禽流感红细胞凝集实验(HA)与红细胞凝集抑制实验(HI)一:实验设备及仪器
1.离心机一台(30000转)
2.冰箱一台(存放抗原)
3.振荡器一台(震荡96孔V型板)
4. 抗原:禽流感(AI)抗原,从厂家购买
5. 多孔移液器即排枪一把(量程为5到50微升,做稀释血清用)
6. 一次性枪头(高压灭菌后使用)
7. 1%到0.5%体积的鸡红细胞悬液(健康成年鸡的红细胞,但须严格洗五次)
8. 柠檬酸三钠(配置3.8%抗凝剂使用,制作红细胞悬液采鸡血时加入血液,防止血液凝固)
9. 吸管一毫升跟十毫升量程
10.吸耳球:跟吸管配套使用
11.蒸馏水:即无菌双蒸水,清洗96孔V型板
12. 10毫升离心管,离心红细胞用
13. 生理盐水:做血清稀释液用,及配置4单位抗原
二:实验前准备 1. 抗原:根据指定免疫类型从生物公司购买稳定的浓缩抗原 2. 抗凝剂的配制:用
分析
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天平称取3.8克柠檬酸三钠,溶解于100毫升生理盐水中,待溶解完全后即可使用。 3. 1%红细胞悬液制作:去菜市场找杀鸡的,去找他们用试管接新鲜鸡血,试管中提前加入抗凝剂,加入的抗凝剂与你所接血液的比例大概为1:2,并迅速混匀,在离心机中以3000转离心五分钟,用吸管吸取上清液和红细胞上层的白细胞薄膜,将沉淀的红细胞加生理盐水,慢慢混合均匀,不要弄碎了红细胞,再在离心机中3000转离心五分钟,弃去上清,再加生理盐水混匀,如此往复四到五次。最后一次离心后,去掉上清,管低即为红细胞泥,用吸管吸取0.1毫升红细胞泥,然后加入9.9毫升的生理盐水就是1%的红细胞悬液,现用现配不要长时间存放。 4. 被检血清:乡镇送来的血液,离心取上清即为被检验血清,注意做标记,一管一标记,别弄混了。 5. 血清稀释液:为灭菌生理盐水,即高压过的生理盐水
三:实验步骤
血凝(HA)实验
目的是测定抗原效价,即为了制作后面的四单位抗原
1.首先用微量移液器向96孔V型板的每一孔加生理盐水25微升
2.用微量移液器吸取待测抗原(就是你买的抗原)的25微升于第一孔中并且挤压六次混合,后吸出25微升至第二孔,依次倍比稀释到第11孔,11孔中弃去25微升。这一过程最好一孔一换针头。
3.用微量移液器再吸取1%红细胞悬液一次加入各孔,每孔25微升
4.置于微量振荡器上震荡一分钟
5.室温静置30分钟观察结果
6. 结果观察:将反应板倾斜成45度角,沉于底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀,
表
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明红细胞被或者不完全被病毒所凝集:如果孔底的红细胞铺平孔底,凝集成均匀薄层,说明被病毒凝集。能使鸡红细胞完全凝集的抗原最高稀释浓度,成为该抗原滴度红细胞凝集效价,即这个比例稀释的抗原就是一单位的抗原。比如第八孔红细胞完全凝集,但第九孔红细胞不凝集,那么这个抗原的效价为1:256。也就是你买来的抗原稀释256倍为一单位抗原,那么稀释64倍就是四单位抗原。
四单位抗原校正:
1. 就是你依照上个实验所作出的抗原效价来配置,比如假设上一步抗原效价为1:256,那么四单位抗原就是256除以4为64倍稀释浓度的抗原,也就是你将买来的抗原稀释64倍就是四单位的抗原,但是你买的抗原不同,鸡红细胞的本身原因,计算出的抗原效价不同,所以你必须先做抗原效价的计算。
2. 首先用微量移液器向反应板的第二孔至第六孔加生理盐水25微升,第一孔不加。
3. 用微量移液器吸取四单位抗原25微升分别加入第一孔,第二孔,从第二孔开始挤压六次混匀,后从第二孔吸出25微升至第3孔,依次倍比稀释到第五孔,弃去25微升。
4. 用微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入1到6孔,每孔25微升。
5. 在微量振荡器上震荡一分钟。
6. 室温静置30分钟观察结果
7. 如果照上面的结果来计算,如果第四孔发生百分之五十红细胞沉淀而第五孔完全凝集,那么久说明四单位抗原制作准确。
血凝抑制实验(HI):每排只能查一份血清,步骤如下
1. 用微量移液器先加25微升生理盐水在每个孔中
2. 用微量移液器吸取待检测血清25微升于第一孔中,然后倍比稀释至第11孔,(就是稀释原则跟上面的一样),最后11孔弃去25微升,最后第12孔不加血清,作为对照试验。
3. 用微量移液器吸取配置好的四单位抗原25微升,每一个孔都加入25微升。
4. 置于振荡器上震荡一分钟,混合均匀
5. 室温静置20分钟
6. 用微量移液器吸取1%红细胞悬液于每孔各加25微升。
7. 置于微量振荡器上震荡1分钟,混合均匀。8. 室温静置40分钟后观察结果
四:结果判定
1. 判定结果:以完全一致红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的HI滴度,以2的指数表示。
2. 判定
标准
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:禽流感H5抗体:抗体值要在6以上,也就是至少在第六孔之前不发生红细胞凝集显现,六孔之前发生凝集现象表示抗体浓度低下,需要重新免疫
禽流感H9抗体:抗体值要在7以上,判定标准跟上面一样。
浙公网安备 33021202002483