两种鼠蚤在新羽化和吸血后不同时间三种酶的组织化学研究_cropped

两种鼠蚤在新羽化和吸血后不同时间三种酶的组织化学研究_cropped () 昆 虫 学 报 Acta Entomologica Sinica , August 2004 , 47 4: 444 - 448 ISSN 045426296 两种鼠蚤在新羽化和吸血后不同时间 三种酶的组织化学研究 寻 慧 , 漆一鸣 ( )贵阳医学院生物学教研室 , 贵阳 550004 ( ) ( ) 摘要 : 采用组织化学技术 ,研究了不等单蚤 Monopsyllus anisus Rothschild和缓慢细蚤 Leptopsylla segnis Schönherr新羽化和吸血 后 24 h 、48 h 和 72 h 碱性磷酸酶 、酸性磷酸酶和三磷酸腺苷酶的分布和活性 。显微摄影及定量图像分析结果显示 :新羽化蚤碱 性和酸性磷酸酶主要存在于中肠 、神经细胞核 、精子束头部 、精巢附腺 、射精管 、输卵管和受精囊附腺中 ; 三磷酸腺苷酶各组织 中均有分布 。吸血消化后 ,两种蚤中肠 3 种酶活性均有增强 ;除碱性磷酸酶在消化 72 h 后酶活性有所下降外 ,其余不同消化 时间酶活性增强程度上不存在显著差异 。两种蚤卵母细胞发育成熟过程中 3 种酶活性亦见增强 。 关键词 : 不等单蚤 ;缓慢细蚤 ;成熟过程 ;酶 ;组织化学 () 中图分类号 : Q966 文献标识码 : A 文章编号 : 045426296 20040420444205 Histochemistry of three enzymes in ne wly emerged and engorged a dults of rat flea s Monopsyll us a nis us ( Rothschil d) and L eptopsylla segnis ( Schönherr) ()XUN Hui , QI Yi2Ming Department of Biology , Guiyang Medical College , Guiyang 550004 , China ( ) ( ) Abstract : The distribution and activity of alkaline phosphatase AKP, acid phosphatase ACPand adenosine ( ) ( ) triphosphatase ATPase in newly emerged and engorged adults of Monopsyllus anisus Rothschildand Leptopsylla ( ) segnis Schönherr were studied with histochemistry techniques and image analysis of microscope photographs. The () () results indicated that in newly emerged adults , alkaline phosphatase AKPand acid phosphatase ACPwere mainly distributed in midgut , nerve nucleus , testis , ejaculatory duct , oviduct and spermathecal gland , while adenosine () triphosphatase ATPasewas distributed in all tissues. After blood ingestion and digestion , the activity of three enzymes () increased in midguts. In engorged adults , except that the activity of alkaline phosphatase AKPdecreased 72 hours after blood ingestion , there was no significant difference in the increasing degree of the activity of the three enzymes in other time after blood ingestion. The activity of the three enzymes also increased during growing up of oocytes. Key words : Monopsyllus anisus ; Leptopsylla segnis ; mature process ; enzyme ; histochemistry ( ) ( 道 ,国 内 见 漆 一 鸣 1984 、寻 慧 和 漆 一 鸣 2002 , 蚤类是传播鼠疫和鼠源性斑疹伤寒等自然疫源 ) () 性疾 病 的 主 要 媒 介 。