【doc】单细胞血小板钙浓度测定及功能关系的探讨

【doc】单细胞血小板钙浓度测定及功能关系的探讨 单细胞血小板钙浓度测定及功能关系的探 讨 ?142?ChinJMedLabSei.M盯l996,Vo[19,No.3 f,一f 单细胞血小板钙浓度测定及功能关系的探讨 丛玉隆殷宗健,张立文王俊玫 ———,—一,,',— 一 P摘要目的建立单细胞血小板钙浓度测定方法,探讨正常人服抗血小板功能药物前后,血小板 钙离子浓度变化及相应功能变化的关系.方法利用特异荧光染料Flou一3对血小板内钙离子染色, 井在激光共焦显微镜下,观察同一十血小板在激活前后钙离子浓度,形态及聚集率变化.结果加入 二磷酸腺苷(ADP)激活后血小板钙浓度是澈活前的269.3.激活前,血小板形态呈圆形或椭圆形, 边缘控光滑,无空泡.加入ADP后,形态不规则,可见手镜样突起,突出部分为太空泡.服药第二天, ADP激活后的1IX4,板钙浓度仅为激活前的76.3…0z血小板形态无变化,聚集率明显减低:结论正常 X~n4,板经ADP激活后.胞浆内钙离子浓度明显升高,井弓『起相应的形态变化和功能的改变,阿司匹 林可抑制这种变化.应用激光共焦显微水探讨单十血小板钙浓度变化,证实其可以直观血小板钙浓度 变化,井能同时观察这种变化与血小板形态和功能的关系,可作为研究血小板功能及抗血小板药物 撒星:姗'4,4v/~!.,而',关键词钙血小板,.,,:'l170 Observationofcalciumconcentrationandaggregationofplateletswithlaserscanningconfocalmicro— scopeYulongrYingongjiatZhangLiven,a1.GeneralHospitalofPLA,BeOing100853 AbstractObjectiveToobservetherelationbetweenCaconcentrationinasingleptateletand p]ate[etsaggregationinthenormalbeforeandaftertakingaspirin.MethodsCa一 COt'lcentrat[onina sing[eFtouj[abeiedp[ateletWaSobservedwithlaserseanning? nfocatmicroscope(LSC).The p[ateletshapechangeandaggregation~,ereobser-~edsimu[taneous[y.ResultsWithoutaspirin,Ca concentrationinasing[epLateletsharplyandtheshapeofthep[ateletchangeddistinctlyafterADP stimuiation-Withaspirin?theplate[athadindistlnctiYrisingCa"concentration.noshapechangeand reducedaggregationrRteafterADPstimu[ationConclusions1.Thenorma[ptatelethadremarkably risingCaCL,ncentration,anddistinctshapeandaggregationchangeafterADPstimulation.Aspirinin— hibitedtheincreaseofCaconcentrationintheptatetetandtheaggregationofp[ateletsafterADPsdm ulation2.WeobservedCa"_concentrationinasingleplatetetwithISCMforthefirsttimeinChina, andthismethodawaytostudyplatetetfunction,pathogenicfactorsandtherapeuticdrugs KwordsCalciumPtatelet 关于血小板功能及其与胞浆内钙浓度变化 的关系,以及血小板激活过程中前列腺素与环 磷酸腺苷(cAMP)与钙浓度的变化,文献屡有 报道.