【公告】失败—成功—体味—收获—思考—交流,讲述你我实验中的故事

【公告】失败—成功—体味—收获—思考—交流,讲述你我实验中的故事 【公告】失败—成功—体味—收获—思考—交流，讲述你我实验中的故事 养细胞难，养原代细胞更难。刚开始做实验时，只是跟在师姐后面看看，传传递递东西。后来自己做，第一次居然养的很好，可能时看多了，步骤都烂熟于心了，当时那个兴奋阿。可是到消化细胞二次接种时，问题来了。做了几次细胞都不贴壁，基本上都漂了。问师姐，我俩的胰酶用量和消化时间都差不多。于是，干脆让师姐帮我消化一次。我看了一眼终止消化前的细胞状态，才恍然大悟:原来师姐在细胞变圆及有部分开始漂时终止消化，而我终止消化时候细胞基本全漂了。操作时间上差的很少，但就是这细微的时间差，细胞可以发生很大改变，细胞的活力受到了影响。后来，我消化细胞时不再看时间，只要镜下改变有了就终止消化，这样接种的细胞在1小时左右就贴的很好了。看来做实验不能按部就班，要从实际出发阿。 最近又是一个失误， ,心痛了好几天啊～ 虽说原因不在自己的操作，但是想起来仍是惭愧啊～ 我有两株细胞，打算等到状态长得好，数量也足够的时候，冻上以留种，这样心里就会有多多安慰了，有了保证不用担心丢失了。在各种冻存的条件都有的那一天，我很不舒服，浑身没有力气，什么也不想做。一方面，害怕自己万一晕晕糊糊的操作失误或者其他原因导致不可挽回的错误;另一方面，自己确实那天犯懒了。。 于是呢，就决定把它们传一下。 结果，第二天一看，几乎全部死光光。呜呜,, 哭都来不及了 没有办法只好面对现实，好好保护剩下的几瓶很少的细胞，等待它再次长起来。 寻找原因啊，我可以确定操作没有失误，用的也都是高压后的东西，污染应该不会。再看细胞，那天上午所有处理的细胞无一例外的变得黯淡无光，难道是培养液的问题, 不可能啊，同样的培养液，额下午用来处理的细胞就安然无恙啊。 再想，,,,，操净台～ 对就是它了。 我们实验室有两个操净台，它的紫外的开关有点不正常，有时会有你关了它却仍是开的状态，就算用前你确保它是关闭的，它也会在你用的过程中自动开启,(我已经被照过两次了，好在时间不是很久，胳膊灴了几天才好，现在，每次都把手套与隔离衣紧密连接好才进去)。 而那天一定是我不知道的情况下紫外已经打开，保护好了自己，却伤害了可爱的细胞，...... 后来一经交流，才知道，我不是第一个碰到这种情况的人。 好在都还有幸存者(那天没有处理的 )，终于今天就可以冻了 。欣慰啊～～ 总结一下就是:1.只要你是培养细胞，就不要偷懒，哪天该做怎样的处理了，一定要坚持处理，不然，出现的意外，都是始料不及的。 2.一定注意不要让紫外与你的细胞亲密接触 呵呵，不知朋友们，有没有碰到过，最好没有，希望以后也不会， 这是不是也算是，有时细胞无故状态不好，或者无故身亡的 一个可能原因呢, 看到这么多细胞培养的前辈们的经验，受益匪浅。 本人学细胞培养至今整三个月，培养过三种购买回来的细胞株EC,SMC,SAOS-2,以及从原代培养的HUVEC和rat BMC。谈点自己的感受吧: 1、找个高手指点会事半功倍，还要不懂就问，初学者没什么禁忌，不懂很正常的，我是跟着老外学的，刚开始学想问都没法顺利表达那才叫痛苦呢。 2、实验器皿，除了移液管和烧杯，其它全为一次性的，虽然花多一点钱，但是培养效果很好，省心省力。还有，我们洗移液管和烧杯，都是4遍自来水冲洗，3遍双蒸水润洗即可。 3、灭菌一定要用灭菌指示胶带，不贵，一卷60元正常使用可以用半年，可以区分是否灭菌，方便安全。还有胶带上一定写明日期和姓名，两星期没用应该重新灭菌。 4、不管是传代还是原代培养，细胞状态好的时候一定要冻存，这样以后做实验也不会心理没底了。我们的冻存步骤是:加冻存保护液，异丙醇做冻存温度缓冲液，首先置与-70度冰箱两天(最多不能超过一星期)，接着转移至液氮冻存，效果良好。 5、常用的试剂可以配成高浓度，便于保存。比如trypsin-EDTA，配成10倍浓度后用冻存小瓶分装，每次消化取出一瓶即可。 