基于28S rDNA序列的鞘藻目系统发育研究

基于28S rDNA序列的鞘藻目系统发育研究 基于28S rDNA序列的鞘藻目系统发育研究 第3l卷第4期 2007年7月 水生生物 ACTAHYDROBIOLOGICASINICA Vo1.31,No.4 July,2007 基于28SrDNA序列的鞘藻目系统发育研究 梅洪,2刘国祥胡征宇 (1.中国科学院水生生物研究所,武汉430072;2.中国科学院研究生院,北京100039) 摘要:作者进行了较广泛的样品采集,通过实验分离纯化培养得到多个鞘藻目种类的株系,并采用PCR技术新获得 鞘藻目2属8个种类的部分28SrDNA序列,连同GenBank中的另两条序列, 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 的物种涵盖了鞘藻目中的每个属. 通过比较分析绿藻纲中包括此1O条序列的共36个种类的同一基因序列,并选取Trebouxiophyeeae中的椭圆小球藻 (Chlorellaellipsoiden)和0cperforata作外类群,运用多种 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 构建分子系统树,包括邻接法(Neighbor-Joining), 最大简约法(MaximuInParsimonv)和Bayesian方法.3种方法所得的结果非常相似,在形态上就在整个绿藻中界限分 明的鞘藻目从分子水平上再次 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 为单系起源的类群;构建的系统发育树还在一定程度上表明毛鞘藻属处于鞘藻 目内三个属中较分离的位置,而枝鞘藻属与鞘藻属植物并无明显界限. 关键词:鞘藻目;细胞核编码的核糖体大亚基;系统发育;Bayesian方法 中图分类号:Q943文献标识码:A文章编号:1000.3207(2007)04-0492-07 鞘藻目(Oedogoniales)是一个十分独特的类群, 仅有鞘藻科(Oedogoniaceae)一科,包括三个属——鞘 藻属(Oedogonium),毛鞘藻属(Bulbochaete)和枝鞘藻 属(Oedocladium).鞘藻科种类繁多,分布很广,在温 暖地区的各种浅水水体中都较为常见?J.在绿藻门 中,鞘藻目的种类以其特殊的细胞分裂方式,独具环 状排列鞭毛的大型动孢子,复杂多样化的有性生殖 特征,使其在整个绿藻中自成一个界限分明,而又相 当独特的类群,从形态学上很难确定它与其他绿藻 的亲缘关系.针对鞘藻目的种类分类,不同藻类学 工作者采用的分类 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 不尽相同,对该目中三个属 的排列次序也各有不同J.因此对鞘藻目的系统发 育进行研究具有一定实际意义. 饶钦止先生J提出以性分化方式作为鞘藻科各 属的分类基础,并得到很多藻类学家的支持,但对不 同性分化方式种类间的亲缘关系却无法确定.着名 的波兰藻类学家Mrozifiska则在1991年和1993年分 别提出在鞘藻属和毛鞘藻属中以单个精子囊内精子 的数量作为分类基础[..4].在鞘藻目中属阶元上究 竟以哪种特征为分类基础最为合适仍存争议. 随着分子系统学研究的发展,这一新的手段也 被引入到藻类系统发育的研究中.然而,针对鞘藻 目分子系统学的研究迄今未见报道,只在相关的研 究中—I8有不超过4个鞘藻目的种类被引入分析. BuchheimJ等人使用了在进化过程中较为保守的 28SrDNA序列对绿藻纲特别是环藻目的系统学进 行了研究,其中仅涉及鞘藻目中鞘藻属和毛鞘藻属 各一个种,至今未见有关鞘藻目种类的28SrDNA序 列的更多报道. 本研究采样涉及该目所有的三个属,通过对 28SrDNA序列进行测定与分析,构建了鞘藻目系统 发育树,以进一步探讨其进化关系与进化模式. 1材料与方法 1.1样品采集及培养实验材料包括鞘藻属的七 个种类和枝鞘藻属的一个种类,分别采自湖北多个 地区(东经110.6.一l15.,北纬30.4.一31.7.)和湖南 张家界(东经110.4.,北纬29.1.)地区.于实验室条 件下分离纯化并培养,培养采用Bold'sBasal培养 基L9J,光暗周期为16h:8h,光照强度为25E/m2?s, 培养温度为20—25?. 