对小鼠黑色素移植瘤血管生成拟态中作用的研究

对小鼠黑色素移植瘤血管生成拟态中作用的研究 作者:张凡 孙保存 常永霞 赵秀兰 【摘要】 目的:利用小鼠移植瘤模型动态观察CD31、MMP2、MMP9、CathepsinD在恶性黑色素移植瘤血管生成拟态形成中的作用。方法:采用B16黑色素瘤细胞株制作小鼠恶性黑色素移植瘤动物模型～成瘤后根据随机数字 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 每天随机抽取一只小鼠处死～共12d～获得肿瘤样本114例,HE染色、CD31、CathepsinD、MMP2、MMP9、HMB45免疫组织化学染色和PAS染色,分别计数血管生成拟态周围及远离血管生成拟态区域肿瘤细胞中阳性细胞百分率,内皮依赖性血管周围及远离内皮依赖性血管区域肿瘤细胞中阳性百分率,连续计数10个高倍视野并取其均值。结果:在恶性黑色素移植瘤形成的第1，8天～肿瘤组织内存在血管生成拟态,第9，12天移植瘤中的血管生成拟态被内皮依赖性血管替代,血管生成拟态周围肿瘤细胞中CD31、MMP2阳性细胞百分率高于远离血管生成拟态区域的阳性细胞百分率;内皮依赖性血管周围肿瘤细胞CD31阳性细胞百分率与远离内皮依赖性血管区域的阳性细胞百分率之间存在明显差别,血管生成拟态周围肿瘤细胞MMP9阳性细胞百分率高于内皮依赖性血管周围的阳性细胞百分率,血管生成拟态密度与血管生成拟态周围肿瘤细胞CD31、CathepsinD、MMP2阳性细胞百分率之间存在相关～与肿瘤细胞中MMP9阳性细胞百分率之间不存在相关,内皮依赖性血管密度只与内皮依赖性血管周围 肿瘤细胞中CD31阳性百分率之间存在相关～与CathepsinD、MMP9、 MMP2之间不存在相关。结论:恶性黑色素瘤移植瘤中血管生成拟态 与内皮依赖性血管共存～且与内皮依赖性血管之间存在一定的时空变 化规律。CD31、CathepsinD、MMP2、MMP9、HMB45等参与了黑色素瘤 血管生成拟态的形成～其中CD31、MMP2作用尤其重要。 【关键词】 血管生成拟态;肿瘤血管生成;细胞粘附分子;恶性黑色 素瘤;基质金属蛋白酶 【ABSTRACT】 Objective: To study the effectiveness of CD31、 MMP2、MMP9、CathepsinD on Vasculogenic mimicry in the melanoma transplant tumour.Methods: The mouse melanoma transplant tumor model of mouse was made with B16 melanoma cell suspending liquid. When tumor appears, we choose one mouse each day randomly according to random number chart and kill it.We get tumor specimens of 114 cases totally;which normally will have HE stain CD31、CathepsinD、MMP2、MMP9、HMB45 immunohistochemistry stain and PAS stain. Then respectively count the percentage of positive cells in tumor around the Vasculogenic mimicry and the percentage of positive cells in tumor which is far away from the Vascuolgenic mimicry;count