6、如果发现细胞死亡，而未观察到染菌现象，细胞应该继续培养一两天观察。我就有这样的经历，有一次培养的细胞一下子都没了，只有悬浮的一些细胞，以为细胞全死了，但还是换了培养基，结果第二天，换成蓝色滤光片后，惊奇地发现可爱的细胞还好好活着呢，呵呵，幸亏没丢掉。 7、每周一三换液，周五传代。传代的时候PBS和trypsin都要先用0.2um的滤膜过滤(不管以前有没有过滤或灭菌，这一步都必须的)，如用25cm2的培养瓶，则先用5mlPBS洗两次，用trypsin洗一次后，再加trypsin进行真正的消化，之后加至少与trypsin等量的培养基稀释后离心，1000rpm，5min就行。 8、如果能够配一台吸液的设备，如医用的吸痰器，细颈的滴管，这样在弃去培养瓶或培养板的液体时，效率会极大提高。 感想挺多，暂写这些，大家指正。本人在成都，欢迎PM。 !不错不错 我在杭州一小公司,在租的一个老实验室养细胞,条件极其艰苦.一个几十年前的二氧化碳培养箱还是通过控制气体流速调二氧化碳浓度,一个老空调噪音很大,杭州夏天温度极高.在天气好时细胞在我尽心呵护下还长的健康,到夏天来了,我发现细胞一天比一天差,心里打鼓了.没有污染,我仔细看过,培养液也没变,其他操作如常.实在不甘心细胞就这样死光,想到这实验室里人都热得受不了,细胞是不是被热坏了?于是过一会去看一次培养箱温度,果然发现有段时间温度太高,都38度了.我打开空调,几天后,细胞好了,小点 不多了.以后我不光只看培养箱温度等参数,还要关注天气预报,免得又热坏了我的细胞. 有谁在这么艰苦条件下养过细胞? 呵呵，恭喜获得论坛第一分，对于低分战友，我们会鼓励的，希望你能做的更好 本人正在做单克隆抗体的扩大培养，收集上清。有一点心得想要与大家分享。 得到单抗的三轮克隆的细胞株后，得到抗体的方法一般有两种，一种就是打小鼠收集腹水然后纯化，另一种是扩大培养细胞收集上清然后纯化。我现在用的是后一种。 在扩大培养的时候，尤其是同时扩大好几株的时候，细胞很多又不能立起瓶子来长，很容易感觉很乱很杂，不知从那一株哪一瓶开始处理好，而且速度很慢，没有条理。刚开始的时候我也有这种感觉，不过现在感觉就不是这样的了。 。 首先，把不同株的细胞放在不同的地方(比如不同的培养箱，又比如同一培养箱的不同层); 其次，处理的时候，一株一株的处理，处理好的细胞放在靠一层的一侧，界限在哪儿自己要清楚才好，这样就不容易弄乱了; 最后，每处理一瓶(或一孔)，用记号笔在瓶上写明作了何种处理(如换液、传代)，写明处理的日期，如果用的液体不同还可以写上用的培养液，以及其他需要注明的内容。 eg:05.8.5 传 10,NCS (各位战友应该可以看明白，呵呵 “05.8.5用10,NCS 传代”，当然只要自己明白什么意思就好了) OK了，到你下次再处理的时候，按照上面所说的一株一株处理，已处理的与未处理的分放两侧，且每处理一瓶细胞前先看一下之前做的何种处理然后镜下一看，下一步该如何就心中有数了～ 现在就不会再感觉杂乱无章了，而且效率和质量也有了大大提高。当然，心情也会随之明朗起来的， 试验顺利～～ 实验就是细节的积累 正在做细胞的流式分选及分选后细胞培养，有几点经验与大家分享: 1 用于分选的细胞一定要保持最佳状态，否则禁不起折腾。 2 分选的前一天，要考虑好实验步骤，准备好所用物品，严格无菌操作。 3 制备分选细胞液体时，建议用双倍抗生素且含1,FBS的PBS，有利防止污染，保持细胞活性。 4 接分选后细胞所用的流式管里要加200,300微升的血清。 5 培养分选后细胞所用的培养基也要加双倍的抗生素，因为分选的过程并不是严格无菌的。 