钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白SNAT2_HA融合蛋白的构建及鉴定

钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白SNAT2_HA融合蛋白的构建及鉴定 )( 4 1 1 上海师范大学学报自然科学版 Vol ,4 1 ,No ,1 第 卷 第 期 2 0 1 2 2 Feb ,, 2 0 1 2 年 月 Journal of Shanghai Normal University( Natural Sciences) SNAT2 )H A钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白 融合蛋白的构建及鉴定 *,,,, 董晓云王 函孟 雯李 洋张 舟 ( ,200234)上海师范大学 生命与环境科学学院上海 SNAT2 : ,摘 要钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白 在哺乳动物组织中广泛表达具有转运中 ,) , 、性氨基酸的功能在谷氨酸 谷氨酰胺循环肝脏糖质新生等生物通路中发挥重要作用为了 SNAT2 PCR ,HA 方便测定 在细胞膜上的表达和定位本研究采用 扩增和酶切连接将 标签蛋白 )S NAT2 )H ASNAT2 C pBK )C MV( 1098 ) 1300),与 Δ 的 末端连接构建了真核生物表达载体 , HEK293T Westernb lot ,表达载体用脂质体转染法将该表达载体瞬时转染到 细胞中通过 法检 )SNAT2 )H A , pBK )C MV1098 )1300 )( 测到 融合蛋白在细胞膜上的正确表达和定位Δ SNAT2 )H A ,SNAT2 , 表达载体的成功构建为今后对 的结构和功能的研究提供了有效方法 : SNAT2; ; 关键词中性氨基酸转运蛋白 融合蛋白构建和鉴定 : Q 31A1000-5137( 2012) 01-0083-06: : 中图分类号 文献标识码 文章编号 0引言 Sodium )c oupled Neutral Amino Acid Transporte,rSNAT) ( 钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白 属于 SLC38 , ,SLC38 SystemA SystemN 基因家族根据各成员的对转运底物的偏爱性家族又分为 和 两个亚 ,SystemA SNAT1、SNAT2 SNAT4,( alanine) ; SystemN SNAT3 族其中 中包括 和 偏爱转运丙氨酸包括 和 ,1,SNAT5,,( glutamine) ,偏爱转运含氮侧链的氨基酸如谷氨酰胺 SNAT2 SystemA ,,、、是 中的第二个成员在哺乳动物组织中广泛表达主要转运丙氨酸天冬酰胺半 、、, SNAT2 504 ,胱氨酸谷 氨 酰 胺甘氨酸等中性脂肪族氨基酸由 个氨基酸残基组成理 论 分 子 量 为 56 kDa,11 ,S NA T2 1? 1 ( TMD) 被预测具有 的比例共转运钠离个跨膜区域在转运氨基酸的过程中以 ,1,2,6,8,,,pH , ,SNAT2 子 进入细胞对细胞外的钠离子浓度具有依赖性转运过程可被低 抑制同时还受到荷 ,1,,, SNAT2 ,尔蒙调节在肝脏的糖质新生中发挥着重要的作 用参 与 氧 化 代 谢是体内主要的氮转运载 ,2,, ,SNAT2 ) ,,体在谷氨酸神经元中可能提供丙氨酸给 α 酮戊二酸为神经递质的合成提供另一条途径 SNAT2 ,, 由于 在转运一个中性氨基酸进入细胞的同时协同转运一个钠离子产生一个正的静电荷因此 , ,SNAT2 , 转运过程有电流产生基于这个特点可以运用膜片钳技术来研究 在生理条件下的功能通过膜 ,6,,SNAT2 ,TMD1 82 TMD8 片钳技术研究发现介导阴离子的渗漏跨膜区域 中的 位天冬酰胺和 中的苏 : 2011-08-29收稿日期 : ( 30870560) ; ( 1054050340)0 ; 基金项目国家自然科学基金项目上海市科学技术委员会项目上海市教育委员会科研 ( 09ZZ1039) ; ( S30406) ; ( DZL808)创新项目上海市重点学科建设项目上海师范大学细胞生物学重点学科建设项目 : ( 1987 )) ,,; ( 1971 )) ,,作者简介董晓云女上海师范大学生命与环境科学学院硕士研究生张 舟 女上海师范大 ,学生命与环境科学学院教授 * 通信作者 SNAT2 , ,SNAT2 ,SNAT2 氨酸参与了 与钠离子的结合据报道在哺乳动物细胞中具有重要的生理功能的 ,3,, SNAT2 ,功能紊乱可能导致严重的神经退行性疾病结构的精确解析有助于明确作用机理为功能的 ,SNAT ,确定和药物的筛选提供依据但是目前还没有任何关于 家族转运蛋白的晶体结构解析的报道 ,,: 生物膜上所含的蛋白称为膜蛋白根据蛋白分离的难易及在膜中分布的位置膜蛋白可分为三大类 , SNAT2 11 , 、,外在膜蛋白内在膜蛋白和脂锚定蛋白含有 个跨膜区域属于内在膜蛋白目前对内在膜蛋白 ,: ,的结构和功能的研究存在很多困难主要原因在于一是内在膜蛋白的表达量很低应用基因工程的方法 ; ; 来大量表达也存在着很多困难二是内在膜蛋白的分离纯化有很大的难度三是膜蛋白晶体的长成十分困 ,4,,5,, ,,难因此现阶段只能在酶学和细胞生物学的水平上进行其结构和功能的研究从而膜蛋白的专一性 , ,抗体即成为不可或缺的工具但是膜蛋白有效的专一性抗体制备极其困难目前还没有特别有效的专一性 SNAT2 , PCR SNAT2 )H A 的抗 的抗体商业化本研究采用 和酶切连接等方法获得含有 融合蛋白的真核生 pBK ) CMV( 1098) 1300) ) SNAT2 ) HA,( humane mbryonic kidney 物表达载体 Δ并将其转染人胚胎肾细胞 cell,HEK293T cell) ,SNAT2 ,中表达鉴定为进一步研究 的结构和功能奠定了基础 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与试剂 1, 1 、质粒菌株和细胞株 pBK )C MV( 1098 ) 1300 ) ( pBK )C MSNAT2 V) ,Δ以 下 简 称 Δ 质 粒 载 体 和 基因为本实验室所有 E, co DH5( Tangen) ,HEK293T ,liiα细胞株从中科院生物化学和细胞生物学研究所细胞库购买 1, 2主要试剂 TM 2 × PCR taq mx Generay marker 1kb、SpectraMutcoor Hgh RangeP roten Ladder i; DNA lilii 酶购自 公司购Fermentas izard Plus SV Minipreps DNA Purification System Promega Gel Midi Purification; W; 自 公司购自 公司 Kit TNGEN ; garose BOWEST ; ba、Bp、T4 DNA gase、CP( IAAIXIlIliI购自 公司胶购自 公司限制性内切酶 去磷酸 ) NEB igh Glucose1 × ) 、、0, 25% Trypsin ) EDTA1 × Gibco ; ; DMEM( H化酶购自 公司胎牛血清购自 公司脂质体 TM Lipofectamine2000 Invitrogen ; BCA Protein AssayK it Pierce ; cocktail 购自 公司购自 公司蛋白酶抑制剂购自 Roche PBS 、Tris、TEMED、( ) 、、N,N) ; ’公司甘氨酸电泳特级丙烯酰胺亚甲丙烯酰胺均购自上海朝瑞公,; PVDF Mpore ; X ) OMAT BT X 、ECL illi司为 进口分装试剂膜化学发光试剂盒购自 公司柯达 医用 射线胶 Kodak MouseA nti ) c ) HA Tag Monoclonal Antibody ; DTT、SDS、GoaAt nti ) ; 片购自 公司购自中科英沐公司 MouseI gG ( H,L) ) HRP Conjugated SecondaryA ntibody Sigma , 购自 公司 2方法 2, 1 引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 与合成 pBK )C MV)S NAT2 XbaI , ,以 Δ 为模板设计上下游引物上游引物引入 单酶切位点下游引物引入 HA ) ta gBlpI,Forward p rimer: 5' ) G CT / CTAG / A ( XbaI ) GATCCCTCGAC- 序 列 和 单 酶 切 位 点 CTCGAGATC) 3 ' Reverse p rimer: 5' )C GCGGG C/ TAA / GC ( BlpI ) TTAGGCATAATCGGGTACATCGTA- AGGGTA( HA) ATGTCCGCCTGCAGAGGCATCGT)G 3 ', , 引物由上海生工公司合成 2, 2 PCR pBK )C MV)S NAT2 PCR , 0, 5 ng / L,以 Δ 为模板利用上下游引物进行 扩增模板浓度为 μ上下游引 0, 4mol / L, PCR ×30 ; 72?: 94?1 min s,66, 5? 