在继续。人们从分析细胞提取物的生化角度研究的同时也采用计算机分析已知的基因组数据以期有更多的发现。尽管很多新发现的酶的识别序列与已有的重复即同裂酶仍然有识别新位点的酶不断被发现。上世纪年代NEB开始克隆并表达限制性内切酶。克隆技术由于将限制性内切酶的表达与原有细胞环境分离开来避免了原细胞中其它内切酶的污染从而提高了酶的纯度。此外克隆技术提高了限制性内切酶的产量简化了纯化过程使得生产成本显著降低克隆的基因很容易进行测序分析表达出的蛋白也能进行X射线结晶分析这使得我们对于克隆产物更加确定。限制性内切酶一、限制与修饰(Restrictionandmodification)(限制与修饰现象早在年代初有许多学者发现了限制与修饰现象当时称作寄主控制的专一性(hostcontrolledspecificity)。l噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题(表)。l在感染某一宿主后再去感染其它宿主时会受到限制。Ecoli菌株λ噬菌体感染率lKlBlCEcoliKEcoliBEcoliC说明K和B菌株中存在一种限制系统可排除外来的DNA。的存活率是由宿主修饰系统作用的结果此时限制系统还未起作用。而在C菌株不能限制来自K和B菌株的DNA。限制作用实际就是限制酶降解外源DNA维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用可使腺嘌呤A成为N甲基腺膘呤胞嘧啶C成为#甲基胞嘧啶。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。(限制酶的发现在世纪年代人们就注意到DNA在感染宿主后会被降解的现象从而提出限制性切酶和限制酶的概念。年首次从EcoliK中分离到限制酶它有特定的识别位点但没有特定的切割位点其中切割位点离识别位点达bp以上。年美国约翰霍布金斯大学的HSmith于偶然中发现流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)能迅速降解外源的噬菌体DNA其细胞提取液可降解EcoliDNA但不能降解自身DNA从而找到Hind限制性内切酶。Hind限制性内切酶位点和切割位点如下:#…GTPyPuAC…##…CAPuPyTG…#从此以后发现的限制酶越来越多并且许多已经在实践中得到应用。EcoR是应用最广泛的限制性内切酶酶切位点和切割位点如下:#GAATTC##CTTAAG#限制性内切酶的命名遵循一定的原则主要依据来源来定涉及宿主的种名、菌株号或生物型。命名时依次取宿主属名第一字母种名头两个字母菌株号然后再加上序号(罗马字)。如Hind限制性内切酶Hin指来源于流感嗜血杆菌d表示来自菌株Rd表示序号。以前在限制性内切酶和修饰酶前加R或M且菌株号和序号小写。但现在限制性内切酶名称中的R省略不写。年下半年发现种限制酶和种甲基化酶年发现种细菌或古细菌中存在种酶且酶有多种特异性。到年月共发现种限制酶和甲基化酶其中限制酶有种包括型、型、型限制酶各有、、种甲基化指导的限制酶有种商业化的限制酶有种在型限制酶中共有种特异性。(限制与修饰系统的种类根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子限制与修饰系统至少可分为四类。表是各种限制与修饰系统的比较。型(type)限制与修饰系统所占的比例最大达。型酶相对来说最简单它们识别回文对称序列在回文序列内部或附近切割DNA产生带#羟基和#磷酸基团的DNA产物需Mg的存在才能发挥活性相应的修饰酶只需SAM。识别序列主要为bp或更长且呈二重对称的特殊序列但有少数酶识别更长的序列或简并序列切割位置因酶而异有些是隔开的。s型(types)限制与修饰系统占与型具有相似的辅因子要求但识别位点是非对称也是非间断的长度为bp切割位点可能在识别位点一侧的bp范围内。型限制酶一般是同源二聚体(homodimer)由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成每个亚单位作用在DNA链的两个互补位点上。修饰酶是单体修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成分别作用于其中一条链但甲基化的碱基在两条链上是不同的。在型限制酶中还有一类特殊的类型该酶只切割双链DNA中的一条链造成一个切口这类限制酶也称切口酶(nickingenzyme)如NBstNBI。型(type)限制与修饰系统的种类很少只占如EcoK和EcoB。其限制酶和甲基化酶(即R亚基和M亚基)各作为一个亚基存在于酶分子中另外还有负责识别DNA序列的S亚基分别由hsdR、hsdM和hsdS基因编码属于同一操纵子(转录单位)。