荧光 显微镜 原理

荧光 显微镜 原理 2011-05-04 荧光显微镜原理荧光显微镜原理 荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等首要器件组成。是哄骗一定波长的光激发标本发射荧光,通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像 (一)光源 此刻多采用200W的超高压汞灯作光源,它是用石英玻璃制作,中间呈球形,内充一定数目的汞,事情时由两个电极间放电,引起金属汞蒸发,球内气压快速升高,当金属汞完全蒸发时,可达50~70个标准大气压力,这一过程一般约需5~15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使金属汞份子不断解离和还原过程当中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光,足以激发各类荧光物质,因此,为荧光显微镜普遍采用。 超高压汞灯也散发大量热能。因此,灯室必须有良好的散热条件,事情环境温度不宜太高。 新式超高压汞灯在使用初期不需高电压即可引燃,使用一些时间后,则需要高压启动(约为15000V),启动后,维持事情电压一般为50~60V,事情电流约4A左右。200W超高压汞灯的平均寿命,在每次使用2h的情况下约为200h,开动一次事情时间愈短,则寿命愈短,如开一次只事情20min,则寿命降低50%。因此,使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用过程当中,其光效是逐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。点燃灯泡后不可立即关闭,以免金属汞蒸发不完全而损坏电极,一般需要等15min。因为超高压汞灯压力很高,紫外线强烈,因此灯泡必须置灯室中方可点燃,以免伤害眼睛和发生爆炸时造成操作。 超高压汞灯(100W或200W)光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部门。在灯室上有调节灯泡发光中心的系统,灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反射镜,前面安装有集光透镜。 国产超高压汞灯GCQ-200型机能良好,可以代替HBO-200等型的进口灯泡,平均寿命在200h以上,价格也比较低。 我国研制的一种简易轻便型高色温溴钨荧光光源装置,体积小,重量轻,功率小,交、直流两用(自带直流电源),易于携带,使用方便,已推广应用。 (二)滤色系统 滤色系统是荧光显微镜的重要部位,由激发滤板和压抑滤板组成。滤板型号,各厂家名称常不统一。滤板一般都以基实质调命名,前面字母代表色调,后面字母代表玻璃,数字代表型号特点。如德国产品(Schott)BG12,就是种蓝色玻璃,B是蓝色的第1个字母,G是玻璃的第1个字母;我国产品的名称已统一用拼音字母表示,如相当于BG12的蓝色滤板名为QB24,Q是青色(蓝色)拼音的第1个字 如母,B是玻璃拼音的第1个字母。不外有的滤板也可以透光分界滤长命名,K530,就是表示压抑滤长530nm以下的光而透过530nm以上的光。还有的厂家的滤板完全以数字命名,如美国Corning厂的NO:5-58,即相当于BG12。 1.激发滤板根据光源和荧光色素的特点,可选用以下三类激发滤板,提供一定波长范围的激发光。 紫外光激发滤板:此滤板可使400nm以下的紫外光透过,阻挡400nm以上的可见光通过。常用型号为UG-1或UG-5,外加一块BG-38,以除去红色尾波。 紫外蓝光激发滤板:此滤板可使300~450nm范围内的光通过。常用型号为ZB-2或ZB-3,外加BG-38。 紫蓝光激发滤板:它可使350~490nm的光通过。常用型号为QB24(BG12)。 最大吸收峰在500nm以上者的荧光素(如罗达明色素)可用蓝绿滤板(如B-7)激发。 近年开始采用金属膜干涉滤板,因为针对性强,波长适当,因而激发效果比较玻璃滤更好。如西德Leitz厂的FITC专用KP490滤板和罗达明的S546绿色滤板,均远比玻璃滤板效果好。 激发滤板分薄厚两种,一般暗视野选用薄滤板,亮视野荧光显微镜可选用厚一些。基本要求是以获得最明亮的荧光和最好的背景为准。 2.压抑滤板压抑滤板的效用是完全阻挡激发光通过,提供相应滤长范围的荧光。与激发滤板相对于应,常用以下3种压抑滤板: 紫外光压抑滤板:可通过可见光、阻挡紫外光通过。能与UG-1或UG-5组合。常用GG-3K430或GG-6K460。 紫蓝光压抑滤板:能通过510nm以上滤长的荧光(绿到红),能与BG-12组合。通常用OG-4K510或OG-1K530。 紫外紫光压抑滤板:能通过460nm以上波长的荧光(蓝到红),可与BG-3组合,常用OG-11K470AK490,K510。 (三)反光镜 反光镜的反光层一般是镀铝的,因为铝对紫外光和可见光的蓝紫区吸收少,反射达90%以上,而银的反射只有70%;一般使用平面反光镜。 (四)聚光镜 专为荧光显微镜预设制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明视野聚光器的暗视野聚光器两种。还有相差荧光聚光器。 1.明视野聚光器在一般荧光显微镜上多用明视野聚光器,它具有聚光力强,使用方便,特别适于低、中倍放大的标本观察。 2.暗视野聚光器暗视野聚光器在荧光显微镜中的应用日益广泛。因为激发光不直接步入物镜,因而除散射光外,激发光也不步入目镜,可以使用薄的激发滤板,增强激发光的强度,压抑滤板也可以很薄,因紫外光激发时,可用无色滤板(不透过紫外)而仍然产生黑暗的背景。