30 s,72? 5 min; 94? 30 物浓度为 μ条 件 如 下 循 环 10 min; 4? , 1% , PCR ,保存用 琼脂糖凝胶电泳检测将 产物用胶回收试剂盒回收 2, 3pBK )C MV)S NAT2 )H A Δ 重组质粒的构建 Xba、Bp PCR h,1% , IlI3 用 限制性内切酶对 产物双酶切 琼脂糖凝胶分离回收得插入片段用同样两种酶 pBK ) CMV( 1098 ) 1300) ) SNAT2 min,1% Agarose 3 h 30 对 Δ双酶切 并去磷酸化 胶分离出载体片段并回, 1? 3 16? 6 h, E, coli DH5,收将载体片段与目的片段以 的摩尔比 连接 将连接产物转化进感受态α 1 85)H A ,,,: SNAT2 第 期 董晓云王 函孟 雯等钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白 融合蛋白的构建及鉴定 2, 4 PCR、菌液 双酶切和测序鉴定 r r PCR KanKanLB ,LB ,PCR 菌液 鉴定 在 的 固体平板筛选挑取单菌落接种于 的 液体培养基中的 F ) 5' )C TTGGGGTATACCAGCGGCCTTTCT)C3 ' ,上游引物为目的片段上的 下游引物为载体片段上 R ) 5 ' )A TCTCCATTCGCCATTCAG)G 3 ', PCR 2603bp, PCR Taq Master: 的 条 带 大 小 为 的 反 应 体 系 为 ) 1 Mix( 2 ×) 5 L,BstZ17I )F 0, 4 mol / L,DXY )R 0, 4 mol?L ,1 L,ddH O L, PCR 10 μμμ菌液 μ加 至 μ反 2 min; 94? 30 s,65? 30 s,72? 1 min × 30 min; 4? ,: 94? 2 ; 72? 10 应条件如下循环保存 pBK )C MV)S NAT2 )H A XbaI、BlpI 双酶切鉴定 对构建好的 Δ 质粒经 两种限制性内切酶进行双酶 ,: ( 10 ×) NEB buffer41 L,( 100 ×) B SA 0, 1 L,XbaI( 20U) 0, 1 L,BlpI( 20U)切双酶切鉴定体系为μμμ 0, 1 L,400 ng,ddHO L, 37? 1 h,,10 μ模板 加 至 μ双酶切 随后进行琼脂糖凝胶检测 2 XbaI、BlpI SNAT2 )H A ,测序鉴定 对连接位点 处和完整的 序列进行测序检测酶切位点处连接正 ,确且整个基因序列无突变的发生 2, 5 SNAT2 )H A 重组质粒 的脂质体转染 6 1 × 10HEK293T cm 5% CO 37 ? 24 h 10 ,将约 细胞接种于直径为 平皿中于 培养箱中 培养 后细 2 90% Lipo 2000 g Lipo2000 1? 3( g / L) ,,6 胞汇聚约 密度按照 的说明重组质粒 μ与 以 μμ的比例先溶解于 ,10, 5% CO? , pBK )C MV)37 36 h ,培养箱 中 下 培 养 收集细胞并提取总蛋白和膜蛋白对 照 组 为 Δ DMEM( )) ,5 min 300 L ,HEK293T :6 h , ,4 中后两者混合得 μ混合物转染进 细胞中后 换 液放 置 在2 SNAT2 HEK293T pBK )C MV)S NAT2 )H A HEK293T , ,转染的 细胞实验组为 Δ 转染的 细胞 2, 6膜蛋白提取 2 + 36 h ,,PBS( 0, 1 mmol / L Ca,1 mmol / L 转染 后将对照组和实验组细胞取出放置在冰上用预冷的 2 + Mg) 1 min,3 ,1 mL RIPA ( 50 mmol / L Tris )H Cl pH7, 4、150 mmol / L共 洗 次然后加入 预冷的 裂解液 NaCl、1 mmol / L EDTA、1% TritonX ) 100、1% 、0, 1% SDS、cocktail ) , 脱氧胆酸钠加入 蛋白酶抑制剂将细 eppendorf ? ,1 000 r / min 15 min ,,30 min,4 