呵呵，谢谢你的经验，论坛需要这样的经验，以后多帮忙哦 呵呵，我也来凑凑热闹，在做彗星实验中，DMSO和Triton-100都是临用前才加入裂解液中的，而且不能指望用搅拌将其混匀，那样只会越来越浑浊而且会有结晶析出，在配制好裂解液后用固体NaOH调节好其PH后，4度预温用前加入DMSO和Triton-100，加入后会发现稍有乳白色浑浊，这时千万不要用磁力搅拌器去搅拌，放入37度水浴中一会就会澄清不少，偶第一次用磁力搅拌器搅拌了快3个小时结果裂解液彻底报废，汗一个～～ 注:这个是littlesheep004站友告诉我的，不知她会不会找我要版权 呵呵，恭喜获得论坛第一分，对于低分战友，我们会鼓励的，希望你能做的更好 关于细胞污染方面的教训: 有一次整个培养箱的细胞全都细菌污染了。回想严格无菌操作，培养箱也没有污染。最有可能导致这大规模污染的原因可能就在培养基出问题了。然后取点培养基在培养箱培养观察，结果真的发现有细菌生长。但是培养基是瓶装进口的，不会出问题的。血清就成为重点可疑对照。但是血清分装时也是无菌操作的，不过还是拿了一条化开观察。结果发现那离心管竟然是漏的。天啊～ 经过这次教训，我决定1.用进口的离心管分装血清 2.液体冻结后体积膨胀，分装时不能装太满 3.冻血清时要保持管身直立 4.化血清前观察管壁外有没有血清溢出 我做的细胞应该算比较易于培养的成纤维细胞。但在实验中还是碰到很多问题。比如:原代细胞数量不满意;污染的问题;传代后细胞活性减低，贴壁率下降或出现死亡的现象。 在我的实验中，我用以下方法处理这些问题，收到较好的效果。供大家参考。 1.原代细胞数量少:最初实验虽说都有细胞，不是颗粒无收，但总是数量较少。采取的策略是:a.选择权威而相对简易的方法，方法越复杂，步骤多，细胞易于丢失，而且为污染埋下隐患;b.组织剪碎要彻底，这样消化效率会大大提高;c.消化时间要充分，这就得自己摸。消化时不要放在孵育箱，孵育箱内偏酸性，会减低胰酶活性。 2.污染的问题:a.“欲善其事，先利其器”。工作台、器械的消毒至关重要，尤其自己消毒时。b.少说为佳。做实验室不要聊天。c.培养瓶不宜火焰消毒，建议用酒精棉球擦拭。d.忍痛割爱。不仅要善于鉴别污染细胞，而且不要存侥幸心理。以免"一粒老鼠***，坏了一锅粥"。 3.传代过程中细胞丢失:传代的细胞活力往往比原代差，所以消化时间要短一些;其次，吹打不要太用力。本人感觉，对细胞而言物理损伤不亚于化学损伤。 我要培养的是动脉的成纤维细胞，最开始的时候是用兔的动脉做试验，用消化的方法，细胞长的很好，也长的很快;我就觉得细胞培养不是问题。所以也没记录，现在想起来都后悔～ 可是后来又培养鼠动脉，用消化的方法，可它死活不长啦，感觉都消化不下来细胞;也调整了酶的浓度，消化时间，最终还是没长～又改用贴壁的方法，组织也贴上去啦，也没污染，可就是没细胞爬出来～现在已快一个月啦，一点起色都没有，又找不到原因，急死我啦～ 我就想请教楼上的，能不能给我一份你的成纤维细胞的培养的详细的资料～给我指点一下～ ronghuib0128@163.com 不知大家有没有过这样的经历:一株细胞，养的好好的，一天就不明原因的状态不佳，然后就开始补救工作，换液，更甚之，换更高浓度血清的培养液，但是看起来还是没有起色。 几天前，我遇到这种情况，(后来知道原因是因为细胞被紫外照了)，也进行了补救工作，换了两次液后，瓶内只见死细胞残骸增加，却几乎见不到一个活细胞的影子。本想扔了，以后再重新复苏，转念一想，就这么一个小瓶子，放在培养箱里也不占什么地方，于是就往一个旮旯里一放，抱着一丝希望它能有几个活得长起来。结果，几天后看了一下，真的有几个小团的细胞，每一团大概有四五个细胞，好高兴啊 ，不用再复苏了，接着放回去，再几天看，细胞明显增多了。 呵呵，柳暗花明又一村的感觉。战友们如果也有这种情况，尤其是珍贵的细胞株，或者没有后备冻存的细胞，出现了类似情况时，不要轻易的扔掉，反正是对它失去信心了，就把它放在培养箱一角，没准几天后它会给你惊喜呢，呵呵。 我想谈一下关于超净台安全使用的问题:我们实验室的超净台的紫外灯偶尔会自动打开。如果操作时不注意观察，不但那一刹那敞开的细胞被照上，影响细胞生长，裸露的皮肤也会被照射，如果没戴手套就更伤了。