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羟基自由基和超氧阴离子自由基测定的荧光分析法研究

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羟基自由基和超氧阴离子自由基测定的荧光分析法研究羟基自由基和超氧阴离子自由基测定的荧光分析法研究 山东农业大学 硕士学位论文羟基自由基和超氧阴离子自由基测定的荧光分析法研究 姓名:马淑慧 申请学位级别:硕士 专业:应用化学 指导教师:高吉刚周杰 20090613 山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 生命活动的代谢过程中不断产生各种活性氧自由基(,,,),羟基自由基(?,,),超氧自由基(,,,”)是其中具有代表性的两种自由基,它们与生物体的衰老及许多疾病的发生都有重要关系。 ?,,是一种氧化能力很强的自由基,能很容易地氧化各种有机物和无机物,氧化效率高,反应速...

羟基自由基和超氧阴离子自由基测定的荧光分析法研究
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荧光探针 ,, 山东农业大学硕士学位论文 ,, ,,,,,, ,,,,,,,, ,,,;,,,, ,,,,,, ,,,;,,,(,,,),,, ,,,,,,,,, ,, ,,, ;,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,(,,,,,,,, ,,,,;,,,(?,,),,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,;,,(,,。‘),,, ,,, ,,,,;,, ,,,,(,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,,( ?,, ,, , ,,,, ,,,,;,,,,,,;, ,,, ,,,曲,,,,,,,,,(,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,; ,,, ,,,,,,,,; ;,,,,,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,;,,,;, ,,,,,,, ,,,;,,,, ,,,,(,, ,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,;,,,,,,(,,?‘,,, ,,,,; ,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,, ,,,;,,,, ,,,,,, ,,,;,,, ,,, ,,,,,, ,, ,,,;,,,,,(,,,,, ,,,;,,,, ,,,,,, ,,,;,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,( ,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,, ,,,, ,,,,;,,, ,, ,,, ,,,, ,,, ,,,;,,,, ,,,,,,,,,;,,,;,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,;, ,, ,,, ,,, ,,, , ,,,;,,, ,,,,,,,;,,;, ,, ,,,,,,,,,(,,,,,,;,,, ,, ,,,;,,,, ,,,,,, ,,,;,,, ,,, ,,,, ,, ,,,,,,, ,,, ;,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,;,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,;, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,(,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,;,,;, ,,, ,,,,,,,,;,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,, ,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,, ;,,,;,,, ,,, ,,,,,,,;,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,;,, ,, ,,,,,,, ,,,,,, ,,,,;,,,( ,,;,,,, ,,, ,, ,;,,,,,,,,,;, ,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,;,,,(,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,;, ,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,;,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,;,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,,,,(,,,,, ,,,,,, , ;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,;,,;, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,; 