胞收集到 管中冰上裂解 随后于 离心 后取上清从中取出 200 L,,BCA , 4 ? ,30 000 r / min 30 min,μ标记为总蛋白并用 试剂盒测定蛋白浓度将剩下的上清 离心 100 L ( 40 mmol / L Tris )H Cl pH7, 4、5 mmol / L MgCl、0, 4 mmol / L EGTA) ,将沉淀溶于 μ重悬液中标记 2 ,BCA , 1 /4 ,为膜蛋白并用 试剂盒测定蛋白浓度将总蛋白和膜蛋白样品加入 体积的上样缓冲液后分装 ) 20 ? ,冻存备用 2, 7 Western Blot WesternB lot SNAT2 , ( 1 ) 10% SDS )P AGE 应用 技 术 检 测 转运蛋白的表 达用 法 分 离 总 蛋 白 ( 10 g) ( 2 g) ,( 2 ) PVDF ,4 ? ,40 V 2 h, ( 3 ) μ和膜蛋白μ将凝胶上的蛋白转移到 膜 上转 膜 小 心 取 出 PVDF TBST 5% 1 : 2 h, ( 4) TBST( 2, 5% 膜用 洗膜后加入 脱脂奶粉封闭液室温振摇封闭 加入用 脱脂奶 ) HA ( 1? 3 000) ,1 h, TBST min × 3 , IgG ,15 粉稀释的鼠源抗 的一抗室温孵育 用 洗膜次加入羊抗鼠 )HR P ( 1? 5 000) ,1 h, TBST min × 3 , ( 5) ,,15 二抗室温孵育 洗膜次放射自显影 3结果与讨论 3, 1 质粒载体片段和目的片段的获得目的片段 pBK ) CMV) SNAT2 PCR , PCR 1% 5 L ,以 Δ 为模板利用上下游引物进行 扩增取 扩增产物 μ上样琼脂 ,2 000 bp 903 bp , PCR XbaI,1 ,糖凝胶检测可观察到一条稍小于 的条带与目的片段 相符将 产物回收后用 BlpI ,1 890 bp,1 A,, 和 单酶切位点进行双酶切酶切后的条带为 如图 并作为目的片段回收 pBK ) CMV) SNAT2 XbaI ,BlpI ,3 XbaI )X baI ) Δ 中 为双酶切位点为单酶切位点个酶切位点的排序为 BlpI, XbaI、BlpI ,3 : XbaI )X baI ( 2 986 用 限制性内切酶进行酶切在凝胶成像系统中可观察到 条条带条带bp) 、XbaI ) BlpI ( 202 bp) 、BlpI ) XbaI ( 5 825 bp) ,1 B, BlpI ) XbaI ( 5 825 bp) 条带条带如图 其中 条带作为载 3, 2 重组质粒的获得及鉴定 1? 3 E, coli DH5,,将回收的载体片段与目的片段以 的摩尔比连接并转化进感受态 α 中过夜培养 r KanPCR , XbaI 7 ,通 过 筛选出 个单克隆菌落进行菌液 鉴定阳性克隆取其中的一个阳性克隆再次用 BlpI ,5825 bp 1890 bp ( 2) ,和 双酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳显示 和 两个片段图 证实目的片段已插入到 ,载 体大片段中 A: 1, 1 kb DNA marker; 2, PCR bp,,1890 产物双酶切结果 B: 1, 1 kb DNA marker; 2, pBK )CM V( 1098 ) 1300) )S NAT2 Δ双 酶1, 1kb DNA marker; 2, 阳性克隆质粒双酶切条 ,BlpI )X baI ( 5825 bp) 、XbaI )X baI 切结果条带由上至下为 条带条 带; 3, 插入片段对照,1 890 bp; 4, 载体片段对照,5 825 bp( 2986 bp) 、Xba )B p ( 202 bp) ,Bp )X ba IlIlII带条带其中对 条带 2 图 双酶切检测 ( 5825 bp) 进行回收作为载体片段 1 图 双酶切结果 ,,DNA ,为确保重组质粒的正确无移码突变等情况的出现对该克隆进行 测序测序结果表明在连接 ,pBK )C MV)S NAT2 )H A ( 3) , 部位无移码突变获得正确的 Δ 质粒图 3, 3 esen Blot Wtr鉴定重组蛋白的表达 SNAT2 )H A pBK )C MV)S NAT2 )H A 将构建好的含有 融合蛋白的真核生物表达载体 Δ 质粒瞬时 HEK293T 10% SDS) P AGE A 36 h ,,、,H转染 细胞 后提取总蛋白和膜蛋白通过 的 电泳分离转膜用抗 SNAT2 )C MV)S NAT2 , 