【doc】条件培养基对高传代人毛乳头细胞生长的影响

【doc】条件培养基对高传代人毛乳头细胞生长的影响 条件培养基对高传代人毛乳头细胞生长的 影响 648中华廛登苤查生笙三7卷第塑i』nmtolNgvembel20041Vol37.No.11 条件培养基对高传代人毛乳头 细胞生长的影响 罗洋郝飞钟白玉麦跃姜晓勇 【摘要】目的研究人毛乳头细胞条件培养基的生物学活性.方法通过体外培养低传代人毛乳头 细胞.收集其基础培养基的上清液配制成条件培养基,用于培养高传代人毛乳头细胞,观察细胞形态及细 胞生长曲线的变化;同时观察高传代人毛乳头细胞与低传代人毛乳头细胞共培养情况.结果低传代条 件培养基使高传代人毛乳头细胞出现了凝集生长现象,其生长曲线显着优于基础培养基培养的高传代毛 乳头细胞(P<0,O1),其细胞的H-TdR测定值亦显着升高(P<0.01).高传代人毛乳头细胞与低传代人毛 乳头细胞共培养后出现凝集性生长趋势.结论低传代人毛乳头细胞在培养状态下可分泌具有明确生物 学活性的物质. I关键词】毛囊;培养基,条件性;细胞培养 TheBiologicalActivitiesofConditionedMediumDerivedfromHumanDermalPapillaCell sCultured /nVitroLUOYang,HA0Fei,ZHONGBai-yu,MA,Yue,JIANGXiao—yong.DepartmentofDermatology, SouthwestHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversit)',Chongqing400038,China 【Abstract】ObjectiveToinvestigatethebiologicalactivitiesofaconditionedmediumforhumander— malpapilla.MethotisCulturemediumofthelowerpassagehumandermalpapillacellswascollectedasthe conditionedmedium.Thegrowthpatternandthegrowthcurveofthehigherpassagehumandermalpapilla cellsculturedwithconditionedmediumwereobservednvitro.AndthemorphologyoftheCO—cultureofthe higherpassagehumandermalpapillacellsandthelowerpassagehumandermalpapillacellswasobserved. ResultsThehigherpassagehumandermalpapillacells.whichwasculturedwithconditionedmediumfrom thelowerpassagehumandermalpapillacells,showedaggregativegrowthpattern.AndthegrowthCHrveofthe higherpassagehumandermalpapillacellswasmuchbetterthanthatinthecontrolgroups(P<0.01).and thevaluesofH— TdRincorporationwerehigherthanthoseinthecontrolgroups(P<0.01).TheCO— CUlture~1 higherpassagehumandermalpapillacellswithlowerpassagehumandermalpapillacellsshowedaggregative growthpattern.ConclusionTheseresultsshowthatthelowerpassagehumandermalpapillacellscuhuredin vitromightsecretesomechemotacticfactorsthathavesomebiologicalactivitiesonthehighpassagehuman dermalpapillacells. 【Keywords】HairFollicle;Culturemedia,conditioned;Cellculture 一 般认为,毛乳头细胞在毛囊的发育及周期性 生长调控中起重要作用.目前已经发现的一些信号 分子,如成纤维细胞生长因子,骨形成蛋白,神经营 养因子,血小板源性生长因子等:,虽然对毛囊形态 学发生和周期性生长起一定的调节作用,但并未起 关键作用,且多来自毛囊上皮细胞,非毛乳头细胞所 特有.因此,要阐明毛乳头细胞对毛囊发育和生长的 调节机制,必须从毛乳头细胞自身分泌的生物活性 成分着手,这也是今后毛囊研究的内容之一我们在 建立毛乳头细胞体外培养模型基础上,应用低传代 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30200249).重庆市攻关 课题(2001—8—4) 作者单位:400038重庆,第j军医大学西南医院皮肤科 通信作者:郝飞.E-mail:Haofei@mai ? 论着? 毛乳头细胞的培养上清液制成条件培养基,观察其 对高传代毛乳头细胞生长状态的影响.探讨不同生 长状态下毛乳头细胞分泌生物活性成分的能力.为 进一步分析毛乳头细胞生长活性蛋白奠定基础. 材料与方法 一 ,材料 DMEM培养基(低糖)购自Sigma公司D— Hanks液,Hanks液,新生小牛血清购自Hyclone公 司.Hepes购自BoehringerMannheim公司.胰蛋白酶 购自华美生物工程公司.基础培养基:l000mL DMEM液中含15%新生小牛血清.2.4gHepes,2.0g 碳酸氢钠,0.3gL一谷氨酰胺,过滤除菌分装.