不 等 单 蚤 Monopsyllus anisus2004关于糖原及 PAS periodic acid2Schiff阳性物质 、 ( ) ( ) Rothschild和缓慢细蚤 Leptopsylla segnis Schönherr蛋白质的相关研究 ,而媒介昆虫组织化学的研究对 分属于蚤目的角叶蚤科和细蚤科 ,繁殖能力强 ,具有 了解其生理 、病理和传病机制都是重要的基础性资 一定代表性 。其中不等单蚤是滇粤闽黄胸鼠鼠疫疫 料 。我们应用组织化学方法观察了两种蚤在吸血消 ( 源地仅次于印鼠客蚤的主要传播媒介 刘云鹏等 , ) 化成熟过程中 3 种酶分布和活性的变化情况 。 2000,并可能对鼠疫杆菌保存越冬起一定作用 ; 缓 慢细蚤体内多次分离出鼠疫杆菌 ,是重要的染疫蚤 , 均有一定的流行病学意义 。蚤类组织化学研究国外 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 ( ) ( ) 仅见 Bai 1972和 Shchedrin 等 1975 , 1978几 篇 报 111 实验蚤种 ()基金项目 : 国家自然科学基金项目 39860015 作者简介 : 寻慧 ,女 ,1976 年 11 月生 ,湖南长沙人 ,硕士 ,讲师 ,研究方向为医学昆虫 , E2mail : pengchi1115 @1631com 收稿日期 Received : 2003210216 ; 接受日期 Accepted : 2004201220 2000 年 7 , 10 月 自 贵 阳 市 区 褐 家 鼠 大 ,表明标本着色越深 。用 t 检验作统计学处理 ,并 Rattus ( ) norvegicus Berkenhout , 1769 、黑 线 姬 鼠 Apodemus 将上述标本置于 Olympus PM210AD 显微摄影装置下 ( ) 拍照 。 agrarius Pallas , 1771 和 小 家 鼠 Mus musculus () Linneaus ,1758体上采集缓慢细蚤 , 褐家鼠体上采 () 集不等单蚤 。参考漆一鸣 1984方法以小白鼠为宿 2 结果 主对采集到的活蚤进行实验室饲养 、繁殖 。帅虫饲 料由过 20 目筛的锯末面 100 g 、猪干血粉 40 g 和干 211 碱性磷酸酶 酵母粉 10 g 混匀组成 。 21111 新羽化蚤 : 两种蚤碱性磷酸酶主要存在于 ( 中肠 、神经细胞核 、精子束头部 、精巢附腺 图版 ?: 112 标本获取和组织化学制片方法 ) 取帅虫饲料过 20 目筛筛取蚤茧 ,置于干净试管 1、输卵管 、受精囊附腺和射精管内 。中肠肠黏膜呈内 ,5,7 天后孵出未吸血新羽化蚤以备制片 。取新 黑色线状阳性反应 。马氏管 、食物团在阳性染色和 对照中均有着色 。 羽化蚤放于小白鼠体上充分吸血 48 h 后取出 ,待其 21112 吸血消化后 : 消化 24 h 后中肠肠黏膜呈黑消化 24 h 、48 h 、72 h 后分批取出制片 。 ( ) 组织化学方法采用 Gomori2Takamatsu 氏钙2钴法 色片状阳性反应 ,其酶活性明显增加 图版 ?: 2, () 杜卓民 , 1998显示碱性 磷 酸 酶 , 酶 活 性 部 位 显 黑 尤其以中肠肠壁分泌细胞和面向肠腔的微绒毛处着 色最深 。消化 72 h 后 ,可见中肠酶分布区域明显减 色 ,对照不 加 底 物 甘 油 磷 酸 钠 ; Gomori 氏 硝 酸 铅 法 ( ) () Culling ,1982显示酸性磷酸酶 ,酶活性部位显棕褐 小 ,酶活性开始下降 图版 ?: 3。 ( 色 ,对照 加 酶 抑 制 剂 氟 化 钠 或 不 加 底 物 ; Wachstein 新羽化雌蚤未分化卵原细胞酶活性为阴性 图 ( ) ) 和 Meisel 氏镁激活的硝酸铅法 Culling ,1982显示三 版?: 4;吸血消化后 ,两种蚤卵母细胞胞浆呈浅灰 磷酸腺苷酶 ,酶活性部位显棕色 ,对照不加三磷酸腺 色 ,其酶活性有所增强 。不等单蚤尚见滤泡上皮与 苷钠盐 。 卵 母 细 胞 之 间 的 薄 层 呈 黑 色 , 有 活 跃 的 酶 活 性 (( ) 图版?: 3; 而 缓 慢 细 蚤 此 现 象 不 明 显 图 版 ?: 113 图像分析和显微摄影 ) (将切片标本置于全自动图像分析仪 Mias 97 图 5。雄蚤精子束在吸血前后酶活性没有显著变化 。 ) 像扫描系统中 ,各组测定 10,13 个样本 ,测定其帄 图像分析与灰度 t 检验表明 ,新羽化蚤与吸血 () () 成蚤的中肠碱性磷酸酶活性差异显著 表 1。 均黑度值 ,以灰度等级 0,255 级自动记录 。帄均 黑度值指单位面积样本的黑度大小 ,帄均黑度值越 表 1 两种蚤中肠碱性磷酸酶酶活性平均黑度水平 Ta ble 1 Grouped average black level of the activity of alkaline phosphatase in midguts of Monopsyll us a nis us and L eptopsylla segnis 不等单蚤 M . 缓慢细蚤 L . anisus segnis ? ? ? ? 