4, ,pBK 标签的蛋白抗体检测 在细胞膜上的表达同时以 Δ 做对照结果如图 对 ,SNT2 )H A 50 :70 k A照组中总蛋白和膜蛋白样品无特异性条带抽提的总蛋白和膜蛋白在 之间有条 ,2,,SNAT2 kDa SNAT2 5) ,56 ,( 带同 蛋白的 相符表明 在细胞内和细胞膜上的正常表达和定位图 pBK )CM V)S NAT2 )H A : 1, pBK )CM V)S NAT2 Δ 表达Δ 瞬时转 HEK293T 10 g; 2, pBK )CM V)S NAT2 染 细胞膜蛋白 μΔ 瞬时转染 HKE293T 10 g; 3, pBK )CM V)S NAT2 )H A 细胞总蛋白 μΔ 瞬时转 HEK293T 2 g; 4, pBK )CM V)S NAT2 )H A 染 细胞的膜蛋白 μΔ 瞬 HEK293T 10 g时转染 细胞总蛋白 μ 4 Western Blot 3 pBK )CM V)S NAT2 )H A 图 检测图 Δ 结构示意图 1 87)H A ,,,: SNAT2 第 期 董晓云王 函孟 雯等钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白 融合蛋白的构建及鉴定 SNAT2 11 ,N ,C ,预测 共有 个跨膜区域端在细胞膜内端在细胞膜外 SLC38 ,SNAT2 白色球表示在 家族中保守性氨基酸残基黑色球代表 独有的残基 5 SNAT2图 细胞膜上正常表达定位的 4结论 SNAT2 )H A ,pBK )C MV ,CMV SNAT2 在 质粒构建过程中是一个真核表达载体由 启动子启动 基 HEK293T , HA 9 ,因在 细胞中高效表达序列是由 个氨基酸构成的短肽当与其他蛋白构建在一起共同 ,表达时并不影响其他蛋白的功能而作为一个标签蛋白被广泛使用 SNAT2 ( Sodium )c oupled Neutral Amino Acid Transporter ) 2共转运钠离子的中性氨基酸转运蛋白 ,SNAT2 、在哺乳动物组织中的广泛表达转运中性脂肪氨基酸的特点使得它在氧化代谢神经传递和糖 ,7,,IL ) 6 SNAT2 ,SNAT2 质新生中发挥着重要的作用还可以刺激 活性的上调在信号转导中可能起着 ,,SNAT2 , SNAT2 一定的作用因此对 的结构和功能的解析显得日益紧迫作为一种定位在细胞膜上有 11 SNAT2 ,、 个跨膜结构的膜蛋白表达量低分离纯化困难限制了对 结构和功能及转运机制的深 入 研,4,, PCR SNAT2 PCR ,HA C ,( 1、究本研究通过 和酶切连接将 连接在 的 末端并通过菌液 和双酶切图 2) ,pBK )C MV)S NAT2 )H A ( 3 ) , 和测序技术鉴定成功地构建了 Δ 质粒图 将重组质粒用脂质体法转 HEK293T ,WesternB lot , 染进 细 胞 中通过提取总蛋白和 膜 蛋 白 进 行 检测蛋白的表达和定位显 示SNAT2 )H A 56 kD ,( 4) , 蛋白为 左右的蛋白能够正确定位在细胞膜上图 SNAT2 )H A ,HA SNAT2 在真核生物表达载体上的成功构建使通过抗 抗体检测 在细胞膜上的表 ,SNAT2 ,达和定位提供了有效的工具为深入研究 的结构与功能及转运机制奠定了基础 :参考文献 ,1, MACKENZIE B,ERICKSON J D, Sodium-coupled neutral amino acid ( SystemN / A) transporters of the SLC38 genamie- f ly,J,, PflugersArch-Eur J Physio,2004,447( 5) : 784 ) 795, ,2, YAO D,MACKENZIE B,MING H,et al, Novel SystemA Isoform Mediating Na1 / Neutral Amino Acid Cotransport ,J,,JB C,2000,275( 30) : 22790 ) 22797, 2009,38( 4) 338 ) 341,,科学版 , ,M,, 1 , : ,2005, 4, ,杨福愉生物膜版北京科学出版社 ,5,GUO Z Y,CHANG C C,LU X,et al, The disulfide linkage and the frees ulfhydryl accessibility of acyl-coenzyme a: choles- terol acyltransferase 