但迄今未见有直接观察同一个血小板激 活过程中钙浓度的变化,及与治疗药物关系的 报道,笔者应用Flou一3钙离子特异性荧光染 料,在激光共焦显微镜下观察了正常状态,正常 人服用阿司匹林前后血小板内钙浓度的变 作者单位:100853解放军总医院 化,探讨了其与血小板功能的关系 对象与方法 一 ,研究对象 体检身体健康成年男性3倒,经一般血液学检查 及血栓止血实验[血小板聚集功能,血小板计数,血小 板3因子有效性谟f定,活化全血凝固时间(APTT),凝 血酶原时间(PT),凝血酶时间(TT)]检查结果均正常, 未服任何药物. =,方法 中华医学检验杂志I99B年5月第19卷第3期 静脉呆血5m[,按9:l}匕侧加入1.09mmal/l枸 l蝽酸钠抗凝,以【000r/min离心5分钟,分离富含血小 板血浆(PRP),血小板数约为200×l0/I,即刻浓度 为20beg/m1的二磷酸腺苷(ADP)为诱导剂进行血小板 聚集试验;同时将PRP滴加在载玻片上.加入经1/6 稀释的Flau3染料,加盖玻片,用激光共焦显微镜及位 相显微镜定位单个血小板.观察形志变化.尔后技射荧 光并进行单个血小板断层扫描.每屡血小板切面(共9 层)强度(代表钙离子浓度)以直方图表示,然后在显馓 镜下.沿盖玻片也缘加凡ADP15M.利用毛细现象t使 ADP与PRP混合,静置10分钟后,重复上述步骤,获 得激活后血小板形态和钙离子分布直方图.受试者口 服阿司匹林o.3g,第二日重复服药前全部试验. 结果 一 ,激活前后血小板钙浓度变化 对比同一血小板服药前加入ADP前,后钙 浓度变化,可见加入ADP后,钙离子浓度显着 增加(直方图面积相当于激活前的269.3). 服药后,激活前后血小板钙离子浓度直方图显 示.激活后的面积反而减少,仅相当于激活前的 i !孥‰ 圈1术服用盟暇用阿司匹林血小板激话前后钙高于浓度直方图 一围2血小板断层钙浓度荧光图形(圈中9十图象来自 一 十血小板的同横向切面) 服药莳 时剜(分种】 圉3B【圭罔阿辑时板聚熊章比较 76.3,这一现象至少可以说明由 于药物的抑制作用,尽管加入了激 活剂,钙浓度无明显变化(图1).血 小板单个细胞断层钙浓度测定图 形见图2 二,血小板形态的变化 激活前血小板呈圆或椭圆形, 边缘较光滑,无伪足突起,胞浆内 荧光强度弱而均匀,无空泡.加入 ADP后,细胞形态不规则,可见手 镜样突起.突出部分为大的空泡, 胞浆其它部分也可见空泡形成,胞浆内亮度不 均匀,部分凝集成块状.发出耀眼的荧光.服药 后.加入ADP前后,血小板形态无明显异常(图 2) 三,服药前岳血小板聚集功能的变化 服药前,在进行受试者血小板内钙离子浓 度测定同时,进行血小板聚集实验,尔后服用阿 司匹林l1_3g,次日在行钙离子测定同时,重复 聚集功能测定,结果5分钟聚集率分别为74 和5l(图3). 讨论 血小板在血栓形成的过程中起重要作用. 血小板激活后的形态改变及其粘附,聚集和释 放反应,均与胞浆内钙离子浓度变化直接相关, 因此,血小板钙流变化是研究血栓前状态的热 点课题:以往文献报告的有关血小板钙流的研 究,或是应用生物化学方法.或是应用流式细胞 ? 甄戢矗攀 ^一甘牮壬目 术分析,虽能反映其浓度变化,但是干扰因素较 多.且不能直观钙离子变化与病理生理功能的 关系.为此.