the percentage of positive cells in tumor around the endothelialdepended vessel and that of positive cells in tumor which is far away from the endothelialdepended cell. Results: The Vasculogenic mimicry and endothelialdepended vessel coexist in the tumor tissue at the early phase of melanoma (d1d8);From day 9 to day 12,this structure is replaced by the endothelialdepended vessel. The number of CD31、MMP2 positive cell around vasculogenic mimicry is more than that of the tumor which is far away vasculogenic mimicry. The ratio of CD31 positive cell around endothelialdepended vessel has significant difference with that of tumor far away from it. The number of MMP9 positive cell around vasculogenic mimicry is more than that of tumor around endothelialdepended vessel.There are correlation between vasculogenic mimicry density and the number of CD31、MMP2 positive cells around vasculogenic mimicry,while the density of endothelial vessel has correlation with the number of CD31 positive cell around endothelialdepended vessel. But the density of endothelial depended vessel have no correlation with the number of MMP2、 MMP9、CathepsinD positive cell around endothelial vessel.Conclusion: The vasculogenic mimicry is one sort of special bloodproviding pattern. The CD31、Cathepsin D、MMP2、 MMP9 all take part in the development of vasculogenic mimicry and CD31、MMP2 play key role in this process. 【KEY WORDS】 Vasculogenic mimicry;Angiogenesis;Cell adhesion molecule;Malignant molenoma;Matrix metalloproteinase 血管生成拟态是1999年美国lowas大学的Maniotis和Folberg等根据他们对眼葡萄膜恶性黑色素瘤微循环的研究结果～发现的一种与传统的肿瘤血管生成途径完全不同的、不依赖内皮细胞的全新的肿瘤细胞的血液供应方式[1，6]。