1.2DNA的提取,28SrDNA序列扩增及测定采用 收稿日期:2006.09.13;修订日期:2007.03.13 基金项目:中国自然科学基金面上项目(No.30270116);中国科学院水生生物研究 所创新领域前沿项目(No.220104)资助 作者简介:梅洪(1979一),女,汉族,湖北武汉人;在读博士;主要从事藻类分子系统学 研究.E-mail:m.ih@ihb.ac.n 通讯作者:胡征宇,E-mail:huzy@ihb.ac.ca 4期梅洪等:基于28SrDNA序列的鞘藻目系统发育研究493 CTAB(Cetyltrimethylammoniumbromide)方法提取单个 样品中的基因组总DNAL】...PCR反应参照Buchheim 等人[6]的方法,以ITS.4rc[…和LS.18【j为PCR引物扩 增28SrDNA片段.25/~L反应液包括ltLLDNA模板, 1p.mol/L引物,0.2mmol/LdNTPs,3.0mmol/LMgC12及 1UraqDNA聚合酶(Fermentas公司).反应共30个 循环,其中变性94.C,lmin,复性52.C,lmin,延伸 72~C,105s.扩增产物用QtA.quickkit试剂盒纯化. 引物ITS.4rc和LS.18也被用作序列测定,其他测序引 物均引自Buchheim等人L6J的研究.28SrDNA序列测定 使用自动测序仪(AppliedBiosystems3730Stretch),每个 碱基均重复测定.其余序列来自GenBank(表1). 表1用于28SrDNA序列分析的种类,株系来源,序列参考文献及GenBank序列号 Tab.1Speciesusedfor28SrDNAsequencesanalyses,strainsouI'ce,sequencesreferenceand accessionnumbers Chaetopehidales Chaetophorales Chlamydomonadales Sphaeropleales PlanophilaterrestrisGrooveretHofstetterUTEX1709 AphanochaetemagnaGodwardUTEXB1909 Chaetophoraincrassata(Huds.)HazenUTEXLB1289 SchizomerisleibleiniiKtttzingUTEXLB1228 UronemabelkaeMattoxetBold(O'KellyetFloyd)UTEX1179 CharaciochlorisacuminataLeeetBoldUTEX2095 CharaciosiphonrivularisIyengarUTEXLB1763 ChlamydomonasparkeaeSAG24.89 DunaliellatertiolectaUTEX999 HL'ococc',clctfrUTEX16 三06Dc7mnzc',ncoloradoenseKugrensClayetAgui~Kugrens OogamochlamyszimbabwiensisUTEX2214 VolvoxcarteriIyengarUTEX1885(HKIO) ChlorococcumellipsoideumDeasonetBoldUTEX972 TetracystisaeriaBrownetBoldUTEX1453 ChlorosarcinopsisbastropiensisUTEX1698 ChlorosarcinopsisgelatinosaCCMP1511 Bulbochaetehiloensis(Nordst.)TiffanyUTEX66 OedodadiumprescottiiIslamM2,采于湖南张家界,小溪旁的潮湿土 壤表面 OedogoniumcardiacumWittr.UTEX40 OedogoniumnodulosumWittr.L1,采于湖北麻城一小池塘内,混生 于多种丝状藻类中 OedogoniumpakistanenseIslam&SarmaM5,采于中科院水生所一水 缸中 Oedogoniumsp.I3,采于武昌纸坊青龙山--d,水坑内 Oedogoniumsp.1.6,采于湖北神农架自然保护区香溪源,急湍的 溪水中,藻丝附于岩石上 Oedogoniumsp.L7,采于武昌纸坊青龙山--d,水坑内 OedogoniumsubdusimileJaoL5,采于武昌磨山湿润土壤表面 OedogoniumsubplagiostomumLeyL2,采于武昌纸坊青龙山一小水 坑内 NeochlorisaquaticaStartUTEX138 Buchheimeta1.2o0l Buchheimeta1.2o0l