毕氏酵母氯化锂转化法毕氏酵母氯化锂转化法试剂1MLiCl<用去离子蒸馏水配制,0.22um滤膜过滤除菌;必要时用消毒去离子水稀释>50%PEG3350<SigmaP3640用去离子蒸馏水配制,0.45um滤膜过滤除菌,用较紧的盖子的瓶子分装>(氯化锂转化法只能PEG3350,不能用PEG8000,PEG3350在北京莱博生物有售,80元/100克)2mg/mlsalmonspermDNA/TE(10mMTris-Cl,pH8.0,1.0mMEDTA)-20℃保存注:醋酸锂对毕氏酵母无效,对酿酒酵母有效,仅氯化锂...
毕氏酵母氯化锂转化法试剂1MLiCl<用去离子蒸馏水配制,0.22um滤膜过滤除菌;必要时用消毒去离子水稀释>50%PEG3350<SigmaP3640用去离子蒸馏水配制,0.45um滤膜过滤除菌,用较紧的盖子的瓶子分装>(氯化锂转化法只能PEG3350,不能用PEG8000,PEG3350在北京莱博生物有售,80元/100克)2mg/mlsalmonspermDNA/TE(10mMTris-Cl,pH8.0,1.0mMEDTA)-20℃保存注:醋酸锂对毕氏酵母无效,对酿酒酵母有效,仅氯化锂有效;PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用。感受态毕氏酵母的制备1.接种Pachiapastoris到50mlYPD培养基中,30℃摇菌过夜(约24~28h)培养到OD值为0.8~1.0(约108Cells/ml);培养基里有流沙样的菌体在流动2.收获细胞,用25ml无菌水洗涤一次,室温下1500g离心10min;3.重悬细胞于1ml100mMLiCl溶液中,将悬液转入1.5ml离心管;4.离心机最大速度离心15秒沉淀菌体,重悬菌体于400ul100mMLiCl溶液中;5.按50ul/管分装,立即进行转化;注:不要将感受态酵母菌冰浴;毕氏酵母的转化1.煮沸1ml鲑鱼精DNA5min,迅速冰浴以制备单链担体DNA;鲑鱼精DNA主要是防止目的基因的降解,协助目的基因的转化2.将感受态酵母菌离心,以Tips去除残余的LiCl溶液;3.对于每一个转化,按以下顺序加入:50%PEG3350240ul1MLiCl36ul2mg/ml单链SalmonspermDNA25ul5~10ug/50ulH2O质粒DNA50ul4.剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀(约1min);5.30℃水浴孵育30min;6.42℃水浴热休克20~25min;7.6000~8000rpm离心收集酵母菌体;8.重悬酵母于1mlYPD培养基,30℃摇床孵育;9.1~4h后,取25~100ul菌液铺选择性培养基平板,于30℃培养2~3天鉴定;毕氏酵母PEG1000转化法试剂缓冲液A:1.0MSorbitol,10mMBicine,pH8.35(sigma),3%(v/v)ethyleneglycol缓冲液B:40%(w/v)PEG1000(sigma),0.2MBicine,pH8.35缓冲液C:0.15MNaCl,10mMBicine,pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO,-70℃保存注:1.缓冲液A、B、C均用滤膜过滤,-20℃保存;2.将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处(即使在冰上解冻的待转化细胞,其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降;如进行多样品的转化,建议按6样品/组进行);待转化毕氏酵母的制备1.接种环接种Pachiapastoris于YPD平板,30℃培养2d;2.挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中,30℃振荡培养过夜;3.取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养,待其OD值从0.1升到0.5~0.8;4.室温下3000g离心收集酵母菌体,50ml缓冲液A洗涤一次;5.重悬菌体于4ml缓冲液A中,按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中,每管加入11ulDMSO,混合后迅速于液氮中冷冻,6.-70℃保存毕氏酵母的转化1.将约50ug线性化质粒DNA溶于20ulTE或水中,直接加于冻结的酵母细胞中;加入担体DNA(40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA)以获得最大转化率;2.37℃水浴孵育5min,中间混合样品1~2次;3.取出离心管,加入1.5ml缓冲液B,彻底混匀;4.30℃水浴孵育1h;5.室温下2000g离心10min,去除上清液,菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中;6.离心样品,去除上清液,轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中;7.将所有转化液铺于选择性平板,于30℃孵育3~4天后,鉴定;毕赤酵母转化方法最常用的是电转化法和原生质体法,其中电转化法最为方便,转化效率最高,最容易产生多拷贝整合。由于原生质体法必须首先制备去除细胞壁的原生质体细胞以利于DNA进入,然后细胞再生细胞壁,产生转化体,而ZeocinR抑制细胞壁的形成,导致不能产生转化体。因此利用ZeocinR作为选择标记的载体如pPICZ系列,不能使用原生质体法进行转化。
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