恶性黑色素瘤细胞通过自身变形和与细胞外基质相互作用～模拟血管壁结构形成可输送血液的管道～从而重塑肿瘤的微循环～并且与宿主血管相连通～使肿瘤获得血液供应～命名为血管生成拟态。这种特殊的肿瘤血供模式与内皮依赖性血管的生成在很多方面存在不同。研究证实具有血管生成拟态的肿瘤恶性度高～生长迅速～易发生血道转移。 本研究在以前实验的基础上首次提出了血管生成拟态的时空变化 概念:即血管生成拟态是肿瘤血液供应的一种暂时性替代模式～在肿瘤发生发展的一定时期内存在～在肿瘤的不同区域存在不同的变化趋势。本研究的前期实验通过小鼠的恶性黑色素移植瘤模型～初步验证了我们提出的假说。本实验利用免疫组织化学方法对血管生成拟态的形成机制以及与内皮依赖性血管之间的联系做进一步的探讨～深入揭 示两者之间的变化规律。 1 材料和方法 1.1 实验动物:C57小鼠购自北京军事医学科学院动物室～6，8周龄～共20只～雌雄各半～体重25，30g～编号后洁净实验室饲养～饮用水和饲料由天津医科大学实验动物中心提供。 1.2 实验方法:先将黑色素瘤细胞株B16复苏～1640细胞培养基上培养6d～使细胞排满瓶底～0.2%胰酶消化成单细胞悬液～调整细胞密度达到1×107/ml。75%酒精消毒小鼠鼠蹊部～每只小鼠鼠蹊部皮下注射0.2ml细胞悬液。10d后接种部位开始出现皮下肿块。根据随机数字表每天抽取一只小鼠处死～共持续12d。解剖并仔细检查动物全身～共获得肿瘤样本114例。全部标本均经10%福尔马林固定～然后常规石蜡包埋。 1.3 染色方法 1.3.1 试剂:一抗CD31、HMB45为鼠抗小鼠单克隆抗体～即用型～6ml包装～SNATA CRUZ生产～进口分装,CathepsinD、MMP2、MMP9兔抗多克隆抗体～浓缩型～0.1ml包装～购自武汉博士德试剂公司,二抗、三抗为SP复合物和山羊抗兔PV6001～购自北京中山试剂公司。 PAS液为天津肿瘤医院病理室自行配制。 1.3.2 主要免疫组化步骤:二甲苯脱蜡、梯度酒精至水～3%双氧水灭活内源性过氧化酶～PBS缓冲液振洗～抗原微波热修复～正常山羊血清封闭、一抗冰箱过夜～二抗、三抗各1hDAB显色10，15min～复染核脱水透明～中性树胶封片。 1.3.3 CD31、PAS双重染色:先挑选2例正常胃粘膜样本进行对照染色～分泌粘液处均染成樱桃红色～证实PAS试剂质量可靠。先按照SP法进行CD31免疫组织化学染色～DAB显色后显微镜下观察～待血管内皮细胞着棕黄色后水冲数分钟终止显色～然后用0.5%高碘酸溶液还原切片10min～时间切不可过长以避免出现假阳性结果。水流冲洗数分钟后置于schiff液中～避光10，15min～自来水冲洗～显微镜下观察出现樱桃红色～苏木素浅染细胞核～盐酸酒精分化～氨水返蓝后～梯度酒精脱水～二甲苯透明～中性树胶封片。 1.4 计算机图象处理 使用空军总医院医学工程研究所的BIN DAF IMG图象采集处理系统计算每张切片中坏死面积。 1.5 计数方法 1.5.1 区域划分:中央区与外周区的划分:避开肿瘤坏死,将每张切片中肿瘤组织镜下视野均匀分成三等份～即内1/3、中1/3、外1/3三个区域～内1/3区域即为中央区～外1/3即为外周区。血管生成拟态周围与远离血管生成拟态、内皮依赖性血管周围与远离内皮依赖性血管的划分:以血管生成拟态、内皮依赖性血管为中心的高倍视野定义为血管生成拟态、内皮依赖性血管周围,距离上述视野一个高倍视野的肿瘤细胞即为远离血管生成拟态和内皮依赖性血管。血管生成拟态判断标准:无内皮细胞衬复的PAS阳性管道、衬复PAS阳性物质的肿瘤细胞围成不规则管腔～且管腔内存在红细胞～周围没有出血坏死和炎症细胞浸润。 1.5.2 计数方法:低倍镜下找到血管生成拟态和内皮依赖性血管存在的典型区域～换成高倍镜,×400,～连续计数10个高倍视野内的血管生成拟态、内皮依赖性血管～取其均值即为血管生成拟态密度、内皮依赖性血管密度。