货号: QS1900 规格：50管/24样
谷丙转氨酶（GPT）活性测定试剂盒说明
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可见分光光度法
正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
GPT（EC 2.6.1.2）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化氨基酸和酮酸转氨基反应，在氨基酸代谢中具有重要作用。此外，哺乳动物肝细胞GPT活性很高，当肝细胞坏死，GPT释放到血液中，血清GPT活性显著增高。因此，GPT被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。
测定原理：
GPT催化丙氨酸和α-酮戊二酸发生转氨基反应，生成丙酮酸和谷氨酸；加入2,4-二硝基苯肼溶液，不仅终止上述反应，而且与酮酸中的羰基加成，生成丙酮酸苯腙；苯腙在碱性条件下呈红棕色，可以在505nm读取吸光值并计算酶活力。
自备实验用品及仪器：
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：30mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体5 mL×1瓶， 4℃保存；
试剂二：液体5 mL×1瓶， 4℃避光保存；
试剂三：液体50 mL×1瓶，4℃保存；
样品测定的准备：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定操作表：
1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至505nm，蒸馏水调零。
2、 在EP管中加入下列试剂
试剂名称（μL）
测定管
对照管
待测样本
20
煮沸10min的待测样本
20
试剂一
100
蒸馏水
100
混匀后，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确反应30min
试剂二
100
100
混匀后，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确水浴20min
试剂三
1000
1000
混匀，室温放置10min，在505nm波长处，测各管吸光度A。ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管需设一个对照管。
计算公式：
1、
标准
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条件下测定的回归曲线， y = 0.4228x+0.0003 (x为标准品浓度，umol/mL；y为ΔA)。
2、血清（浆）GPT活力的计算
单位的定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。
GPT（nmol/min/mL）=（ΔA-0.0003）÷0.4228÷T×103=118.26×（ΔA-0.0003）
3、细胞、细菌和组织中GPT活力的计算
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。
GPT（nmol/min/mg prot）=[（ΔA-0.0003）÷0.4228×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =118.26×（ΔA-0.0003）÷Cpr
需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。
（2） 按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。
GPT（nmol/min/g鲜重）=[（ΔA-0.0003）÷0.4228×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =118.26×（ΔA-0.0003）÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。
GPT（nmol/min/104 cell）=[（ΔA-0.0003）÷0.4228×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×103 =0.236×（ΔA-0.0003）
V1：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V2：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，20min；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万；103：1umol/mL=103 nmol/mL。
1、 标准曲线线性范围为：0.01 umol/mL -2 umol/mL。
2、 ΔA线性范围为：0.01 -2。
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