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人参皂苷溶血及抗溶血作用研究.doc

人参皂苷溶血及抗溶血作用研究

叶豫行
2017-08-31 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《人参皂苷溶血及抗溶血作用研究doc》,可适用于领域

人参皂苷溶血及抗溶血作用研究人参皂苷溶血及抗溶血作用研究程大任,付锐,窦德强,康廷国(辽宁中医药大学药学院,辽宁大连)摘要目的:通过对几种单体人参皂苷溶血,抗溶血作用进行研究,得到人参皂苷浓度与溶血度间的关系曲线,探讨其作用规律方法:不同浓度的单体人参皂苷溶液和相同浓度的兔血红细胞悬浊液组成的混合溶液充分作用后,用比色法测定溶血度不同浓度的单体人参皂苷溶液与相同浓度的对照皂苷溶液混合后加入相同浓度的兔血红细胞悬浊液,三者组成的混合溶液充分作用后,用比色法测定溶血度并计算保护溶血百分数通过数理统计软件对数据进行分析并拟合人参皂苷溶血或保护溶血作用的曲线结果:在测定的人参皂苷各单体中分别或兼具有溶血和抗溶血的特性,且溶血和抗溶血能力各不相同结论:原人参皂苷三醇型人参皂苷Re,Rg,O(R)一Rg,(S)一Rg和Rh都具有抗溶血作用,其中(R)一Rg:,(S)一Rg:和R}l在较高浓度时还表现出溶血作用原人参皂苷二醇型人参皂苷Rb,Rb,Re和Rd均表现出抗溶血作用,其中Rd还在浓度较高时表现出了溶血作用齐墩果酸型人参皂苷Ro在较低浓度便表现出抗溶血作用,未见溶血作用关键词人参皂苷溶血抗溶血溶血度比色法人参皂苷具有复杂多样的药理活性,为突出各个单体皂苷的药理作用,目前对人参皂苷的研究和应用主要集中在单体皂苷的开发和利用方面溶血是皂苷的特性之一,成为单体皂苷作为注射剂使用时的最大障碍j皂苷可与血红细胞壁上的胆甾醇结合生成不溶性分子复合物沉淀,造成血红细胞正常渗透性被破坏而发生崩解j人参总皂苷并没有明显的溶血作用J,但经分离纯化后的单体皂苷却分别具有截然相反的溶血和抗溶血作用,而且其溶血和抗溶血作用的强弱和浓度之间存在着近似的曲线关系世纪年代日本学者难波恒雄通过体外溶血实验对种单体皂苷的溶血活性进行了测定,奠定了实验基础J由于测定溶血度方法很多J,本文首先对溶血实验有影响的几个因素进行考查,建立最优的溶血实验方法,并用此方法对种单体人参皂苷进行溶血,抗溶血作用测定,其中抗溶血活性测定使用文献的有强溶血作用的Saponin作为对照皂苷数据经统计软件处理并拟合得到皂苷浓度和相应溶血或抗溶血作用的关系曲线仪器和材料仪器SartoriusCPD型精密天平,离心沉淀机,Matrix移液器,UNICOUV一紫外分光光度计,uV一HITACHI动物家兔,购于沈阳药科大学动物室试剂蒸馏水,医用生理盐水,无菌PBS磷酸缓冲盐溶液(自制),人参皂苷样品(自制),Saponin(SIGMA公司,$)方法与结果J无菌PBS磷酸缓冲盐溶液配制在mL浓度为的NaC溶液中加入mL浓度为molL的NailPO溶液和mL浓度为molL的NaHPO溶液,在bfin(×Pa)高压下蒸气灭菌min红细胞悬浊液的配制家兔耳缘静脉取血,置烧杯中,用缠有少量脱脂棉的玻璃棒轻轻搅拌,去除血液中的纤维蛋白以防止凝血,然后将血移入刻度离心管中,加入适量PBS磷酸缓冲盐溶液,混匀后离心min(rmin),弃去上清液以此方法重复清洗,次,至上清液呈无色透明,读取充分沉降在底部的红细胞体积,用PBS磷酸缓冲盐溶液为溶剂按体积比配制成浓度为的红细胞悬浊液,用于实验通讯作者窦德强,Email:doudeqiangyahoocorncrtSNOe酗血红素溶液最大吸收波长的测定取兔血红细胞悬浊液mL,加入mL蒸馏水振摇使充分溶血,离心min(rmin)后取上清液,uV一(nm)作紫外光谱,溶血作用所释放出的血红素溶液的紫外扫描图谱见图,结果显示其在nm处有最大吸收,为适合本实验的检测波长厂,一,,f,nt图血红素溶液紫外扫描图谱吡啶含量对溶血实验的影响分别设定含吡啶浓度为,,,,的PBS磷酸缓冲盐溶液,分别取各浓度溶液mL,加入红细胞悬浊液mL,混合均匀,c【=水浴保温min,离心min(rmin)后取上清液,用各组含吡啶的PBS磷酸缓冲盐溶液作空白,紫外分光光度计nm处测定吸光度,结果依次为,,,,结果显示吡啶浓度低于对溶血实验结果无明显影响可使用浓度低于的吡啶溶液实现对水溶性差的单体人参皂苷的助溶作用对照皂苷(Saoonin)半数溶血量(In))的测定在组刻度离心管中分别加入不同浓度的Saponin溶液和的红细胞混悬液mL,使溶液终体积为mL,oC水浴保温min,离心min(OORbogC,iNOTCMrnfin)后取上清液,以不含皂苷的阴性实验组上清液为空白,紫外分光光度计nm测定吸光度以过量Saponin(浓度约为~gmL)造成全溶血的实验组吸光度值作为对照,Saponin浓度的对数值(gC)为横坐标,溶血百分数(A)为纵坐标,用统计软件Sigmaplot拟合对数浓度一溶血百分数曲线,洋由曲线计算标准皂苷HD,见图OOOllogC图Salmnin溶血作用曲线人参皂苷半数保护量(P蛐)的测定在刻度离心管中加入不同浓度有抗溶血作用的人参皂苷溶液和一定浓度的Saponin溶液(反应液中Saponin的浓度为其HD,即gmL),再加入的红细胞悬浊液mL,混匀后使者体积之和为mLoC保温min,离心min(rmin),取上清液,以不含皂苷的阴性实验组上清液为空白,紫外分光光度计nm测定吸光度以加入保护皂苷浓度为零的实验组吸光度为对照,保护皂苷浓度(c)或其浓度的对数值(ogC)为横坐标,抗溶血百分数(记为PA,PA=一A)为纵坐标,用统计软件Sigmaplot拟合浓度(或对数浓度)一抗溶血百分数曲线,并由曲线计算P,见图,表Relgc加加O,加柏O岛H加加O,董(S)一R勃RglRO图几种皂苷抗溶血作用曲线图o(R卜R岛SNOTCM簿加加lu奄如噼加lu$加柏加IIaal,I加加luO加柏加鲁加皇星加加II,C人参皂苷半数溶血量(iD蚋)的测定在刻度离心管中加入不同浓度有溶血作用的人参皂苷溶液和的红细胞悬浊液mL,混匀后使体积之和为mLoC保温min,离心min(rrain),取上清液,以不含皂苷的阴性实验组上清液为空白,紫外分光光度计nm处测定(s)一RgnlogC吸光度以过量Saponin(浓度约为~gmL)造成全溶血的吸光度值为对照,溶血皂苷浓度对数值(ogC)为横坐标,溶血百分数(A)为纵坐标,用统计软件Sigmaplot拟合对数浓度一溶血百分数曲线,并由曲线计算HD,见图,表芒,踟()oORhogC(R)一RglogC图几种皂苷溶血作用曲线图表种人参皂苷抗溶血,溶血作用半数值gmL注:为本实验达到的最高浓度讨论和总结由于对溶血实验操作报道的文献较多,方法不SNOM尽相同,因此我们首先就其不同的方法以及可能会对结果产生影响的条件进行了考察在溶血度测定方法条件优选实验中设置不同对照组,分别对比了动,静脉取血,血细胞悬浊液配制的浓度,PBS磷酸缓冲盐溶液或生理盐水作为溶剂,保温时间长短,紫外检测波长nm和nm,吡啶浓度等条件对实验结果的影响,结果显示,动脉或静脉血用于实验对溶血结果没有明显影响,证明相同浓度的动脉或静脉血红细胞悬浊液充分溶血后所释放的血红素溶液吸光度无明显差异,所以可采用易于操作的静脉取血浓度配制为的红细胞悬浊液较浓度为的悬浊液平行实验中显示具有较好的重现性,这可能与血细胞沉降速度或操作误差有一定的关系,因此本实验选用浓度为的红细胞溶液红细胞在PBS磷酸缓冲盐溶液中保存比在生理盐水柏加lu中稳定,可以保持较长时间不破裂,而且PBS磷酸缓冲盐溶液可以对某些皂苷溶液造成的pH值改变起到一定的缓冲作用,因此选用前者作为溶剂为宜保温min反应已经完全,h内结果比较稳定,h以上血细胞开始大面积破裂,所以选择较为稳定的反应时间段内取出进行测量以防止由此产生的非皂苷浓度影响引起的误差本实验测得血红素溶液在紫外nm和nm处分别有强吸收,本实验红细胞浓度所产生的全溶血在nm处测得的吸光度数值处于紫外分光光度计测量稳定范围内(吸光度A小于),因此选择nm检测为宜虽然总皂苷水溶性较好,人参皂苷单体水溶性却各不相同为了更好地研究单体皂苷的溶血以及抗溶血作用,需要在配制水溶性较差的人参皂苷单体溶液里加入适量吡啶助溶由实验结果显示,溶液中吡啶浓度控制在以内,不会对溶血度测定产生明显的影响Saponin被认为是具有强溶血作用的混合皂苷,在本实验中作为对照皂苷由于曲线上通过HD或P所对应点的切线斜率最大,即皂苷浓度在HD或P如附近变化时对溶血结果影响最大,故选取半数浓度作为皂苷溶血或抗溶血作用强弱的指标我们将Saponin半数溶血浓度所产生溶血的效果设定为其他人参皂苷溶血或抗溶血作用测定时溶血或抗溶血的上限值,即溶血或抗溶血作用的最大值等于对照皂苷HD浓度造成的溶血度值由于此上限值随着操作误差大小变化较灵敏,可通过准确把握这个标准值来确保对实验操作准确性的监测两种截然相反的作用结果用同一标准作对照表示出来,这使得单体人参皂苷溶血或抗溶血作用的强弱在数值上具有了一定的可比性实验数据用统计软件Sigmaplot进行处理,拟合出量效关系曲线,平行实验组的数据点均很好地落在拟合曲线上由此曲线可求出任意浓度值所对应的溶血度,这对于了解人参皂苷溶血活性规律是非常有帮助的几种人参皂苷的溶血作用和抗溶血作用曲线都具有相似的s形关系曲线,与文献报道的曲线近似J,提示人参皂苷的溶血和抗溶血作用机理相似或相同由此,我们便可以利用人参皂苷溶血和抗溶血作用的特点以及其量效关系,通过控制具