虽然紫外的杀伤能力不是很强，偶尔一两次不会有问题，但是如果长期不注意可能会引起蜕皮甚至更严重的后果。不知道大家有没有同样的经历, 我作晶状体上皮细胞的培养,先在还没有做完,有很多失败的经验,希望大家不要重蹈我的覆辙. 刚开始的时侯.细胞一直没有生长不知道是什么原因,查阅文献资料了解到很可能是支原体感染了.支原体是在显微镜下是无法观察到的,而且无法滤过清除掉,细胞感染支原体以后,会生长缓慢,甚至停止生长.所以一定要过好无菌操作这一关. 还有一次培养瓶取出来的时侯发现瓶内长满成片黑色的非细胞样物质.在倒置显微镜下观察,晶状体上皮细胞已经观察不到,观察到的是和细胞一样大小的成毛刺状的团状物.连接成片.覆盖整个瓶底.可能是真菌感染了.细胞全部舍弃.考虑到可能是培养箱的问题,实验决定对培养箱进行消毒:用无水酒精擦试培养箱内壁,包括间隔版,全部用酒精擦试3遍,晾干后再用紫外线照射一小时.培养液重新滤过.消灭可能的污染源. 夏天的时侯细胞更容易污染.操作不过关,在天气不热的时侯,细菌不容易生长,所以没有造成污染,进入夏天后,各种细菌繁殖增加,污染的机会也增加了.所以关键是要做到严格的无菌操作,这样无论在什么情况下都不会污染.而且应该同时培养多批细胞,这样可 以节省时间,即使一批死掉还有预留的几批. 呵呵!看大家说的热闹我也来说说我的经历!那是郁闷的三个月,我养PC12,开学来就开始复苏细胞,师兄和老板一共冻了17-20支,细胞解冻离心后,我按照平时传代种板离心一样吹打了又吹打,把细胞悬液倒入培养瓶,第二天一看,只有极少数的贴壁!大部分葡萄样聚集漂浮着,就这样把师兄冻的细胞over了!慌了,赶紧查 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 看资料,这才知道吹打一定要轻柔!可这只是噩梦的开始!又开始复苏老板冻的细胞,什么都注意了.甚至台盼蓝染色检查细胞活性,细胞活性>50%用最小的培养瓶就底面积25CM2的那种培养,仍然只有几个贴壁细胞,就这样冻存的细胞终于全都完了!只有那几个细胞仍在培养箱中挣扎,一个月过去了他们终于长起一点,培养基黄了,我忐忑的换了液,可第二天一看那几个仅有的细胞不见了!欲哭无泪!就这样三个月过去了!细胞却没有了.直到那一天师姐发现CO2罐用了那么久还很重,才发现孵箱根本就没有CO2!真是惨痛的经验,什么都怀疑了却漏掉了孵箱!而且7721在没有CO2的孵箱还长的很好,真是误导啊! 我讲一下我养MCF-7的失败教训 MCF-7是我养的第一种细胞，当时很紧张但细胞长得竟极好，在一传二的情况下，两天就传一代，培养液都快供不上用了，于是很得意就把师姐曾说的要及时冻存抛到了脑后。结果就在细胞数已够马上要开始实验时一夜之间细胞几乎全部浮起，抢救无效。后来请教细胞所的老师才知道MCF-7培养时一定要加胰岛素否则养到一定时间就不能顺利吸收养份而集体饿死。但我之前查的资料中并未提及这一点，而且很多文章中培养液的成分中都无胰岛素。所以在养一种细胞时一定要尽量找到曾养过的实验员询问 注意事项 软件开发合同注意事项软件销售合同注意事项电梯维保合同注意事项软件销售合同注意事项员工离职注意事项 ，很多时候经验比书本更重要，同时一定要注意冻存，最好是新细胞第一次传代时就冻起1/2到1/3，第二次传代时再冻起1/3，这样既能保种又能保证细胞活性。 此外，一些书上曾提到浮起的细胞可以离心收集后加入培养液抢救，但我的经验是这种细胞并无抢救价值。我试过很多次，这种细胞的存活率几乎为零，就算中间夹有少量有活性的细胞，在大量细胞死亡崩解释放出毒素的环境中也难以幸免。所以，我的建议是彻底清除浮起的细胞，将残存的贴壁细胞换瓶换液并合并以保证细胞密度，而后减少换液以减少对细胞的损伤。 chinaefulle wrote: 我觉得养细胞无菌操作是关键，对于配制培养液时，有些人为了让培养粉充分溶解，搅拌4小时或更长时间。