Buchheimeta1.2o0l Buchheimeta1.2o0l Buchheimeta1.2o0l Buchheimeta1.2o02 Buchheimeta1.2o02 Buchheimeta1. Buchheimeta1. Buchheimeta1. Buchheimeta1.2o02 Buchheimetal Buchheimeta1.2o01 Buc}l}Ieimeta1.2o0l Buchheimeta1.2o02 Buchheimeta1. Buchheimeta1. Buchheimeta1.2o0l Presentinvestigation Buchheimeta1.2o0l Presentinvestigation AFl83480 AFl83449 AF18347l AF183483 AFl83489 AF395493 AF395494 DQ015731 DQ015753 DQ015727 AF3955O9 DQ015758 AF18349O AFl83470 AF395513 DQ015736 DQ015737 AF183453 DQ335880 AF183478 DQ335874 PresentinvestigationDQ335881 Presentinvestigation Presentinvestigation Presentinvestigation Presentinvestigation Presentinvestigation DQ335876 DQ335878 DQ335879 DQ335877 DQ335875 Buehheimeta1.2001AF277653 494水生生物31卷 1.3序列比对及系统发育分析利用ClustalX 1.8_】1对基因序列片段进行比对(alignment),参考 Booton等_51的方法,用SEAVIEW[131程序对序列行排 序并辅以手工校正;使用MEGA3_1J计算得序列的 碱基组成;核苷替代的饱和性分析使用 DAMBE4.1[】51. 采用邻接法(NJ),最大简约法(MP)和贝叶斯 法(Bayesian)[161构建分子系统树.邻接法分析使用 由Modeltest[171得到的Tamura&Nei_】8_遗传距离,分 析使用PAUP*4.0bl0_1.节点支持率使用1000次 bootstrap(自展)检验.运用PAUP*4.0bl0的最大简 约法构建分子系统树,运用了两次heuristicsearches (启发式搜索),第一次heuristicsearches的参数如 下:1000random.sequenceadditions(随机序列加权) (每步保留20棵树),TBRbranchswapping(树二等分 再连接树枝交换).此次得到的6棵树被用作下一 次heuristicsearches,第二次heuristicsearches的参数 为:MULTREES,TBRbranchswappingandSTEEPEST DESCENT.使用非参数自展法(nonparametricboot. strapping)检验分支的可信度,参数如下:1000replica- tions,heuristicsearches,10randomsequenceadditions, TBR,andMULTREES.运用MrBayesv3.0b4_2?,采用 TrN+G+I模型(该模型是通过Modeltest检验获 得)构建Bayesian分子系统树.马可夫链蒙特卡洛 (MCMC)数如下:numberofgenerations(代数)= 1000000,numberofchains(链数):4,samplefre. queney(取样频率):100,temperature=0.5,start. ingtree:random;舍弃老化样本数burnin= 1000(100000generations),15000generations时已达 平衡. 2结果 2.128SrDNA序列特征 本研究共获得中国鞘藻目2属共8个种的细 胞核编码的核糖体大亚基基因5端1862bp的序 列,并从GenBank下载了另两个仅有的鞘藻目种类 的该基因序列,同属绿藻纲另7个目和4个种类的 共36个种类的同一序列以及作为外类群的2条序 列一起读人ClustalX中排序,生成供系统发育分析 的序列矩阵.在这1862个序列位点中有715个碱 基存在变异,约占38.4%;简约性信息位点478 个,约占25.7%.A,T,C,G碱基平均含量为 25.9%,22.0%,21.6%,30.5%.