新羽化 Newly emerged 109175 ?8109 110114 ?1313 108131 ?11127 108126 ?12109 吸血后 After blood ingestion 333324 h 134103 ?6100 137163 ?11116 141186 ?7109 139149 ?10120 333348 h 135141 ?10132 137136 ?8176 140159 ?11192 140169 ?15129 3 ?A3 ?3 ??A3 ?A124117 ?11106 126164 ?8163 129179 ?10108 127111 ?10164 72 h ( ) ( ) 3 新羽化与吸血后不同消化时间相比差异达极显著水帄 P < 0101Significant difference between the newly emerged and engorged adults P < 0101; ??? ( ) 消化 24 h 与 48 h 、72 h 相比差异显著 P < 0105 , P < 0101Significant difference between engorged adults of 24 h after blood ingestion and that of 48 h ?? ( ) and 72 h after blood ingestion P < 0105 , P < 0101; A ( ) 消化 48 h 与 72 h 相比差异显著 P < 0105Significant difference between engorged adults of 48 h after blood ingestion and that of 72 h after blood ingestion ( ) P < 0105. 和对照中均有着色 。 212 酸性磷酸酶 21211 新羽化蚤 : 两种蚤酸性磷酸酶主要存在于 21212 吸血消化后 : 两种蚤均见中肠酶活性明显 ( ) 中肠 、神经细胞核 图版?: 6、受精囊附腺 、精巢及 增 强 , 特 别 是 面 向 肠 腔 的 微 绒 毛 处 着 色 最 深 () 其附腺和射精管等部位 。不等单蚤尚见存在于唾液 不同消化时间酶活性增强程度上不存,图版 ?: 7 446 昆虫学报 Acta Entomologica Sinica 47 卷 新羽 化 蚤 未 分 化 卵 原 细 胞 酶 活 性 为 阴 性 束酶活性在吸血前后没有明显改变 。 () 图版 ?: 8;吸血 后 卵 原 细 胞 逐 渐 发 育 , 胞 浆 内 呈 t 检验表明 ,新羽化蚤与吸血 图像分析与灰度 现浅棕色 ,酶活性有所增强 ,尤其以卵巢滤泡上皮的 成蚤的中肠酸性磷酸酶活性差异显著 , 不同消化时 () 酶活性最为活跃 图版 ?: 9 ,10。缓慢细蚤尚见卵 () 间酶活性不存在显著性差异 表 2。() 黄颗粒亦有较强的酶活性 图版 ?: 10。雄蚤精子 表 2 两种蚤中肠酸性磷酸酶活性平均黑度水平 Ta ble 2 Grouped average black level of the activity of acid phosphatase in midguts of Monopsyll us a nis us and L eptopsylla segnis 不等单蚤 M . 缓慢细蚤 L . anisus segnis ? ? ? ? 新羽化 Newly emerged 108157 ?10166 110125 ?11115 113127 ?8135 117195 ?10195 吸血后 After blood ingestion 333324 h 123122 ?12108 126151 ?8190 131111 ?12114 135122 ?9189 333348 h 124140 ?13187 126111 ?11140 128189 ?10146 133119 ?11156 3333125130 ?16107 124164 ?12149 128132 ?10176 134128 ?8171 72 h ( ) ( ) 3 新羽化与吸血后不同消化时间比较差异达极显著水帄 P < 0101Significant difference between the newly emerged and engorged adults P < 0101. ,雌雄亦未见明显差异 。唾液腺及其分泌物酶活 异 213 三磷酸腺苷酶 21311 新羽化蚤 : 两种蚤三磷酸腺苷酶广泛存在 性未见显著性差异 。卵原细胞吸血后逐渐发育成 于蚤体内各组织 ,以神经细胞 、精巢和射精管酶活性 熟 ,卵巢滤泡上皮和卵黄颗粒均出现较强的酶活性 () 较高 。对照片见唾液腺分泌物呈金黄色 ,而阳性染 图版 ?:14 ,15; 而雄蚤精子束在吸血前后酶活性 () 色呈棕褐色 图版 ?: 11 ,12。 没有明显变化 。 21312 吸血消化后 :两种蚤均见中肠酶活性明显增 图像分析与灰度 t 检验表明 ,新羽化蚤与吸血 ( ) 强 ,且中肠各层组织结构酶活性相同 图版 ?: 13。 成蚤的中肠三磷酸腺苷酶活性差异显著 , 不同消化 () 不同消化时间酶活性增强程度上不存在显著性差 时间酶活性不存在显著性差异 表 3。 