其实这完全没有必要，一般培养基的固体组分还是易溶于水的，搅拌的时间长了会增加污染机会，虽然后来滤过除菌了，但细菌的代谢产物比如脂多糖谁能够把它滤掉,细菌的代谢是很快的，甚至在常温下20min就可以繁殖一代，太可怕了。我的经验就是搅拌30min-60min就把它过滤。 另外关于培养基的pH问题，一般按照 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 书操作，加入所说的NaHCO3量，与预计的pH不会有什么距离，也就是说基本上不用调pH，如果相差大，要考虑三蒸水的质量是否有所下降，当然这时调pH也是不得已而为之。我配培养基时基本上不调pH，只是用试纸检测一下pH，观察一下培养基的颜色。 不知道你配过1640没?它里面有些蛋白质组分就很难溶.就是搅拌四小时以上都不一定能溶.那怎么办?还是30分钟就过滤吗?不溶要紧吗?如果有其他高手知道,也希望不吝赐教! 我们常配1640，一般是搅拌一小时再加NaHCO3,然后在搅拌一小时，很好溶啊，你用的是Gibco的干粉吗,好象我们实验室有用Hyclone的就难溶些。 我做MTT的失败教训 我搜集了园子里关于MTT的好多 帖 行书字帖3500常用字图幼儿笔画描红字帖田字格空白字帖簪花小楷字帖乐善堂 子，其中有个帖子认为加MTT之前要吸弃96孔板内培养液，加MTT为培养液量的十分之一(一般20ul)，但有的帖子认为直接加MTT,我在实验时采用了前者的方法，即吸弃上清，再加MTT,4小时后吸弃各孔内液体，加MTT不见任何颜色反应，晕～实验结果自然没有意义:各孔OD值都很低。我想显然是否加MTT之前吸弃96孔板内培养液导致实验失败，于是重新实验，直接加MTT,果然后来加DMSO有颜色反应了!结果成功～以后实验一定要采用 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 的实验步骤，不可以轻信有争议的帖子～ 真的是好多人在养细胞啊 我刚刚开始做 看到大家这些感慨 我感到压力好大哦 myl0605 wrote: 我们常配1640，一般是搅拌一小时再加NaHCO3,然后在搅拌一小时，很好溶啊，你用的是Gibco的干粉吗,好象我们实验室有用Hyclone的就难溶些。 是啊，我用的就是Hyclone的，因为实验室其它人大多用他们的干粉，口碑还不错，有的说不溶也不要紧，我总觉得可能还是不太好。你们用的Gibco的干粉感觉怎样,好用吗, 我在细胞版也发了这么多帖子了，都是求助别人，至今一分没有，惭愧～ 谈谈我做实验的一点体会，希望版主给个一分半分的～ 我是做朗格汉斯细胞(LC)的培养，先要把表皮细胞弄出来，还要求数量比较大～做了快三个月了，连表皮细胞都还没解决。 感觉在取材的问题走了很多弯路:我取过成年小鼠皮肤全层，根本分离不开表真皮，看文献上说把表皮从真皮层上撕去，就自以为是的用镊子在那个皮上靠里面一面刮啊刮的，留下又白又韧的那层以为那就是表皮，拿着它消化，就消化下来一些纤维样的物质，没有细胞。急得我回去查书，后来才发现我留下的那些应该是真皮的胶原层。又换动物，这次是直接取豚鼠的表皮，细胞是有了，但是豚鼠体积那么大，不好做到无菌，而且细胞不纯，什么细胞都有。现在借鉴了园子里一些做表皮细胞的高手的经验，换做新生鼠，感觉完全不一样，新生鼠和成年鼠的皮肤差别很大，消化后，表真皮很好分离，现在实验才算小有起色。希望写出来给以后准备做表皮细胞的同学一点启示，不要再走我这样的弯路～ 呵呵，继续努力～ 一提起实验，真是觉得没有一个词语能把它讲述出来，形容出来的。一年来一直作细胞方面的实验，从细胞增值、细胞周期、细胞凋亡到细胞分裂，涉及外周血细胞的分离、细胞培养和细胞因子的刺激。但是给我的感觉细胞状态和纯度是最最重要的，不管你后续工作是什么，如果这一步你作不好，那么以后就是冒险赌注。