其中,A+T含量 (47.9%)要低于C+G含量(52.1%).转换和颠 换与TamuraandNei遗传距离的线性相关显示这些 位点没有突变饱和(图1). , g 弓 暑们 兰 高 图1绿藻纲28SrDNA序列核苷酸替代与TamuraandNei遗传 距离的相关性比较显示其转换和颠换均没有突变饱和 Fig.1PairwiseinferredsubstitutionscomparedwithTN93distances from28SrDNAsequencesoftheChrolophyceaetoshowthatneither transitionsnortransversionshavereachedsaturation 4期梅洪等:基于28SrDNA序列的鞘藻目系统发育研究495 2.2系统发育分析 对本研究所用的28SrDNA序列进行Bayesian 分析,结果为:一lnL=13559.4424;碱基频率为A= 0.2681,C=0.2111,G=0.2810,T=0.2398;替代矩 阵为[A.C]=1.0000,[A.G]:2.8004,[A.T]= 1.0000,[C.G]=1.0000,[C.T]:6.2699,[G.T]= 1.0000;不变位点的比例为I=0.3998;变异位点的 Gamma参数为G:0.5686. D95 Bl D55 B嬖7\ D,P/Bloo 基于细胞核编码的核糖体大亚基基因5端序列 用Bayesian方法GTR+G+I模型构建的50%多数 一 致树见图2,并与用NJ和MP方法分别构建的多 数一致树进行比较.分支节点处的数字分别以D,P 和B开头表示NJ,MP和Bayesian树中对此节点的支 持率,枝长表示分歧度.从图2可以看出,三种方法 所构建的一致树在鞘藻目,胶毛藻目 (Chaetophorales),环藻目(Sphaeropleales),衣藻目 D,Bl P99 D83 P59 P98 D/P,Bl00 PlanophilaterrestrisUTEX1709 .NeochlorisaquaticaUTEX138 PediastrumangulosumUTEX1370 SchroederiasetigeraUTEXLB2454 D50D/P/B1 D84B100f[ P64 Bl0 Iu一D77/P95 DictyochlorisfragransUTEX127 ChlorococcumellipsoideumUTEX972 ChlorosarcmopsisbastropiensisUTEX—1—698 HaematococcuslacustrisUTEXl6 ChlorosarcmopsisgelatinosaCCMP1511 DunaliellatertiolectaUTEX999 B100r—CharaciosiphonrivularisUTEXLB1763 D/P/B100C[~Lobocharac--mr---cDP删Kugrens '——一CharaciochlorisacuminataUTEX2095 D,Bl0o P99 OogamochlamyszimbabwiensisUTEX2214 ::-—------------一ChlamydomonasparkeaeSAG2489 TetracystisaeriaUTEX1453 D/P,Bloo~trasporaspUTEX—LB234 D/P/Bloo D/P,Bloo D/P,Bloo VolvoxcarteriUTEXI885(HK10) 0lsubsititutions/site 图2用Bayesian方法基于GTR+G+I模型构建的50%多数一致树 Fig.2Fiftype~emmajority—ruleconsensustreederivedfromBayesianan山sisusingGTR+G+1 分支节点处的数字分别以D,P和B开头表示NJ,MP和Bayesian树中对此节点的支持率,(MP树:一致性指数(cI):O.4643,同缘性 指数(HI)=0.5357) Modelbranchlengthsareproportionaltothenumberoftheexpectednucleotidesubstitutions. Estimatesofbranchsupportpmdedineludebootstrap support(%)whent>50 B:Bayesianposteriorprobability;P:parsimony;D:distance 496水生生物31卷 (Chlamydomonadaleslineage)及Ince~aeSedis这几个 大的进化枝上是统一的,且除了在衣藻目的支持率 上NJ和MP树的支持率分别为94和64外,节点的 支持率都达到了100%.