从而增强了荧光图像的亮度和反衬度,提高了图像的质量,观察恬静,可能发明亮视野难以分辨的细微荧光颗粒。 3.相差荧光聚光器相差聚光器与相差物镜配合使用,可同时进行相差和荧光联合观察,既能看到荧光图像,又能看到相差图像,有助于荧光的定位准确。一般荧光观察很少需要这种聚光器。 (五)物镜 各种物镜均可应用,但最好用消色差的物镜,因其自体荧光极微且透光机能(波长范围)适合于荧光。因为图像在显微镜视野中的荧光亮度与物镜镜口率的 而与其放大倍数成反比,所以为了提高荧光图像的亮度,应使用镜口平方成正比, 率大的物镜。尤其在高倍放大时其影响非常明显。因此对荧光不够强的标本,应使用镜口率大的物镜,配合以尽可能低的目镜(4×,5×,6.3×等)。 (六)目镜 在荧光显微镜中多用低倍目镜,如5×和6.3×。过去多用单筒目镜,因为其亮度比双筒目镜高一倍以上,但目前研究型荧光显微镜多用双筒目镜,观察很方便。 (七)落射光装置 新式的落射光装置是从光源来的光射到干涉分光滤镜后,波长短的部门(紫外和紫蓝)因为滤镜上镀膜的性质而反射,当滤镜对向光源呈45。倾斜时,则铅直射向物镜,经物镜射向标本,使标本受到激发,这时物镜直接起聚光器的效用。同时,滤长长的部门(绿、黄、红等),对滤镜是可透的,因此,不向物镜方向反射,滤镜起了激发滤板效用,因为标本的荧光处在可见光长波区,可透过淋镜而到达目镜观察,荧光图像的亮度跟着放大倍数增大而提高,在高放大时比透射光源强。它除具有透射式光源的功效外,更适用于不透明及半透明标本,如厚片、滤膜、菌落、组织造就标本等的直接观察。近年研制的新式荧光显微镜多采用落射光装置,称之为落射荧光显微镜。 二、荧光显微镜标本制作要求 (一)载玻片 载玻片厚度应在0.8~1.2mm之间,太厚的坡片,一方面光吸收多,另一方面不克不及使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁,厚度均匀,无明显自觉荧光。有时候需用石英玻璃载玻片。 (二)盖玻片 盖玻片厚度在0.17mm左右,光洁。为了加强激发光,也可用干涉盖玻片,这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉效用的物质(如氟化镁)的盖玻片,它可以使荧光顺利通过,而反射激发光,这种反射的激发光女可激发标本。 (三)标本 组织切片或其他标本不克不及太厚,如太厚激发光大部门耗损在标本下部,而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外,细胞重迭或杂质掩盖,影响判断。 (四)封裱剂 封裱剂常用甘油,必须无自觉荧光,无色透明,荧光的亮度在pH8.5~9.5时较亮,不易很快褪去。所以,常用甘油和0.5mol/lpH9.0~9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。 (五)镜油 一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时,必须使用镜油,最好使用特制的无荧光镜油,也可用上面所说的甘油代替,液体石蜡也可用,只是折光率较低,对图像质量略有影响。 三、使用荧光显微镜的注意事项 (1)严格按照荧光显微镜出厂仿单要求进行操作,不要随意改变程序。 (2)应在暗室中进行查抄。步入暗室后,接上电源,点燃超高压汞灯5~15min,待光源发出强光稳定后,眼睛完全适应暗室,再开始观察标本。 (3)防止紫外线对眼睛的损害,在调解光源时应戴上防护眼镜。 (4)查抄时间每次以1~2h为宜,超过90min,超高压汞灯发光强度逐渐降落,荧光减弱;标本受紫外线照射3~5min后,荧光也明显减弱;所以,最多不得超过2~3h。 (5)荧光显微镜光源寿命有限,标本应集中查抄,以节省时间,保护光源。天热时,应加风扇散热降温,新换灯泡应从开始就记载使用时间。灯熄灭后欲再用时,须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。 (6)标本染色后立即观察,因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙 ,可延缓荧光减弱时间,防止封裱剂蒸发。 烯塑料袋中4?保存 (7)荧光亮度的判断标准:一般分为四级,即"一"-无或可见微弱荧光。""-仅能见明确可见的荧光。""-可见有明亮的荧光。""-可见耀眼的荧光。 四、荧光图像的记载方法 荧光显微镜所看到的荧光图像,一是具有形态学特征,二是具有荧光的色彩和亮度,在判断结果时,必须将二者结合起来综合判断。结果记载根据主观指标,即凭事情者目力观察。作为一般定性观察,基本上可靠的。跟着技军事学科学的 在不同水平上采用客观指标记载判断结果,如用细胞分光光度计,图像分析成长, 仪等仪器。但这些仪器记载的结果,也必须结合主观的判断。 荧光显微镜摄影技术对于记载荧光图像十分必要,因为荧光很易褪色减弱,要即时摄影记载结果。方法与平凡显微摄影技术基本相同。只是需要采用高速感光软片如ASA200以上或24。以上。因紫外光对荧光猝灭效用大,如FITC的标记物,在紫外光下照射30s,荧光亮度降低50%。所以,曝光速度太慢,就不克不及将荧光图像拍摄下来。一般研究型荧光显微镜都有半AUTO或全AUTO显微摄影系统装置。 MSN空间完美搬家到新浪博客! 历史上的今天: 潍坊发酵工程师简历 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 2011-05-04职业卫生产品价格表2011-05-04[转] 金针菇液体菌种培养过程检测指标的研究2011-05-04原位杂交与荧光原位杂交 2011-05-04荧光显微镜原理2011-05-04