TaqMan探针技术原理
TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术,其核心是利用Taq酶的3′?5′外切核酸酶活性,切断探针,产生荧光信号。由于探针与
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是特异性结合,所以荧光信号的强弱就代
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了模板的数量。
在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中,包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合,其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter, R),如FAM、VIC等,3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q),如TAMRA等。当探针完整的时候,报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收,仪器检测不到信号。随着PCR的进行,Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针,其3′?5′外切核酸酶活性就会将探针切断,报告基团远离淬灭基团,其能量不能被吸收,即产生荧光信号(图4)。所以,每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。
图4 TaqMan探针的荧光信号产生机制
TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种:普通的TaqMan探针和TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher),本身不产生荧光,可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团(图5),可以将探针的Tm值提高10?C左右。因此为了获得同样的Tm值,MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短,既降低了合成成本,也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下,短的探针比长的更容易设计。实验证明,TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。
图5 TaqMan MGB探针