简单的一个细胞增值实验的3H掺入，就做了3个月，不是作不出来，而是结果不稳定，而且大家的结果均不太稳定，标准差太大，有时真是焦头烂额了，从整个实验的各个角度，各个关键步骤都进行了摸索，还是不太理想，有时真想放弃，但作为一个科研工作者，既然入门就要做好，还好现在大有改善，不管是实验的设计，还是细胞的处理，药物的稀释等，这些直接影响了我的结果。 细胞因子稀释时一定切记保存一定体积的高浓度的储存液，防止活性降低。 细胞因子的添加一定要尽量大一点体积，避免非常微笑的体积进行剃度实验。 细胞处理时间尽量短，动作轻柔，你好好对它，它就给你惊喜的结果。 各位站友的经历可谓是各有不同，真是长见识了，谈一下个人浅见，望各位不吝赐教 我做肿瘤细胞药物干预试验，细胞培养条件成熟，药物干预后需要做流式检测细胞调亡情况，预实验时参考园子战友的资料，即:收取细胞时控制消化时间，不宜过长，吹打不宜过度，以减少人为损伤。可是结果出来了，损伤细胞还是占相当比例，影响结果，很是头疼。后来经过咨询实验室老师，查询相关资料自己摸索了一点经验 收取细胞前备好冰盒，用新配制胰酶(新配胰酶效果较好)消化控制在2分钟以内(考虑不同细胞贴壁情况不同，在培养传代时观察消化情况，以便控制消化时间),中止消化后，吹打用力适度，尽量避免气泡形成，因气泡表面张力对细胞有损伤作用，尽量吹打成单细胞悬液以免影响结果，然后4度离心10分钟，弃上清，将细胞悬于4度的pbs，置冰上备用。 还有就是培养细胞时，计数培养瓶或皿细胞数目，这样收取细胞就不必再花费时间计数，可以节约时间，做流式细胞数目不应低于100 0000。 结果还是比较满意，现在基本上能把人为损伤控制在文献范围内，甚至更低。 个人经验希望能有所帮助。也希望各位站友多交流。共同促进。这也正是我们园子的目的: ONE FOR ALL ,ALL FOR ONE. 谢谢版主 我会继续努力的! 昨天实验结果也不错，消化后很多细胞～ 我做过乳大鼠原代成骨细胞的培养，其中酸甜苦辣非言语尽述之。然而，为了对做同种细胞的战友能提供一点帮助，我还是想说说其中的一些粗浅的所谓的经验: 1)关于准备工作，楼上的已经讲得很清楚了，我只强调一点，就是泡过强洗洗液的器材一定要用自来水冲洗15遍，才可放心进行下一道工序。 2)MEM培养基和血清最好用国外的，我用的是hyclone的，国产的血清在没有养成功前和试用后最好不要使用。 3)消化液最好用进口的0.25%胰蛋白酶，一定不要加EDTA，因为加入后后者对细胞的损伤较大(既使用量减半，消化能力还是太强)，影响进一步的实验。 4)胶原酶最好现配现用，否则其活力易减低，不光会浪费实验经费，还会延误实验时间。 5)最好用8-12只状态较好的新生24小时内的乳大鼠，以自已饲养的最为划算，还能保质保量。 6)传代时，消化时间不要太长，跟据自已在显微镜下观察的消化情况确定标准的消化的时间。 7)传代或接板准备测指标时，以血球计数器上测得的细胞数目作稀释后为标准的接板或传代的细胞密度。一般接板时:细胞密度为1.5*10E4 cell/mL，或3*10E3 cell/well(孔);接瓶时，细胞密度为5*10E4 cell/mL(2mL/50mL瓶)。 8)传至2-3代后，如细胞状态好，可设法多冻存一些细胞，复苏后可以传代，传代后长起来就可以筛选药物了。当然，为了让细胞生长快一些，状态好一些，一定要使血清浓度处于10-15%之间，不要担心浪费，在这方面，时间的价值是大于金钱的。 其它的操作与一般的细胞培养没有太大的差别，这是我大半年的多次失败和多次的摸索中总结出来的～ 我现在才开始养细胞，也有一点心得体会，和各位战友分享。 1. 养细胞无菌操作我认为是最重要的，也是养好细胞的前提，包括洗瓶子，配液，超净工作台的清洁，细胞培养室的清扫等等都是很重要的。 2. 培养基的制备，一定要调节好PH值，太偏酸或偏碱都是很不利于细胞生长的，可以看培养液的颜色，颜色太深那就偏碱，适当提高培养箱的CO2的浓度。如果颜色太红，那就在适当加如一些NaHCO3，来调节PH值。 小弟目前就只有这些体会，继续学习中～ 我再说说我的一次失败的经历和教训: 在我开始做原代成骨细胞时，养失败了几次，后来，在做好准备工作并花费了20天左右时间，我养的一只母老鼠生了12只乳鼠。