1 as studied by using mPEG )m aleimide,J,, Biochemistry,2005,44( 17) : 6537 ) 6546, ZHANG Z,GREWER C, The Sodium-Coupled Neutral Amino Acid Transporter SNAT2 Mediates an Anion Leak Conduct- ,6, ance thatI s Differentially Inhibited by TransportedS ubstrates,J,, Biophysical Journal,2007,92: 2621 ) 2632, JONES H N,JANSSON T,POWELL T L, IL )6 stimulates system a maino acid transportera ctivity in trophoblast cells ,7, through STAT3 anidn creased expression of SNAT2 a ctivity,J,, Am J Physiol Cell Physiol,2009,297: 1228 ) + 1235,ZHAN G Z,GAMEIRO A,CROWER C, Highly conserved spaaragine 82 controls the interaction of Na with the ,8, sodium coupled neutral amino acid transporterS NAT2,J,, JBC,2008( 18) : 12284 ) 12292, ,,,, pIRES2 )EGF P J,, Life HEK293 ,,9, 胡子有漆松涛张遐等大鼠 μ 型阿片受体的 质粒构建及其在 细胞中的表达 Science Research,2009,13( 6) : 501 ) 503, Construction and characterization of Sodium coupled Neutral Amino acid Transporter SNAT2 HA fusion protein *DONG ao-yun,WNG Han,MENG Wen, ang,ZHNG Zhou XiALIYA ( College of Life and Environment Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China)Abstract: Sodium coupled Neutral Amino acid Transporter2 ( SNAT2) ,widespread expressedin the mammalian tissues,plays an important role in the pathways goluf tamate glutamine cycle and gluconeogenesis, To determine easily SNAT2 expression and loca- tion in the membran,ewe construct aenu karyotic expression plasmid with HA at the C terminus of SNAT2 in pBK CMV( 1098 )Δ 1300) by moecuar bioogica methods, After transienty transfectedi nto human embryonic kidney ces ( HEK293T) ,correctyllllllllexpression and location of SNAT2 H A fusion proteins are observedin cell membranesb y western blot, The plasmid pBK CMVΔ ( 1098 ) 1300) SNAT2 HA provides a goodt ool for studying structure andu fnction of SNAT2 in the future, Key words: sodium )c oupled neutral amino acid transporter2 ( SNAT2) ; fusion protein; construction and characterization ( : )责任编辑顾浩然