同时计数血管生成拟态周围、内皮依赖性血管周围、远离血管生成拟态、远离内皮依赖性血管的肿瘤细胞中各种指标阳性细胞数,各项指标均连续计数10个高倍视野～每个视野内随机计数100个肿瘤细胞中的阳性细胞数～取其均值,。 1.6 统计学处理: 应用SPSS10.0统计软件包对该实验资料进行数据处理～所有数据均为非正态分布～故实验中所有数据均用中位数表示。两样本之间作MannWhitney非参数检验。血管生成拟态周围各指标的表达与血管生成拟态密度、内皮依赖性血管周围各指标的表达与内皮依赖性血管密度之间做相关分析～血管生成拟态密度、内皮依赖性血管密度与肿瘤坏死之间做相关分析。以P<0.05为具有统计学意义。 2 结果 2.1 常规形态学观察 肿瘤直径1.5mm，4mm～大体为黑色～表面可见丰富的血管～与周围宿主组织分界不清～呈浸润生长～切面呈黑红色,实性、质地柔软有光泽～部分区域散在出血坏死。可见肿瘤细胞围成的不规则的管腔～腔内可见红细胞～即血管生成拟态～而且与内皮依赖性血管共存现象～共26例。内皮依赖性血管多位于移植瘤外周区并与正常组织相交界。中央区血管生成拟态较多见～外周区血管生成拟态较少。早期肿瘤坏死较少～且多为点状坏死、局灶性坏死～后期肿瘤组织中央出现区域坏死～将肿瘤组织分割成多个孤立的细胞巢。 2.2 肿瘤组织内的血管生成拟态的形态学特点 通过CD31和PAS双重染色～在该移植瘤的第1，8天可见到典型的血管生成拟态样结构:外层为CD31染色阴性的肿瘤细胞～内衬樱桃红色的PAS阳性物质～管腔内有成堆的红细胞,这种结构在第9，12天被内皮依赖性血管所替代。我们的实验中还发现有的血管生成拟态中肿瘤细胞围成的不规则管腔内无PAS阳性物质衬复～同时管腔内存在红细胞。我们以前实验证实人恶性黑色素瘤细胞能表达内皮细胞抗原CD31和PAS阳性物质。本实验中也发现类似现象,镜下观察可发现CD31抗原位于肿瘤细胞胞浆内～呈均质或细颗粒状,且呈现高表达。PAS阳性物质则呈颗粒状或团块状散布在肿瘤细胞胞浆内～甚至有的单个肿瘤细胞外周有一层PAS阳性物质环绕～或几个肿瘤细胞外有一圈PAS阳性物质。 2.3 各种指标在肿瘤不同区域的表达变化规律 2.3.1 CD31在肿瘤不同区域的表达 显微镜下观察发现部分的肿瘤细胞表达CD31抗原～同时围成血管生成拟态的肿瘤细胞不表达或极少表达CD31抗原～血管生成拟态周围的肿瘤细胞高表达CD31抗原。统计学分析显示:血管生成拟态周围的肿瘤细胞CD31的表达高于远离血管生成拟态肿瘤细胞的表达～内皮依赖性血管周围肿瘤细胞的CD31表达高于远离内皮依赖性血管肿瘤细胞的表达～血管生成拟态周围肿瘤细胞CD31的表达与内皮依 赖性血管周围肿瘤细胞表达之间差别无统计学意义,见表1,。表1 CD31在肿瘤不同区域的表达,个/高倍视野, 区 域肿瘤数中位数ZAsymp sig?血管生成拟态周围区262.5??—6.1910.001?远离血管生成拟态区261.5??—5.4390.003?内皮依赖性血管周围区1143.0??—3.1500.250?远离内皮依赖性血管区1141.7 2.3.2 MMP2在肿瘤不同区域的阳性表达 血管生成拟态周围肿瘤细胞MMP2表达高于远离血管生成拟态的肿瘤细胞的表达,内皮依赖性血管周围与远离内皮依赖性血管的肿瘤细胞MMP2的阳性表达之间差别无统计学意义～血管生成拟态周围肿瘤细胞MMP2的表达与内皮依赖性血管周围肿瘤细胞表达之间差别无统计学意义,见表2,。 2.3.3 MMP9在肿瘤不同区域的表达 血管生成拟态周围肿瘤细胞与远离血管生成拟态肿瘤细胞MMP9的表达之间差别无统计学意义～内皮依赖性血管与远离内皮依赖性血管的肿瘤细胞的MMP9表达之间差别无统计学意义～血管生成拟态周围的肿瘤细胞MMP9的阳性表达高于内皮依赖性血管周围肿瘤细胞的 表达,见表3,。 