我特别高兴，心想:这下乳鼠特别多，有活干了～做好了一切准备工作，终于消化得到了足够的细胞，我开始小心细致地看护我心爱的细胞了。 然而，我高兴得太早了。 我准备好次日传代，于是我开始换液，换好液后，在我打开培养箱后，拧松瓶盖。此时，意外发生了。瓶子碎了。。。我只好忍痛扔掉这瓶细胞了。一切得重新开始，因为我还没有冻存到细胞做种子呢～ 教训不少: 1)在开始养细胞时，一定要小心拿培养瓶，我就犯了这样一个致命的错误。建议新手在使用时，左手拿瓶，拇指和食指捏住培养瓶的侧面，千万不要把拇指压在细胞贴壁瓶底和瓶顶，以防压拧瓶盖时压破培养瓶。 2)一旦培养成功细胞后，千万记住一定要先冻存几瓶状态较好的细胞，最好是2-5代的细胞。 3)一定要避免一些我犯的这样的低级错误～ 这类低级错误还有:开培养箱时未将手消毒;培养瓶放入培养箱时一定要拧松瓶盖;冻存时忘记编号记录存放位置;注射式滤器灭菌完后在高压锅内放冷却的时间太长，超过了20分钟;使用注射式滤器未准备一次性进口滤器;在刚开始做原代培养时没有用空白的不含有细胞的培养基，染菌后不知是培养基污染还是操作过程中染菌。 诸如此类的错误太多了。 我也来说两句吧，进实验室已经半年了，开始一直很迷茫不知道养细胞为何物，现在研二了，也开始着急了，觉得准备工作很烦琐，我们实验室条件也很差，想烧点三蒸水结果电炉全坏了，手也被烫了，连电子天平也没有，称试剂要等晚上别的实验室主任不在了再找同学带去称，而且实验室的同学们没有互助精神，感觉真的很辛苦，还好有，没事时常来逛逛，学习，虽然现在还没养出细胞，但我不会放弃，继续努力，感谢给我的支持和帮助～ 我是细胞培养的新手啊 ～不过上手还比较快(师兄说的)～经过三次失败和三次总结，现在总算比较成功了(下面说说自己的感受(我做的是心肌细胞培养(一开始听人说心肌细胞特难培养，因为都是用原代，而且要做到细胞同步化搏动需要的条件很严格(不仅仅是无菌操作等一般原则问题，还要自己摸索各个环节的最佳方法(事实证明我在后来的过程中都遇到了(第一次污染是操作问题，做完第二天我发现培养瓶里有好多大肠杆菌(肆无忌惮的吞噬着我的细胞～那个心叫做痛啊(看来还是要严格注意无菌原则～再来～我把培养室和培养箱用甲醛加高锰酸钾熏了一晚上(第二次做完后当时细胞形态很好，等它贴壁吧(当时我就开始想象明天看到大片心肌细胞搏动的壮观景象了，还特地借了数码相机准备照相(谁知道第二天发现培养基里有一些小黑点，我纳闷啊,培养基颜色很正常～细胞形态也还好～不象污染啊,,,我在园子里看了那些典型的污染也不象啊,最后问有经验的师兄，他说可能是小牛血清的问题(虽然抽过滤，但是质量有问题(哦，那就不是我的原因咯(沮丧～换～第三次我吸取了前两次的教训(还查只了一些资料，前面操作做的还不错，但是在离心时离心速度没控制好，一般是,,,,,,, ,转,分 我用,,,转,分 (因为太大我怕影响心肌细胞活性)谁知后来得到的细胞好少，我用的速度太小，丢失了好多细胞～～可惜啊～看来实验环境也要自己慢慢摸索～(后来我发现用,,,,转,分最好()不过不同的离心机有不同的最佳，要自己摸索总结最好～在后来几次中我不断总结经验，现在细胞生长欣欣向荣哦～～～～看来细胞培养也需要永不放弃的耐心和不断的从失败中总结经验的细心才能一步步前进啊 ～～生活何尝不是如此呢, 这个活动搞得真好，可以让许多新手学到经验，少走弯路。就先说说我养细胞的事吧，有些地方和主任的情况有异曲同工之处。 偶是广东的，一般都做鼻咽癌，养的是低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞。师兄走之前，我没法下手做。走的时候手把手教了我养细胞，开始之后，先练练手，细胞长得很好，我暗自窃喜，心想:养细胞很容易嘛。大概过了一个月，开始做试验，我收集固定了十几瓶细胞去广州做电镜，让同学照看三四天，大概第三天的时候，同学短信告诉我细胞液很混浊，可能有污染。