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,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,, ,,, ,,(,,,, ,,,,,, ,,,,,, ,,,,;,,,, ,,,,,, ,, ,,, ,, ,,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,;, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,;,,,,,,(,,,,,,,,:,,,;,,,,,,,,,,,,,,; ,,,,,,;,,,,,,,, ,,,,;,,;,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,;,,;,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,;,,,,,,,;,,, ,,,,, ,,?,,, ,,,,,,,,, ,,,;,,,,,,,,,,, 毛细管电泳(电化学 ,,,,;,,,;,,,,;,, ,,,,;,,,, 检测法,,,(,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,;,,,,,,,,,,, 毛细管区带电泳一安 ,,,,,,,,,,,,; ,,,,;,,,, 培检测法,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,, 二甲亚砜,,, ,,,;,,,, ,,,, ,,,,,,;, 电子白旋共振法,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, 谷胱甘肽过氧化物酶,,,, ,,,, ,,,,,,,,,;, ,,?,,, 高效液相色谱法 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,;, ,,,, ,,?,,, 高效液相色谱(电化 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,;,,,,;,, 学检测法 ,,,,;,,,,,,, ,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,, 氯化硝基四唑氮蓝,,, ,,,,,,,, ,,,,;,,, 羟基自由基,,?‘ ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,;,,, 超氧阴离子自由基,,, ,??,,,,?,,,,,,?,,,,,,,,,,,,,,,, ,,叔丁基苯硝酮,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, 超氧化物歧化酶,,, ,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,),,,,,, ,,(,’一噻吩基)苯并 噻唑啉 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文,是在导师指导下,独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体,均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定,同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版,允 许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文,同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》,并向社会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名:曼鲢、 导师签名:盔互刽 日 期:趔,:,乃 山东农业大学硕士学位论文,引言 生物体内的活性氧自由基是活性态氧代谢的产物,主要包括超氧阴离子自由基(,,?。),羟基自由基(?,,)、单线态氧(,,,)、过氧化氢(,,,,)等。它们在生命活动的代谢过程中不断产生,与生物体的衰老及许多疾病的发生都有重要关系(,,,,,,,,, , ,, ,,(,,,,,;,,,,,, , , , ,, ,,(,,,,,;,,,, ,, ,,(,,,,,;,;,,,, , , ,, ,,(,,,,,)。,,,,年,;,,,,(,;,,,, , , ,, ,,(,,,,,)发现了清除超氧化物自由基的超氧化物歧化酶(,,,)并研究其生物学作用,提出了氧毒性的超氧化物自由基学说,人们开始逐步认识到自由基在生物体内存在的危害。 ?,,是一种氧化能力很强的自由基,能很容易地氧化各种有机物和无机物,氧化效率高,反应速率快,是造成组织脂质过氧化、核酸断裂、蛋白质和多糖分解的活性氧(徐向荣等,,,,,),与机体的衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬有关。 ,,?’不仅自身具有毒性,而且可以经过一系列反应生成其它活性氧自由基,进一步对生物体产生损伤作用,且停留时间较长。超氧自由基是生物活性最高的氧中心自由基之一,它在生命过程和化学反应中作为电子受体,形成不同的活性氧自由基链中的第一个自由基,经过一系列反应生成其它的氧自由基。和其它的活性氧相比,超氧自由基不是很活泼,但其寿命很长,因此,超氧自由基危害较大,捕获超氧自由基进行研究具有重要的意义。 人体内总自由基中约,,,以上属于活性氧自由基,因此活性氧自由基对人体有着特殊的意义。自,,,,年,,,,,,,提出有机自由基以来,有关自由基在生命体系中生物学作用的研究相继开展了很多。,,,,年,,,,,,,等发现放射线诱导突变和诱发肿瘤的发病机理与自由基有关,该研究是自由基医学史上的里程碑。,,,,年,,;,,,,和,,,,,,,;,报道了超氧化物歧化酶抗氧化的生物学作用,开创了自由基生物学的新篇章。近年来,在基础医学、临床医学、预防医学、药学等领域,对活性氧自由基进行了广泛的研究工作。 羟基自由基和超氧阴离子自由基测定的荧光分析法研究,(,活性氧自由基的性质,(,(,羟基自由基的性质 ?,,具有高度活性,主要通过电子转移、亲电加成、脱氢反应等途径无选择地直接与各种有机化合物作用而将其降解为,,,,,,,和其他无害物质。它具有以下特点: (,)氧化能力强,其 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 电极电势达,,(,, ,(如表,(,),仅次于氟,是一种氧化能力极强的氧化剂; (,)反应速率常数大,?,,非常活泼,与大多数有机物反应的速率常数达到,,,(,,,, , ,,,‘, ,,(,,,,,,,, , ,, ,,(,,,,,); 表,(, 羟基反应的二级速率常数(邓淑芳等,,,,,) ~垒~:~:~~垒皇兰曼~,旦垒~~型~塾呈呈旦望~垒坚生旦~垒,堂竺苎,~~垒垒,曼垒~望~竺~,旦璺 反应速率常数 反应速率常数 化合物 ,, ‘ ,( 化合物 ,, ‘ ,, (,,,,以,‘,) (,,,,? ,?) ,,,, ,(, ,(,×,,, 鸟嘌呤 一 ,(,×,,,, , ,,,, ,(, ,(,×,, 血红蛋白 一 ,(,×,,,, 腺嘌呤 ,(, ,(, ×,,, 组氨酸 ,(,(,(, ,(,,,,, 苯 ,(, ,(,×,,, 卵磷脂 一 ,(,,,,, 苯甲酸 ,(, ,(,×,,, 甲醇 ,(, ,(,,,,, 过氧化氢酶 ,(,×,,,, 酚 ,(, ,(,×,,, 胞嘧啶核苷 ,(, ,(,×,,, 正丙醇 ,(, ,(,,,,, 胞嘧啶 ,(, ,(,×,,, 核糖核酸酶 一 ,(,×,,,, 脱氧鸟苷酸 ,(, ,(,×,,, 核糖 ,(, ,(,,,,, 脱氧核糖 ,(,,,,, 血清白蛋白 一 ,(,×,,,, 乙酸 ,(, ,(,×,,, 胸腺嘧啶 ,(, ,(,,,,, 葡萄糖 ,(, ,(,,,,, 尿嘧啶 ,(, ,(,,,,,甘氨酰甘氨酸 ,(, ,(,,,,, (,)寿命短,在不同的环境介质中,其存在时间有一定的差别,一般小于,,,,,液相中仅,,一,; , 山东农业大学硕士学位论文 (,)选择性低,且与反应物浓度无关。?,,一旦形成,会诱发一系列的自由基链反应,氧化分解所有的有机物质、生物体,最终降解为,,,、,,,和微量无机盐,不存在有害有毒的残留物。实现零污染物、零废物排放; (,)剩余的羟基最终生成物是无毒害的,,,、,,。,(,(,超氧阴离子自由基的性质 超氧自由基在水中可认为是一种碱,它可以接受一个,,形成质子化的超氧自由基,,,?。超氧自由基在水溶液中的存活时间约为,,,在脂溶性介质中的存活时间约为,,。和其它的活性氧相比,超氧自由基不是很活泼,但由于其寿命很长,能扩散到很远的距离,达到靶位置。它可以发生歧化反应、单电子还原反应、单电子氧化反应等。,(,活性氧自由基的产生,(,(,羟基自由基的产生 (,)脉冲辐射分解法 在,,,的存在下产生?,,,采用这种方法产生的?,,可达到,,,,这种方法也可产生较高浓度的,,?‘。 (,)臭氧法 臭氧氧化能力很强,在碱性条件下,可以发生分解,产生羟基自由基 (,,,,,,, , , ,, ,,(,,,,,),其反应式如下: ,,,,,。,,,,’,,,”, ,,,,,:——??,,(,,, ,,,,,,。———?,,’ ,,,, ,,在,,作用下可提高羟基自由基的产率,对此机理的解释有两种,即: 羟基自由基和超氧阴离子自由基测定的荧光分析法研究 ,,——?,’,,, ,‘,,,,——。,’,, ,, ,,,,,,—一,’,,,,, ,,,,—,,‘,, ,, (,),,,,,,型,,,,,(,,,,,反应 过去曾认为通过,,,,,(,,,,,反应可产生羟自由基(方允中等,,,,,) ,,二,,,,,,‘,,,,,。,,, 但是上述反应的速度很慢,其反应速率常数(尼)仅仅为,(,, , ,,,。,‘, 但在,,,,的螫合物如(,,(,,,,,,(,,,,)存在下的,,,,,,型,,,,,(,,,,,反应可以产生?,,,其反应如下: ,,),, ,,二———??(, ,,,,, ,, ,,,,,,,,,———,,卜,,,,,。