有溶血作用的皂苷类注射剂中两类皂苷的比例来达到合理应用的目的匮圈参考文献孟勤,孙平,王陆黎,等人参,西洋参皂苷溶血作用的研究J白求恩医科大学,,():匡海学中药化学M北京:中国中医药出版社,oTsuneoNamba,MasaoYoshizaki,TsuyoshiTomimori,etaFundamentalStudiesontheEvaluationoftheCrudeDrugs(III):ChemicalandBiochemicalEvaluationofGinsengandRelatedCrudeDrugsJYakugakuzasshi,,():TNamba,MYoshizaki,TTomimofi,etaFundamentalStudiesontheEvaluationoftheCrudeDrugs(I):HemolyticanditsProtectiveActivityofGinsengSaponinsJPlantamedica,,:周燕文,何淑华,莫武宁中药注射剂溶血度测定的三种方法比较J中国中药杂志,,():韩立伟,李锦莲紫外分光光度法测定中草药注射液的溶血度J黑龙江医药科学,,():医药信息编辑部医药信息专辑M中药,天然药物研究技术指导原则,:徐叔云,卞如濂,陈修药理实验方法学M北京:人民卫生出版社(收稿日期)StudyontheHemolyticandAntihemolyticActionsofIndividualGinsenosidesChengDaren,FuRui,DouDeqiang,KangTingguo(CollegeofPharmacy,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,DalianLiaoning,China)AbstractObjective:Tostudythehemol~icandantihemolyticactivitiesofindividualginsenosidesthroughtheexperim~liDofhemolyticactivityorantihemolyticactivitymeasurementsMethods:Measuretheabsorbanceofseveralsamph,HwhichconsistofdifferentconcentrationofindividualginsenosidesanderythrocytesolutionsomealsocontainSaponin(SIGMA),setupthesimulationrelationshipcurvebetweentheconcentrationofindividualginsenosidesandthehemolyticactivityortheantihemolyticactivitybystatisticalsoftware,givehemolysis(HD)andantihemolysis(Pso)throughdataanalysisResults:Theindividualginsenosides(下转第页),~INOTCM|类药物,临床用药已有多年的历史,以安定为代表,此类药物与GABA受体ot亚单位结合,ot亚单位目前已知有种亚型(ot,一ot),分别掌管焦虑,镇静,惊厥,肌松等不同作用,含有不同亚型ot亚单位的寡聚体与苯二氮革类抗焦虑剂的结合缺乏选择性,且内在活性较大J,因而苯二氮革在具有抗焦虑活性的同时也具有嗜睡,肌松,成瘾等副作用,其在焦虑症治疗中的主导地位正逐渐被其他新型抗焦虑药剂所替代本研究采用种基本药理学实验研究新型抗焦虑药物TFSB在抗焦虑有效剂量范围(,mgkg)是否与地西泮相似,是否在抗焦虑的同时具有中枢抑制作用,影响肌肉协调能力和运动协调能力研究结果表明,地西泮组明显增加跌落率,表现出显着的肌松作用显着缩短戊巴比妥钠诱导的睡眠潜伏期,延长睡眠时问,表现…明显的中枢抑制作用TFSB各剂量组(,mgkg)对小鼠自发活动没有明显影响对小鼠肌肉协调能力和运动能力没有影响对戊巴比妥钠诱导的睡眠潜伏期和睡眠时间没有明显影响,无明显的中枢抑制作用综上所述,TFSB没有中枢抑制作用,有利于其抗焦虑作用的发挥,应用前景非常广阔匠盈参考文献张曦,李宏,侯茂君,等黄芩及其有效成分的药理研究进展J天津药学,,():JyhFeiLiao,WenYuanHung,ChiehFuChenAnxiolyticlikeeffectsofbaicaleinandbaicalinintheVogelconflicttestinmiceJEuropeanJouralofpharmacology,,:卫生部药政局新药(西药)临床前研究指导原则汇编SDunhamNW,MiyaTSANoteonasimpleApparatusforDetectingNeurologiicalDeficitinRatandMiceJPharmaceutAssoc,,:SaeedDM,WoolsWREffectofchronicallyadministeredmethylxanthinesonethanolinducedmotorincoordinationinmiceJLifeSci,,:ShimizuH,HiorseA,TatsunoT,etaAnewanxios~olectiveanxiolyticcandidateJPharmaco,,:BenavidesJ,PenyB,RuanoDComparativeautoradiographidistributionofcentral(benzodiazepines)mudulatorysitesubtypeswith,intermediateandlowaffinityforzolpidemandalpidemJBrainRes,,:(收稿日期)EffectsofTotalFlavonoidsofScuteHariaBaicalensisGeorgionCentralNervousSysteminMiceWangDandan,SongShuang,JiaoShendi,CuiXiaoyan,YangJingyu,WangJinhui,WuChunfu(ShenyangPharmaceuticalUniversity,ShenyangLiaoning,China)AbstractObjective:ToexplorewhetherTotalflavonoidsofScutellariabaicalensisGeorgi(TFSB)hascentralinhibitioneffectandinfluencemuscleandmotorcoordinationlikediazepam(clinicalcommonanxiolyticmedicine)Methods:Measuredbyusingspontaneousactivityexperiment,PentobarbitalsodiuminducedsleepingexperimentandmuscleandmotorcoordinationexperimentResults:TFSB(mgkg)producedneitherinfluenceonlatencytimeandsleepingtimeinducedbyPentobarbitalsodiumandspontaneousactivitynormuscleandmotorcoordination(norelaxingmuscle)ConclusionTFSBhasnoeffectofcentralinhibitionormuscleandmotorcoordinationKeywordsTotalflavonoidsofscutellariabaicalensisgeorgiCentralinhibitionSpontaneousactivityMusclecoordination(上接第页)measuredintheexperimenthavethepropertiesofhemolyticactivityandantihemolyticactivityrespectivelyorbothTheirabilitiesoftheirhemolysisorantihemolysisaredifferentfromeachotherConclusion:ProtopanaxtrioltypeginsenosideRg,一Reshowedantihemolyticactivity,whereas一(S)Rg,一(R)一RgandRhexhibitedbothactivitiesindifferentconcentrationProtopanaxodioltypeginsenosideRbl,一Rb,一RcandRdshowedantihemolyticactivity,howeverRdalsoshowedhemolyticactivityinahigherconcentrationsolutionOleamolicacidtypeginsenosideRoexhibitedantihemolyticactivityonlyKeywordsGinsenosidesHemolyticactivityAntihemolyticactivityHemolysisdegreeColorimetryMNOTCM

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