细胞室无菌技术
标准
excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载
操作规程
一、无菌室的灭菌
1. 定期打扫无菌室:每周打扫一次,先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等,然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5%过氧乙酸擦拭。超净台上滤网需每月清洗1次。
2. CO2孵箱(培养箱)灭菌:用75%酒精擦拭或者0.5%过氧乙酸,再用紫外灯照射。
3. 实验前灭菌:打开紫外灯、超净台各20-30分钟。在开紫外灯杀菌前,应确认无菌室无人后方可开紫外灯杀菌。
4. 实验后灭菌:用75%酒精(3‰新洁尔灭)擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。
5.定期检测下列项目:钢瓶之CO2压力;CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水,每周更换);无菌操作台内之气流压力,定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜,预滤网(300小时/预滤网,3000小时/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750),定期更换水槽的水。
二、实验人员的无菌准备
1. 肥皂洗手;
2. 穿好隔离衣,放好拖鞋;
3. 用75%酒精棉球擦净双手;
三、无菌操作的要点
1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外
表
关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf
面;
2.靠近酒精灯火焰操作;
3.器皿使用前必须过火灭菌;
4.继续使用的器皿(如瓶盖、滴管)要放在高处,使用时仍要过火;
5.各种操作要靠近酒精灯,动作要轻、准确,不能乱碰。如吸管不能碰到废液
1
6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管,防止交叉污染。
细胞传代培养(消化法)标准操作规程
一、原理
细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以,而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
二、材料和试剂
1. 无菌磷酸生理缓冲液(PBS)
2. 胰酶-EDTA溶液(0.05%胰酶-0.53mM EDTA-4Na): 以10ml分装于15 ml无菌离心管中,保存于–20℃,使用前放在37℃水槽回温。
3. 新鲜培养基
4. 无菌吸管/离心管/培养瓶
三、操作步骤
1. 传代前准备
(1)预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
(2)用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
(3)正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。
(4)点燃酒精灯:注意火焰不能太小。
(5)准备好将要使用的消毒后的空培养瓶。
(6)取出预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
(7)从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。
(8)打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。
2. 胰蛋白酶消化
(1)加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以盖住细胞最好,最佳消化温度是37℃。
(2)显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。
(3)吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液,注意更换吸管,加入新鲜的培养液。
3. 吹打分散细胞
(1)吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
(2)吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。
(3)平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心6-8
分钟。
(4)弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
4. 分装稀释细胞
(1)显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量,必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。
(2)分装:将细胞悬液吸出分装至2~3个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。
(3)继续培养:用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。
5. 悬浮型细胞的传代
(1)吸出细胞培养液,放入离心管中,离心1000 rpm 5 分钟。
(2)吸掉上清液,加入适量之新鲜培养基,混和均匀后,依稀释比例转移至新的培养瓶中,以正常培养条件培养。
浙公网安备 33021202002483