2.3.4 CathepsinD在肿瘤不同区域的阳性表达 血管生成拟态周围肿瘤细胞与远离血管生成拟态的肿瘤细胞CathepsinD的表达差别无统计学意义～内皮依赖性血管周围与远离内皮依赖性血管的肿瘤细胞CathepsinD表达差别无统计学意义～血管生成拟态周围的肿瘤细胞CathepsinD的表达高于内皮依赖性血管周围的肿瘤细胞的表达,见表4,。表2 MMP2在肿瘤不同区域的阳性表达,个/高倍视野,表3 MMP9在肿瘤不同区域的阳性表达,个/高倍视野,表4 CathepsinD在肿瘤不同区域的阳性表达,个/高倍视野, 2.4 血管生成拟态密度与血管生成拟态周围肿瘤细胞各免疫组化指标之间的相关分析表5 血管生成拟态密度与周围肿瘤细胞阳性表达的相关分析从上表我们可以看出血管生成拟态密度与其周围肿瘤细胞CD31、MMP2的阳性表达之间存在密切相关～与其周围肿瘤细胞CathepsinD、MMP9的阳性表达之间不存在相关。 2.5 内皮依赖性血管密度与周围肿瘤细胞各免疫组化指标之间的相关分析 从下表可以看出～内皮依赖性血管密度与其周围肿瘤细胞CD31表 达之间存在相关～与其它指标之间不存在相关,见表6,。表6 内皮依赖性血管密度与周围肿瘤细胞阳性表达的相关分析 2.6 血管生成拟态密度、内皮依赖性血管密度和肿瘤坏死之间的关系 显微镜下观察我们可以看到～早期肿瘤组织内血管生成拟态密度较高～坏死较少见～多为小灶性坏死～后期肿瘤组织内血管生成拟态密度降低～坏死逐渐增多～且多为片状坏死～统计学分析显示～血管生成拟态密度与肿瘤组织的坏死之间存在相关～相关系数r=-0.978～内皮依赖性血管密度与肿瘤坏死之间亦存在相关～相关系数r=-0.230～证明在该肿瘤中血管生成拟态对维持肿瘤生长起到重要作用,见表7,。表7 血管生成拟态密度、内皮依赖性血管密度与坏死之间的相关 3 讨论 血管生成拟态是一种全新的、没有内皮细胞参与的肿瘤血液供应模式～已有的研究证实多种肿瘤,炎性乳癌、浸润性卵巢癌、前列腺癌,中存在血管生成拟态。同时研究发现由于这些肿瘤血液供应的特殊性～能够便利克服肿瘤快速生长过程中的缺血、缺氧状况～恶性程度高、生长迅速、极易发生血道转移～因此深入研究血管生成拟态的 分子机制对上述肿瘤的抗血管治疗具有重要意义。 我们的研究中发现血管生成拟态只是在恶性黑色素移植瘤的一段时期内与内皮依赖性血管共存～说明该结构是一种暂时性的血液供应模式～与内皮依赖性血管之间存在一定的演变规律～我们首次提出了血管生成拟态的时空变化概念～前期实验部分验证了我们的假说。 肿瘤血管形成是在多种促血管生成因子的刺激下～肿瘤血管生成开关机制失衡～内皮细胞由静止转化为活化状态～突破基底膜～降解细胞外基质～增生形成内皮细胞条索～然后通过基质重塑形成完整的血管网。血管生成拟态则是肿瘤细胞利用自身的变形～模拟内皮细胞相互连接粘附～并与细胞外基质相互作用～借助多种蛋白酶的作用使局部细胞外基质重塑～形成由肿瘤细胞彼此连接的不规则管腔～我们实验中的PAS染色有力的证明肿瘤细胞模拟内皮依赖性血管的结构。尽管两者形成的机制有所不同～但是两者的形成过程中都涉及到细胞表面的粘附分子和与肿瘤浸润转移存在密切关系的蛋白酶类。国外的文献报道证实:能形成血管生成拟态的恶性黑色素瘤细胞的细胞粘附分子,血管-内皮细胞钙粘附蛋白,、基质金属蛋白酶类,MMP2、MT1-MMP,表达水平在形成血管生成拟态的区域内升高。我们的实验就是通过免疫组化 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 血管生成拟态周围和内皮依赖性血管周围肿瘤细胞表面粘附分子,CD31,和蛋白酶类,MMP2、MMP9、组织蛋白酶D等,的表达～研究内皮依赖性血管和血管生成拟态在肿瘤发生发展 过程中的变化～同时进一步深入研究和完善血管生成拟态的分子机制。 