EcoK编码基因的结构为RMS。EcoB编码基因的结构为RMS。EcoB酶的识别位点如下其中两条链中的A为甲基化位点N表示任意碱基。TGA*(N)TGCTEcoK酶的识别位点如下其中两条链中的A为可能的甲基化位点。AAC(N)GTGC但是EcoB酶和EcoK酶的切割位点在识别位点bp以外且无特异性。型(type)限制与修饰系统的种类更少所占比例不到如EcoP和EcoP。它们的识别位点分别是AGACC和CAGCAG切割位点则在下游bp处。在基因操作中一般所说的限制酶或修饰酶除非特指均指型系统中的种类。表:各种限制与修饰系统的比较酶分子内切酶与甲基化酶分子不在一起三亚基双功能酶二亚基双功能酶识别位点bp,大多数为回文对称结构二分非对称bp非对称切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性至少在识别位点外bp在识别位点下游bp限制反应与甲基化反应分开的反应互斥同时竞争限制作用是否需用ATPNoYesYes二、限制酶识别的序列(限制酶识别序列的长度限制酶识别序列的长度一般为个碱基最常见的为个碱基(表)。当识别序列为个和个碱基时它们可识别的序列在完全随机的情况下平均每个和个碱基中会出现一个识别位点(^=^=)。以下是几个有代表性的种类箭头指切割位置。个碱基识别位点:SauAGATC个碱基识别位点:EcoRCCWGGNciCCSGG个碱基识别位点:EcoRGAATTCHindAAGCTT个碱基识别位点:BbvCCCTCAGCPpuMRGGWCCY个碱基识别位点:NotGCGGCCGCSfiGGCCNNNNNGGCC以上序列中部分字母代表的碱基如下。R=A或GY=C或TM=A或CK=G或TS=C或GW=A或TH=A或C或TB=C或G或TV=A或C或GD=A或G或TN=A或C或G或T(限制酶识别序列的结构限制酶识别的序列大多数为回文对称结构切割位点在DNA两条链相对称的位置。EcoR和Hind的识别序列和切割位置如下。EcoRGAATTCHindAAGCTTCTTAAGTTCGAA有一些限制酶的识别序列不是对称的如AccBS和BssS。识别序列后面括号内的数字表示在两条链上的切割位置。AccBSCCGCTCBssSCTCGTGGGCGAGGAGCAC有一些限制酶可识别多种序列如Acc识别的序列是GTMKAC也就是说可识别种序列其中两种是对称的另两种是非对称的。Hind识别的序列是GTYRAC。有一些限制酶识别的序列呈间断对称对称序列之间含有若干个任意碱基。如AlwN和Dde它们的识别序列如下。AlwNCAGNNNCTGDdeCTNAGGTCNNNGACGANTC(限制酶切割的位置限制酶对DNA的切割位置大多数在内部但也有在外部的。在外部的又有两端、两侧和单侧之别。切点在两端的有SauA(GATC)、Nla(CATG)和EcoR(CCWGG)等在两侧的有Bcg和TspR(CASTGNN)Bcg酶的切割特性与其它酶不同它们在识别位点的两端各切开一个断点而不是只产生一个断点。切点在识别位点外侧的还有Bbv和BspM等。Bcg(N)CGA(N)TGC(N)TspRNNCAC(G)TGNN(N)CGA(N)ACG(N)NNGTG(C)ACNN三、限制酶产生的末端(限制酶产生匹配粘端(matchedends)识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后产生的末端为匹配粘端亦即粘性末端(cohesiveend)这样形成的两个末端是相同的也是互补的。若在对称轴#侧切割底物DNA双链交错断开产生#突出粘性末端如EcoR若在#侧切割则产生#突出粘性末端如Kpn。NNGAATTCNNEcoRNNGAATTCNNNNCTTAAGNNNNCTTAAGNN(限制酶产生平末端(Bluntend)在回文对称轴上同时切割DNA的两条链则产生平末端如Hae(GGCC)和EcoRV(GATATC)。产生平末端的DNA可任意连接但连接效率较粘性末端低。(限制酶产生非对称突出端许多限制酶切割DNA产生非对称突出端。当识别序列为非对称序列时切割的DNA产物的末端是不同的如BbvC它的识别切割位点如下。CCTCAGCGGAGTCG有些限制酶识别简并序列其识别的序列中有几种是非对称的。如Acc它的识别切割位点如下其中GTAGAC和GTCTAC为非对称。GTATCGACCATAGCTG有些限制酶识别间隔序列间隔区域的序列是任意的如Dra和Ear

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