对于本研究所关注的鞘藻 目,树的拓扑结构显示了该目与胶毛藻目有相对较 近的亲缘关系,但尚未得到较好的支持.在鞘藻目 内,NJ,MP和Bayesian的一致树都支持毛鞘藻属植 物(BulbDchaetehiloensis)在鞘藻目中处于较分离的位 置,支持率分别为55%,57%和52%,同时也都显示 了枝鞘藻属植物(Oedocladiumprescottii)与鞘藻属植 物没有明显界限.对于本研究中包括此种枝鞘藻的 鞘藻属类群,NJ和Bayesian树都很好地支持了两种 雌雄异株具大雄的种类(Oedogoniumcardiacum和 Oedogoniumsp.L3)所组成的姐妹群处于较基部的位 置,但MP树中对此的支持却很低;三种树对其他鞘 藻属种类之间的关系都基本一致. 3讨论 本文采用28SrDNA序列分析方法,对鞘藻目的 系统发育进行了分析,用3种方法构建了系统发育 树,所得的结果大致相同,其中NJ树和Bayesian树 更为相似. 在本研究中,树的拓扑结构显示了鞘藻目与胶 毛藻目有相对较近的亲缘关系,只是未有较好地支 持,这种亲缘关系是与这两个目的形态学研究结果 相一致的.在形态学上,这两个目都由分枝或不分 枝的丝状种类组成,因此,Booton等L5曾就此两个目 关系提出过假设,并试图用18SrDNA序列分析验 证,但18SrDNA结果并不支持它们之间紧密的亲缘 关系.28SrDNA序列是否能更好地支持此形态学 结果尚需进一步研究. 鞘藻目的单系性在28SrDNA序列分析中再次 被3种方法以100%的支持率所肯定,进一步确证了 形态学和前人通过18SrDNA序列分析的结果L5J. 形态学上,因鞘藻目的种类独具特殊的细胞分裂方 式(包括形成分裂环的居间分裂和形成帽状结构的 顶端分裂),环状排列鞭毛的大型动孢子和复杂多样 化的有性生殖特征[22,23],使其自成一个相当独特的 类群.Booton等人用18SrDNA序列构建的系统树 也100%支持了鞘藻目的单系性. 从绿藻纲中各个进化枝的分歧度来看,鞘藻目 显然是经过快速进化形成,因而较其他目的种类有 着一些形态上独具的特征,使人们很难确定它与其 他目的关系.在鞘藻目内,各个种类的分歧度相对 较小,这就呼应了形态学上鞘藻目各个种甚至各个 属之间有很多相似的特性,如都具形成分裂环的细 胞分裂和形成帽状结构的顶端分裂,都具环状排列 鞭毛的大型动孢子,都具复杂多样化的有性生殖特 征.同时,这种小的分歧度也使得鞘藻目的种类间 分界不够明显. 鞘藻目内的三个属中,毛鞘藻属处于鞘藻目的基 部位置(NJ,MP和Bayesian树的支持率分别为55%, 57%和52%),而枝鞘藻属与鞘藻属无明显分界.在 Booton等[]通过4个鞘藻目种类的18SrDNA序列分 析得到的结果中,也得到了毛鞘藻属处于较分离地位 的结论,但该研究由于采用的鞘藻目种类数目有限, 对枝鞘藻属和鞘藻属的关系未做进一步讨论.本研 究选用了较多的鞘藻目种类,得到了枝鞘藻属种类混 于鞘藻属种类中的结果.从经典分类学上也可为本 研究的结果找到依据:一方面,在此目中,毛鞘藻属植 物的形态特征和个体发育都显示其特化的一面,如刺 毛,分枝的出现,基细胞具连续分生能力的分裂方式 及形成刺毛时的复杂分裂过程;另一方面,早期认为 枝鞘藻属植物独具的基细胞无附着器分化和形成帽 状结构的顶端分裂两个特征也在一些陆生的鞘藻种 类中被观察到[2,24一驯.以上结论充分说明,28SrDNA 序列分析用于鞘藻目系统发育研究是合适的. 在已有的有关鞘藻目的28SrDNA序列分析研 究L6J中,由于仅得到了鞘藻属和毛鞘藻属各一个种 的序列,而无枝鞘藻属植物的序列,枝鞘藻属与另两 属的关系无法通过此基因的序列分析得出.本研究 补充了该属的序列,使得基于28SrDNA序列研究三 个属的关系成为可能,并证实了28SrDNA和18S rDNA序列分析结果的一致. 但因为28SrDNA序列比较保守,基于该序列的 数据不太适合用于分析属内种间的关系,鞘藻属内 种间的亲缘关系尚未得到明确的结果,有待更多种 类和分子标记引入分析. 参考文献: [1]HuHJ,LiYY,WeiYX,eto2.FreshwaterAlgaeofChina[M]. 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