CD31即血小板—内皮细胞粘附分子—1,plateletendothelial cell adhesion molecule～PECAM1,～是一种内皮细胞连接分子～在体内参与多种生理过程～并能介导多种配体相互作用。CD31抗原广泛分布在血管的各种细胞上～免疫组化检测可作为机体血管生成的标志[7]。我们的实验对黑色素瘤移植瘤细胞进行CD31免疫组化染色观察～发现移植瘤细胞同样表达CD31抗原～阳性率97%,111/114,～表达水平随血管生成拟态的消失而递减。同时血管生成拟态周围的肿瘤细胞较比远离血管生成拟态的肿瘤细胞高表达CD31～说明CD31抗原参与了肿瘤血管生成拟态,同时发现围成血管生成拟态的肿瘤细胞低表达CD31抗原～而血管生成拟态周围的肿瘤细胞高表达CD31～因此我们推测CD31抗原对维持已形成的血管生成拟态结构方面作用不明显～而对肿瘤细胞形成血管生成拟态起主要作用,血管生成拟态周围CD31抗原在肿瘤细胞血管生成拟态变化的各个阶段表达水平比较恒定,统计学分析显示CD31抗原在血管生成拟态周围的表达与血管生成拟态密度之间存在密切相关。我们实验中还发现高表达CD31的肿瘤细胞外形变成梭形～在间质中彼此粘附～具有连接形成管腔的趋势～同时一部分衬附在PAS阳性物质内壁的肿瘤细胞分泌CD31抗原～作为一个细胞间的连接分子～使肿瘤细胞在变形后能模仿内皮细胞更好地连接在一起～构成血液通道。SuyaYang等研究 认为CD31在培养的内皮细胞上有分布～主要集中于细胞连接处～他们利用CD31单克隆抗体可以阻断人脐静脉内皮细胞在体外培养基上形成管腔样结构～并且细胞伸长、迁移和在胶原基质中浸润形成网状结构的能力受到抑制,Alik等在研究该抗原时发现:人的脐静脉内皮细胞平铺到存在CD31抗体的培养基上～内皮细胞仍能正常地贴附到培养基上～但却不能形成细胞间的紧密连接和cobblestone外观[8～9],但是在已经形成紧密连接的内皮细胞培养基中加入该抗体则不能影响细胞间的连接～因此认为CD31参与体外培养基上内皮细胞的早期连接～但对已经形成的管腔的维持并不重要。Sunj等研究发现CD31与细胞基质中配体结合能介导细胞间信号传导～上调整合素的功能～促使内皮细胞迁移～同时CD31之间的结合可以使细胞间的连接更趋于稳定。TanakaY等研究认为内皮细胞表面CD31可上调β1和β2整合素的粘附作用～细胞表面整合素α?β3是CD31的一个重要配体～在血管生成中起着关键作用。用鼠单克隆抗体MabLM609直接作用于α?β3可阻止新生血管长入种植在鸡胚绒毛尿膜的人肿瘤组织～CD31与配体结合有利于整合素介导的内皮细胞的迁移[10，12]。同时有人发现高剂量CD31可抑制内皮细胞形成管腔样结构～中等剂量CD31可促进内皮细胞形成管腔样结构～因此可以肯定CD31对内皮依赖性血管形成发挥重要作用～形成血管生成拟态的肿瘤细胞表达CD31抗原就是模拟内皮细胞形成血管的过程～不仅作为细胞表面的粘附分子介导细胞之间的粘附～而且还作为信号传导分子～通过与细胞表面的整合素分子结合将细胞外基质中的信息传递到细胞内。 肿瘤细胞在形成血管生成拟态的过程中～肿瘤细胞与细胞外基质相互作用～获取细胞外微环境中信息～并使细胞外蛋白水解、重塑～排列形成可以运送血液的管道样结构～因此多种细胞外基质中与肿瘤浸润和转移有关的蛋白酶必然参与其中。MMPs是一族至少包括19类的锌依赖性内肽酶～它们的共同作用是可降解所有的细胞外基质成分。MMPs主要以酶原形式分泌到细胞外～一般情况下它们与组织金属蛋白酶抑制剂,TIMPs,以1?1比例结合形成复合物。体内的MMPs具有基因转录水平、翻译后水平调节。MMP2和MMP9分子量分别为72Kda和92KDa～是两种重要的蛋白酶～与肿瘤浸润和转移密切相关。