,,十,,” ,,”,,,,,————卜‘,,,,,”,,, 在,,,,,,型,,,,,(,,,,,反应,,,,,或,,,,起催化剂作用。此反应也可简称为,,,,,,反应。,,,,,,反应是生物体内存在的体外模拟反应,对研究羟自由基具有重要作用。 大量的实验证据指出,生物体内的产生也可以通过类似,,,,,,型,,,,,(,,,,,反应进行(韩鹤友等,,,, ,)。,(,(,超氧化物自由基的产生 (,)自氧化法 包括一些蛋白质、低分子化合物在内的物质在一定条件下自动氧化,可以产生,,?‘。自氧化能产生,,(,的蛋白质有:血红蛋白、肌红蛋白等。自氧化可产生,,?’的低分子化合物包括:黄素单核苷酸(,,,)、辅酶, (,,,)、,(羟基多巴 胺、焦性没食子酸等。 (,)电化学反应 用滴汞作为阴极,在一定实验条件下,通电后可使水溶液产生以下反应: , 山东农业大学硕士学位论文 滴汞(,),,,』坚滴汞,,,二 (,) 滴汞(,),,,,,,,二——?滴汞,,,,。,,,” (,) 但在表面剂喹啉或氧化三苯膦的存在下,滴汞电极表面有一层表面剂分子的疏水膜。由于不会发生反应(,),,,?,遂可穿过疏水膜进入水溶液中。 (,)光化学法 有些光敏燃料,如甲基蓝、黄素、邻联茴香胺等,遇光照射可以被还原,但在暗处又可再氧化,这一氧化还原过程可伴有,,?。的生成。除此以外,能产生,,?‘的方法还有物理法、电化学法等,用,,,。或;,,氧化,,,,也可产生,,?。。后者也可从对苯二酚衍生物与,,的反应中产生。,,,,,等(,,,,,, , ,, ,,(,,,,,)报道,采用快速冰冻猝灭、电子顺磁共振以及光学等技术,可观察到黄素自氧化与,,?’的产生有关。在实验室中除用自氧化法产生,,?‘外,尚有酶促反应法。 (,)酶促反应法 许多氧化酶均可促使,,发生单电子还原,形成,,?。。这类氧化酶包括黄嘌呤氧化酶、醛氧化酶、,,,,,氧化酶等。由黄嘌呤氧化酶催化生成,,?‘的反应如下: 黄嘌呤,,,,,,,,——?尿酸,,,,,,,,,二,,,活性氧自由基的检测方法,(,(,羟基自由基的检测方法 羟自由基能与许多有机化合物,尤其芳香族化合物发生羟化反应,通过测定反应体系的羟化产物生成量,间接检测?,,含量(姚波等,,,,,)。 (,)电子自旋共振法 电子自旋共振法(,,,;,,,, ,,,, ,,,,,,;,,简称为,,,)是,,,,年发展起来的,主要的研究对象为具有未成对电子的自由基和过渡金属离子及其化合物。自旋捕集技术的建立,为化学反应中的自由基中间体和生命过程中的短寿命自由基的,,,检测开辟了新的途径(张健中等,,,,,)。此方法是利用捕集剂与短寿命自由基结合生成相对稳定的自由基。由于自旋加合物的寿命很短,因此必须在捕集之后立即进行,,,钡,,,定,从而限制了 羟基自由基和超氧阴离子自由基测定的荧光分析法研究许多实验研究。丛建波等(丛建波等,,,,,)采用液氮(,, ,)保存自旋加合物的方法,延长了自旋加合物的寿命,结果表明,低温贮存,,,,。,,加合物可保持几天后浓度基本不变。刘乃丰等(刘乃丰等,,,,,)用水溶性自旋捕集剂,,,,捕获由体外组离子催化的低密度肢蛋白(,,,)产生的羟自由基,实验认为此方法可用作研究,,,在动脉粥样硬化中的自由基作用。,,,,,,等(,,,,,, , , ,, ,,(,,,,,)用浸渍有捕获剂的滤纸捕集空气中的?,,,用甲苯萃取后进行,,,、狈,,定。,,,等(,,, , ,, ,,(,,,,,)用紫外线照射,,,,产生?,,,?,,与,,,,,,,,反应,产生,,,,,,,,再用,( (,(毗啶基(,(氧化物)(,(叔丁基硝酸灵捕获,,,,,,,,,,,淤〕定自旋加合物。该方法可用于生物体内?,,的检测。,,,,,,,,,等(,,,,,,,,, , , ,, ,,。,,,,,)用,(苯基,,(叔丁基氮氧化物(,,,)捕集橄榄油中的?,,,,,,测定,?,,最大浓度为,,(, ,,,,,, ,,。 (,)高效液相色谱法 , 高效液相色谱法(,,,, ,,,,,,,,,;, ,,?,,, ,,,,,,,,,,,,,,,简称为,,,,)可用于间接测定自由基。测定过程中必须选择合适的化合物捕集被测体系中的自由基,使之生成具有一定稳定性,且能被液相色谱分离与检测的产物,然后用,,,,进行测定。多种物质均可作为羟基自由基的捕获剂, 如水杨酸、二甲亚砜、苯丙氨酸等。?采用水杨酸捕集羟基自由基的,,,,测定方法 用水杨酸(邻羟基苯甲酸)捕捉?,,的原理如下: ,奇,,,,嘣,手 产物中的,,,(二羟基苯甲酸和,,,(二羟基苯甲酸可用,,,,进行分离与测定。吴建林等(吴建林等,,,,,)在体系,,为,(,,的条件下,以水杨酸为?,,捕获剂,用高效液相色谱法检测水杨酸与?,,反应的生成物,,,一二羟基苯甲酸(,,,,,,,,)和,,,一二羟基苯甲酸(,,,,,,,,),间接验证了辉光放电等离子体中羟基自由基的存在,半定量地计算了辉光放电电解过程中?,,的产量与实验条件之间的关系。?采用二甲亚砜(,,,,)捕集羟基自由基的,,,,测定方法 , 山东农业大学硕士学位论文 二甲基亚砜(,,,,)是一种常见的溶剂,近年来国内外均有报道利用,,,,捕集羟基自由基,定量测定?,,的产率。其测定原理是通过,,,,与?,,反应.
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上传时间:2017-09-26
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