我们进行了上述实验分析共焦显 微镜是利用激光使特异性荧光素着染的待测成 分发出荧光,以便在镜下进行三维扫描的荧光 分析仪器(断层扫描).直接测量单个血小板每 个断层切面的荧光强度,该强度即代表钙离子 浓度.因而此法既能观察激活前后血小板形态 的变化,也能定量钙离子浓度,直观地了解血小 板形态,钙浓度及与功能的关系如前所述.血 小板在静止状态下钙离子浓度鞍低,形态正常 加入诱导剂后,AI)P与血小板膜特异性受体结 合后,加强了胞浆内花生四烯酸代谢.促进了致 密小管中储存钙的释放,增训的钙离子激活了 多种钙依赖I生酶,使肌球蛋白磷酸化,形成肌球 蛋白复合物产生收缩反应.而发生了笔者所见 到的形态变化由于血小板的变形.促进_r血小 板的二相聚集当受试者服用阿司匹林后,影响 ChinJMedLabScL.M199B.Vol19.No3 了花生四烯酸代谢,阻断了钙离子释放,影响了 血小板活化,因此从实验结果中可以看出,尽管 加凡ADP.血小板内钙离子浓度减低(或无变 化),血小板形态如常,聚集功能较服药前减低. 这些结果与有关的血小板生理,生物化学研究 结论是一致的.笔者使用的方法,迄今未见有类 似文献报道,我们认为激光共焦显微术单个血 小板钙浓度测定+可作为血小板功能,致病固素 及治疗药物研究的一种新的实验手段,对基础 研究和临床实践有一定的价值 参考文献 l…n1aM?H?DavidAHRcDr0fsforAIIPonhunlan hplateletsr目】【isPharmaco[Sci,1994.1j】03 :阮长耻.血桂与止血现代理论I}l『临床实践南京:江苏科 技出版壮.鲫4.7982. (收穑:1995-1.0?07修回:l99601201 (本文编辑:张莉) 从婴儿脓血便中硷出圣胡安沙门菌 姜秀尝?国欣 圣胡安沙门菌【.n—j?)届c【群沙门苗哉俐 于1995年b月4lJ^婴儿脓血便中分离出】株馈 苗,报告妊, 患儿男.1l1,冠患儿西愎泻3天,哗畏寒,拄搐, 恶心,呕吐,高热0q,脓血便,诊断为菌痢^院便常 规检查:外观为豫盟镜梭:Rf【,加,30/HP;WBC ?,40HP.血岸规噎查:WB(:11<10'几,I0.9n. N0.10.便培养至胡安沙门苗,l束见其它病原苗生 长.采用氟哌酸和废赶霉素冶疗,1厨后痊愈出院. 培养持性:将脓丑便接种于ss培养基,麦康凯培 养基,经36c?小时碧养,均为纯培养ss平扳上菌落 呈圆型,凸起光滑-硅润,边缘整齐,半透明,中心略带 黑色中等大小;麦康凯上菌落呈半透明,湿满,中等大 小.细苗形态均为革兰阴性短杆菌 生化反应:【)一F试验为F型触酶阳性,氧化酶硐 性.苯丙氨酸,氰化钶.葡萄糖酸盐,乳糖,蔗糖,恻垒盏 花醇,尿素,水杨索,阿二酸盐,明胶试验,靛基质,醋酸 中国嘉嘉差籍蔷嚣翟}翟誊市第凡民医院'姜秀喜 盐精氨酸,ONPG,VP试验均为阴性反应.山梨醇,枸 蟓酸盐,麦芽糖,甘露薛,阿拉伯糖,硫化氢,硝酸盐还 原试验,卫矛醇,鸟氨酸,帻氨酸,葡萄糖,肌醇,鼠李 糖,蕈糖,术糖均为阳性,并有动力. 噬菌体试验:用江西省卫生防疫站晒杆菌科分属 噬菌体做裂解试验,被O?1噬菌体完全裂解.符台抄门 菌特性 血清学鉴定:玻片凝集试验采用卫生部兰州生物 制品研究所生产沙门菌属谚断血清:本苗与AF群. 多f『『血清凝集阳性,0因子血清6,7呈颗粒性明显凝 集,其它O因子血清均凝集:与鞭毛H抗原第1相 n,与第2相l,5均明显凝集,盐水对照为阴性根据沙 川_菌的抗原式定为圣胡安抄门菌经送检国家沙门菌 专业实验室报告鉴定为圣胡安沙门菌.抗原式为6.7: a:1,5.硷定号为SJKS95717 经查阅国内外文献,圣胡安沙门菌曾从猪便中分 离.本病例迁明该菌可导致婴幼儿典型脓血便型腹泻. (收稿:199512—19修回:19960202) (本文编辑:毛家都)