因此我们对黑色素瘤细胞进行MMP2和MMP9免疫组化染色～MMP2阳性率为74/114,70%,～MMP9阳性率为67/114,58%,～与国外实验结果类似。同时我们的实验结果证实MMP2和MMP9在血管生成拟态生成的早期,第4、5天,出现高表达～国外学者的研究发现在黑色素瘤形成的初期MMP9的表达会发生变化～提示MMP9表达与早期黑色素瘤的浸润有关～也有报道称MMP9出现在进展期黑色素瘤中～而不是在早期。研究发现拟态周围肿瘤细胞MMP2的表达高于远离拟态肿瘤细胞的表达～内皮依赖血管周围的肿瘤细胞MMP2的表达与远离内皮依赖血管的表达之间无明显差别～血管生成拟态与内皮依赖血管周围肿瘤细胞MMP2的表达之间无明显差别,对血管生成拟态密度与MMP2的表达做相关分析～发现两者之间存在密切相关～由此我们认为MMP2对恶性黑色素瘤细胞形成血管生成拟态起着重要作用～尤其对早期血 管生成拟态的形成。统计学分析不支持MMP2与内皮依赖性血管之间存在相关～但文献报道MMP2是参与内皮依赖性血管形成的重要分子。Richard EB等研究现在体外培养的黑色素瘤细胞形成血管生成拟态区域MMP2、MT1—MMP、层粘连蛋白及其水解片段r2高表达～添加MMP的抑制剂可降低层粘连蛋白及其水解片段的水平～同时也有效阻断了黑色素瘤细胞形成血管生成拟态的这种能力[13，15]。最近的研究进一步证实层粘连蛋白及其水解片段可以与细胞表面的整合素受体结合～对细胞的增殖和迁移具有重要作用。这提示我们黑色素瘤的血管生成拟态的形成不仅需要蛋白酶降解细胞外基质～同时细胞外基质的降解产物在该过程中的作用同样不可缺少。当将人的脐静脉内皮细胞培养于基底膜样物质上时～内皮细胞很快排列成直线～围成管状～编织成血管网～用明胶酶谱分析显示培养液上清液中含有大量活化的MMP2和MMP9,人工添加两种酶的抗体可降低甚至完全阻遏基质中内皮细胞管状结构的形成,MMP2的活性显然是软骨肉瘤形成模型中向血管生成表型转化所必须的。 血管生成拟态周围肿瘤细胞MMP9表达较高～远离血管生成拟态的肿瘤细胞低表达～内皮依赖性血管周围肿瘤细胞高表达～远离内皮依赖性血管的肿瘤细胞MMP9的表达较低。统计学分析显示血管生成拟态周围的肿瘤细胞MMP9的表达高于内皮依赖性血管周围的肿瘤细胞的表达～血管生成拟态周围的肿瘤细胞的表达与远离血管生成拟态的肿瘤细胞的表达之间无差别～内皮依赖性血管周围的肿瘤细胞的表达 与远离内皮依赖性血管的肿瘤细胞表达之间无差别～说明血管生成拟态周围肿瘤细胞的MMP9的表达对血管生成拟态的形成有所贡献～统计学结果不支持我们的结论～目前尚无文献报道MMP9参与血管生成拟态的形成～因此需要今后进一步探讨两者的关系。我们的实验结果显示MMP9在内皮依赖性血管周围的表达在血管生成拟态形成的第5天出现高表达～说明MMP9在内皮依赖性血管的形成中发挥作用～统计学分析不支持MMP9的表达与内皮依赖性血管的相关～而现有的文献均支持MMP9对内皮依赖性血管的贡献。有人在研究鼻咽癌时发现癌细胞在分化过程中～它可诱导周围间质的成纤维细胞、浸润的单核细胞同时表达MMP9～特别是巨噬细胞产生大量的MMP9～在肿瘤微环境内可有效地影响肿瘤细胞的血管化、生长速度、基质的形成及基质的降解。Denoiser等在胰腺癌的转基因鼠模型中发现MMP9是血管形成开关机制的扳机点[16～17]。Nastoris等认为由于基质分子的降解～使得原来被隔离在细胞外基质内的生长因子,VEGF、BFGF、IGF—1,得以释放和激活肿瘤通过产生大量的MMP2、MMP9而加速新生血管生成[18、19]。内皮细胞在基础状态下表达一定水平的MMPs～在受到刺激或处于某种特定状态下其表达谱或表达量有所改变～体外培养的内皮细胞一旦形成卵石样单层～即表达合成MMP1、MMP2、MMP3、MMP9和MT—MMP～一般情况下有两种以上的MMPs共同表达～作用为相加或相互激活,不同组织的内皮细胞对各种刺激的反应不同～说明在体内MMPs的水平受到精确调节～以维持细胞和组织的完整性。