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细胞室无菌技术标准操作规程.doc

细胞室无菌技术标准操作规程

王儒雅
2019-06-17 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《细胞室无菌技术标准操作规程doc》,可适用于医药卫生领域

细胞室无菌技术标准操作规程一、无菌室的灭菌定期打扫无菌室:每周打扫一次,先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等,然后用‰来苏尔或者新洁尔灭或者过氧乙酸擦拭。超净台上滤网需每月清洗次。CO孵箱(培养箱)灭菌:用酒精擦拭或者过氧乙酸,再用紫外灯照射。实验前灭菌:打开紫外灯、超净台各分钟。在开紫外灯杀菌前,应确认无菌室无人后方可开紫外灯杀菌。实验后灭菌:用酒精(‰新洁尔灭)擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。定期检测下列项目:钢瓶之CO压力CO培养箱之CO浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水,每周更换)无菌操作台内之气流压力,定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜,预滤网(小时预滤网,小时HEPA)。水槽可添加消毒剂(Zephrin:),定期更换水槽的水。二、实验人员的无菌准备肥皂洗手穿好隔离衣,放好拖鞋用酒精棉球擦净双手三、无菌操作的要点凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用酒精擦拭瓶子的外表面靠近酒精灯火焰操作器皿使用前必须过火灭菌继续使用的器皿(如瓶盖、滴管)要放在高处,使用时仍要过火各种操作要靠近酒精灯,动作要轻、准确,不能乱碰。如吸管不能碰到废液吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管,防止交叉污染。细胞传代培养(消化法)标准操作规程一、原理细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以,而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。二、材料和试剂无菌磷酸生理缓冲液(PBS)胰酶EDTA溶液(胰酶mMEDTANa):以ml分装于ml无菌离心管中,保存于–℃,使用前放在℃水槽回温。新鲜培养基无菌吸管离心管培养瓶三、操作步骤传代前准备()预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入℃水浴锅内预热。()用酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。()正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。()点燃酒精灯:注意火焰不能太小。()准备好将要使用的消毒后的空培养瓶。()取出预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。()从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。()打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。胰蛋白酶消化()加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以盖住细胞最好,最佳消化温度是℃。()显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。()吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液,注意更换吸管,加入新鲜的培养液。吹打分散细胞()吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。()吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入ml离心管中。()平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以转分钟离心分钟。()弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。分装稀释细胞()显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量,必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于×ml。最后要做好标记。()分装:将细胞悬液吸出分装至~个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。()继续培养:用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO培养箱中继续培养。传代细胞小时后开始贴附在瓶壁上。悬浮型细胞的传代()吸出细胞培养液,放入离心管中,离心rpm分钟。()吸掉上清液,加入适量之新鲜培养基,混和均匀后,依稀释比例转移至新的培养瓶中,以正常培养条件培养。

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