因为有一瓶细胞种类很希缺，我第二天就返回了。近十瓶细胞全部培养基变浑浊，描述一下，其他战友可以借鉴，就象米汤一样。而且蔓延速度很快。找来我们的老主任看了看，说可能是酵母菌污染。 当时就想，怎么会污染呢,同学告诉我，我走的第二天，他帮我看看了一下，那时就有一瓶长得很满、但状态不好的细胞培养液变浑了，所以应该不是他操作的问题。我恍然大悟，想起那瓶细胞养了很久，开始量少，长得不好，后来长满了，状态也不好，就一直没传代，想来应该是老化的太厉害了，抵抗不住少量细菌的污染。舍不得那一瓶细胞，却给我的全部细胞带来了灭顶之灾～ 没办法只好忍痛全扔了，用甲醛加高锰酸钾把培养室和培养箱熏蒸一下，过了几天，重新开始养。嗨，却出现了意想不到的问题，细胞怎么也长不好，变形，不亮，就是折光度很差。因为要做RT-PCR，状态不好直接影响抽提RNA,整整三个礼拜，搞得我焦头烂额。开始怀疑是瓶子没洗干净，或者是还是有少量细菌，彻底清查之后，仍然不行。当时是百思不得其解啊～郁闷的要命! 总算我还有点悟性，我发现培养液的颜色好像比以前有点淡，开始怀疑培养液的PH值的问题，马上测量一下，竟是6.7，狂晕～太低了～于是将培养液加碳酸氢钠，调到7.2左右，过了大概三四天，细胞就渐渐复原了。 先说这么多，希望战友们能吸取我的教训。 谢谢斑竹啊～我会继续努力的～ 开始养HL-60细胞，细胞不是很干净，细胞状态不好，说是传代要上面的细胞，我就把培养瓶反过来，倒入新瓶子，仅为这样好操作一些，不容易洒，结果细胞越养越差。后来又向别人咨询，才知道应该瓶子轻轻拿出，把上面的培养液倒入新培养瓶中，这样才能细胞越养越好，结果实践证明果然如此，所以养细胞，细节很重要啊～ 我刚写了一段文字没了，现在只简短说一下我是如何养贴壁细胞的，希望可以得到斑竹的鼓励，可以多看点这的文章。哈哈～ 一开始我养贴壁细胞消化不下来，很郁闷～ 请教了师姐，她说:1)用1-2 mlD-Hanks洗一下细胞，将培养液洗干净，因为残留的小牛血清灭活胰酶2)消化期间，将细胞放于37度孵箱，可加快消化。一试，果然很灵～ 各种细胞特性一览表.doc (27.0k) 我做药物干预试验，观察药物作用0，8，24，48小时后细胞凋亡情况。第一次作发现0小时的凋亡比8小时的还多，原来细胞是头一天接种到6-well plate，第二天开始加药。加药组都把培养液除去，PBS洗一遍，然后加入含有药物的培养液，时间到了以后把所有的培养液和细胞全部收获到一起做FACS。但是，对于0小时的对照组，却要把培养液全部清除后，仅仅收获细胞才对，因为经过一夜的培养，已经有了不少的死细胞，必须把这一部分非药物原因死亡的细胞清楚后才是真正的对照。 试验不顺利，不要急于重做，先找原因，查查资料，和别人聊一聊，到园子里转一转。一味重复，劳而无功，对信心是很大的打击。 细胞培养是个耐力活，碰到困难很正常，一定要坚持～ 呵呵，楼主，我半个月前帮我师弟复苏了一管MCF-7细胞，它刚开始的时候根本就不贴壁，养了两天才开始有一少部分贴壁，我把没贴的都倒掉，加上高糖DMEM接着养，三四天之后可见明显的分裂增殖，大约10天后，就可以传代了。这种细胞刚复苏的时候长得很慢，但只要有一点贴壁，就会长起来，一但密度较大了，呵呵，楼主，它可是长得很快的哟，你就等着两三天传一次代吧。所以说，楼主，不要着急，只要贴壁细胞的形态不错(多边形)，就耐心点吧。 MCF-7刚复苏时长得很慢很慢，主要看贴壁的细胞是不是已经舒展开来(三角形或多边形)，其次，看贴壁细胞是否开始分裂，形成一个一个的细胞群(MCF-7具上皮细胞的性质)。如果开始增殖，就是好现象。 恢复后，会长得快一点，但和其他的乳腺癌细胞没得比，还是不快，传代时比例不要太大。还有，这个细胞恢复时贴壁比较慢，但贴得很牢，消化时胰酶处理要适合，免得大量的细胞仍在皿上不下来。 MCF-7虽然样子难看些，恢复比较慢，长得慢点以外，还是很结实的细胞，并不难养。