一20? 冻存备用.条件培养基:30%基础培养基,70%培养 主堡鏖杂声2004箜!鲞笙 3d的1,2,3代毛乳头细胞的基础培养基(收集其 上清液配制成条件培养基).H—TdR工作液:将H— TdR原液10倍稀释,用时加入10tzL(1I-~Ci).6孑L 板,24孑L板,96孑L板,3m微孑L隔膜:购于Costar 公司. 二,实验方法 1.细胞培养与传代:人正常头皮毛囊的毛乳头 细胞,培养方法参照本科建立的方法_2u.收集培养 3d的1,2,3代毛乳头细胞培养基,3000r/min离 心,一20?保存.细胞融合后用0.25%胰酶消化后按 1:3传代,接种到100mL培养瓶中培养. 2.细胞生长曲线:2代毛乳头细胞用基础培 养基培养,9代毛乳头细胞分别用条件培养基和基 础培养基培养.隔日计数1次,分别计数这3组细胞 8个时相点.根据细胞数绘制成细胞生长曲线图 3.9代和2代毛乳头细胞共培养试验:试验共 分3组,2孑L为1组,分别是:9代和2代毛乳头细 胞共培养组,2代毛乳头细胞对照组和9代毛乳头 细胞对照组.取一6孑L板,将浓度为1×10s/mL的8 代毛乳头细胞悬液加入其中的4孑L.每孑L0.5mL. 这4孑L中每孑L再补加基础培养基至3mL,在37?, 含5%CO饱和水汽条件下培养1d后,用吸管吸出 其中2孑L培养基,用基础培养基洗板2次后分别插 入2个3m微孑L隔膜,将1代毛乳头细胞悬液加 入微孑L隔膜中,每孑L内含1代毛乳头细胞数为3× 10,然后给2个微孑L隔膜中分别补加基础培养基至 3mL;已接种8代毛乳头细胞悬液的另2孑L为9代 毛乳头细胞对照孑L.同时在6孑L板中空余的2孑L内 加入l代毛乳头细胞悬液作为2代毛乳头细胞对照 孑L,每孑L内含1代毛乳头细胞数为5×10.6孑L板在 37?,含5%CO饱和水汽条件下培养,每3天换1次 培养基,在细胞融合前观察每孑L细胞的生长状态 4.9代毛乳头细胞凝集性生长重现试验:取 100mL的8代毛乳头细胞2培养瓶,在细胞融合后 弃去培养基,每瓶中加入0.25%胰酶3mL消化 5min,倒出胰酶,加入Hanks液3mL作用1min后 倒出,再加入6mL基础培养基,用吸管吹散毛乳头细 胞,1:3传代,其中3瓶每瓶加入条件培养基5mL: 另3瓶每瓶加入基础培养基5mL.所有培养细胞在 37?,含5%CO饱和水汽条件下培养,每3天换1次 培养基,在细胞融合前观察每孑L细胞的生长状态 5.H—TdR掺人试验_3?:取基础培养基培养的毛 乳头细胞(2,4,6,8,10代)和条件培养基培养的毛 乳头细胞(8,10代)各代4瓶,待细胞融合后弃去培 养基.用0.25%胰酶消化后加入5mL相应培养基, 用吸管吹散毛乳头细胞使其成为悬液后接种于96 孑L板内,每孑L接种1×10毛乳头细胞,每一培养瓶 平行3孑L,每孑L用对应培养基补加至0.25mL,在 37?,含5%CO饱和水汽条件下培养24h,最后加 入1tzCiH—TdR工作液培养12h后在Beckman coulterLS6500Multi—purposescintillationcounter上 测定c/min值 三,统计方法 SPSS10.0分析软件.细胞生长曲线用多因素试 验与方差分析(重复测量试验的方差分析);,H—TdR 掺人试验用t检验(配对样本的f检验). 结果 一 ,细胞生长曲线 根据两代细胞在不同培养基中测得的各时相细 胞数,绘成生长曲线图(图1).可见9代毛乳头细胞 +条件培养基组细胞生长明显优于9代毛乳头细 胞+基础培养基组(F=1198.10;P<0.01),但比2 代毛乳头细胞+基础培养基组差(F=2452.83:P< 0.01).用SPSS10.0重复测量试验的方差分析处理后 3组数据差异有显着性(F=75.98;P<0.01). 二,9代和2代毛乳头细胞共培养 9代和2代毛乳头细胞共培养后,可见9代毛 乳头细胞有凝集性生长趋势(图2),而9代毛乳头 细胞对照组未出现这种现象.说明低传代毛乳头细 胞分泌的活性蛋白可有效诱导高传代毛乳头细胞向 低传代生长状态转化 三,条件培养基作用于9代细胞 1,2,3代毛乳头细胞加入基础培养基在细胞 融合前可明显见到凝集性生长现象,而当毛乳头 细胞传代至7代时凝集性生长现象消失,用条件培 养基作用于9代毛乳头细胞,可见9代毛乳头细胞 旦 × -_ 螽 匪 图1毛乳头细胞生长曲线罔 . ]~'d2fL m Ld..卅".. I]I?的凝蜒K现象(3).【而9代t乳,圳 9包』】求J禹继{I:-r_Il蒙H"辘(纠 q.H一H捧凡试验 _J{坫till}lii:5荐琏Jf'l:诈";hrlft,乳细叶乜5n【l r_I1{删t24.6.8.Io代的一/min删芷仉i仆圳 II465?968.4851J?385.2I{?196I822?I53 1301l?II9I1.行到J砌持【眦埘棹fI"J{t救I多. iI—I?dl{Il4fl『噬渐降nt.址』e足lm6ft乳,【【胞 降低曲北IJ川条Jff非liEJ,~}释高传代E4-Lftif 啦iI}f)Jll,In'H—TIt/删定.4ini"删定nr『舒 圳灯4OlII?j.254I?237川儿厅yl川rf_1'1IlIii 定瞢r时jc8f7uI?(…)IIn fJ=9411P<c】_】1) ll前对,乳?细l世l均刊究啦现一此性坦l 眨i眦子刈E瞧的fl:响删n川.』f.rr~J已乳 ?细1乜J矗IJ【艟nJ是训眦台I盯lf.多『化 I:T"Y细幢lql!J』昕I艇集什?们特什'然,砖 毛乳~-:flJ胞忖K的机1殳物'#特口j倚 缺:Eft&研酋,卜lilJ!{J]的研究1,我?lrE 乳细旰乜1Jf4;ol,艇皋,kK:岳l,的物功能明 媸J凝壤『K,,『辕的西导毛鞋形u能J. 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