以上的研究都支持MMP2和MMP9参与了内皮依赖性血管的形成～并在其 中发挥主要作用～而我们的实验未得出同样结论～可能与我们的样本量小～实验周期偏短有一定关系。 组织蛋白酶D,cathepsin D CD,是一种相对分子量为3.4×104的天门冬氨酸肽链内切酶～广泛存在于不同的组织细胞和肿瘤细胞中～在酸性环境下降解细胞外蛋白质～有利于肿瘤细胞的浸润和转移～与乳腺癌、膀胱癌等的浸润和转移密切相关～目前有关它在血管生成拟态中作用的研究未见报道。我们对恶性黑色素移植瘤进行CD免疫组化染色～阳性结果参照Dykins的标准～肿瘤细胞的胞浆和胞膜表达均为阳性～阳性表达率77/114,67%,～与国外文献报道基本一致,血管生成拟态周围的肿瘤细胞表达高于远离拟态的肿瘤细胞～内皮依赖性血管周围肿瘤细胞的表达与远离内皮依赖性血管的肿瘤细胞的表达之间无明显差别～血管生成拟态周围肿瘤细胞的表达与内皮依赖性血管周围肿瘤细胞表达之间无明显差别～统计分析结果显示血管生成拟态周围的肿瘤细胞的表达高于血管周围的肿瘤细胞的表达～血管生成拟态周围与远离血管生成拟态、内皮依赖性血管周围与远离内皮依赖性血管的该指标的表达无明显差别,相关分析显示CD在血管生成拟态周围肿瘤细胞中的表达与血管生成拟态密度之间不存在相关～该指标在内皮依赖性血管周围肿瘤细胞中的表达与内皮依赖性血管密度之间不存在相关～同时该指标在血管生成拟态周围肿瘤细胞中的表达在血管生成拟态形成的早期出现一个高峰～随后迅速下降～说明CD参与了肿瘤细胞形成血管生成拟态过程～尤其是血管生成拟态形 成的早期～统计学分析的结果不支持CD与血管生成拟态之间存在相关～可能与我们的样本量偏小有关。Cosigo G等研究发现垂体腺瘤在生长过程中一种重要的分子PRL能被组织蛋白酶D水解成16Kda的片段～具有抗内皮依赖性血管生成的潜在作用～在乏氧环境下培养的GH4c1垂体腺瘤细胞中检测发现VEGF升高～CD水平下降～PRLmRNA、细胞内PRL和PRL的分泌明显下降～且CD的下降与PRLmRNA的下降之间存在相关。另外DerchickGB等认为CD的纤溶酶原的水解片段有抑制血管生成作用～缺氧导致的环氧化酶—2的高表达对CD有明显的抑制作用～使后者的抗血管生成作用受抑制～血管密度增加[20～21]。Bidere N等研究发现CD参与了细胞凋亡过程～经CD抑制剂处理的人包皮成纤维细胞能够阻止细胞色素C的降解和caspase的激活～并延缓细胞的死亡[22～23]。以上研究表明CD对血管生成有抑制作用～并可通过阻断细胞内的凋亡途径来抑制细胞死亡～更有利于肿瘤细胞的生长。在血管生成拟态中的作用尚不肯定～需要进一步深入研究。 总之～我们通过实验得出的较为肯定的结论是CD31、MMP2与黑色素移植瘤中的血管生成拟态之间存在密切相关。MMP9、CathepsinD也参与了黑色素移植瘤中血管生成拟态的形成。这种新的肿瘤血液供应模式的分子机制的揭示尚需今后更加深入的研究～以便丰富和补充肿瘤血液供应理论～并将为临床抗肿瘤药物研制开发和临床抗血管治疗提供新的靶点。 图3 血管生成拟态周围肿瘤细胞表达MMP9 ×400图4 血管生成 拟态周围肿瘤细胞表达MMP2 ×400图5 血管生成拟态周围肿瘤细胞 表达CathepsinD ×400 【参考文献】 1 孙保存,张诗武, 赵秀兰, 等.恶性黑色素瘤血管生成拟态的研 究[J].中华病理学杂志,2003,32(6):539542 2 Cai X S, Jia YW, Mei J, et al. 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