表 3 两种蚤中肠三磷酸腺苷酶酶活性平均黑度水平 Ta ble 3 Grouped average black level of the activity of a denosine triphosphatase in midguts of Monopsyll us a nis us and L eptopsylla segnis 不等单蚤 M . 缓慢细蚤 L . anisus segnis ? ? ? ? 新羽化 Newly emerged 195 ?6182 80146 ?5170 79183 ?9105 81134 ?5182 81吸血后 After blood ingestion 33324 h 114139 ?11194 117150 ?10103 111177 ?14171 116197 ?9149 333348 h 108171 ?15136 113100 ?9104 110113 ?11189 112199 ?9150 3333106157 ?9187 107131 ?8174 109150 ?10154 111163 ?10139 72 h ( ) ( ) 3 新羽化与吸血后不同消化时间比较差异达极显著水帄 P < 0101Significant difference between the newly emerged and engorged adults P < 0101. 秃病蚤 Nosopsyllus laeviceps 、方形黄鼠蚤 Citellophilus tesquorum 、缓慢细蚤 L . segnis 、毛新蚤 Neopsylla setosa 3 讨论 和格氏栉眼蚤 Ctenophthalmus golovi 6 种蚤类的碱性 和酸性磷酸酶的研究表明 ,两种酶的分布情况与本 311 两种蚤磷酸酶的分布 实验结果基本一致 。 实验表明两种蚤碱性和酸性磷酸酶主要存在于 312 吸血后两种蚤中肠磷酸酶的变化中肠 、神经细胞核 、精子束头部 、精巢附腺 、射精管 、 昆虫中肠是消化食物和吸收养分的重要场所 ,输卵管和受精囊附腺中 ,碱性磷酸酶在滤泡上皮与 同时具有分泌消化酶和其他酶类的功能 。磷酸酯水 卵母细胞之间有活跃的酶反应 ,酸性磷酸酶活跃于 () 解酶 包括碱性磷酸酶和酸性磷酸酶主要作用是水 卵巢滤泡上皮中 ,三磷酸腺苷酶各组织中均有分布 。 解底物的磷酸根 ,与细胞正常生理活动中含磷蛋白( ) Shchedrin 等 1978对同型客蚤 Xenopsylla conf ormis 、 质 、脂肪和糖类的水解有关 。酶分布及活性与其功 ( )References 参 考 文 献 能相一致 ,因此缓慢细蚤和不等单蚤中肠含有大量 Bai MK , 19721 Studies on host2flea relationship : Part 1 —Histochemistry of 的磷酸酶 ,吸血后磷酸酶活性增加与其协助营养物 ( ) ( ) egg folk in Xenopsylla cheopis Rothsand Xenopsylla astia Roths. () 质吸收的生理功能是密切相关的 。李殿香等 1999() J . Med . Res . , 60 5: 752 - 7561 ( ) 研究棉铃虫 Helicoverpa armigera Hübner中肠组织 ( ) Culling FA Translated by Kong QL, 19821 Handbook of Histopathological and Histochemical Techniques. Beijing : Science Press. 326 - 3271 [ 卡 化学也发现碱性磷酸酶以绒毛膜处活性最高 ,我们 ( ) 林 孔庆雷译,19821 组织病理学与组织化学技术 手册 华为质量管理手册 下载焊接手册下载团建手册下载团建手册下载ld手册下载 . 北京 : 在两种蚤吸血后中肠微绒毛处也观察到较强的碱性 科学出版社. 326 - 327 磷酸酶活性 。三磷酸腺苷酶的生理功能主要是在消 Du ZM , 19981 Practical Histochemical Techniques. Beijing : People’s Medical Publishing House . 3211 [ 杜卓民 , 19981 实用组织学技术. 化吸收过程中 ,水解三磷酸腺苷中的高能磷酸键 ,释 北京 : 人民卫生出版社. 321 放能 量 供 给 各 种 生 理 活 动 需 要 。Friend 和 Smith Friend WG , Smith JJB , 19771 Factors affecting feeding by blood2sucking () 1977发现用于刺激蚤类吸血的一系列核苷酸类物 insects. Ann . Rev . Entomol . , 22 : 309 - 3311 质中 ,只有 ATP 化合物具有刺激吸食的效果 。在血 Li DX , Wu ZH , Zhang ZH , Zhao XF , Wang J X , 19991 Histochemistry of the enzymes from midgut of cotton bollworm Helicoverpa armigera 小板和红血球中均有高浓度的三磷酸腺苷存在 ,故 ( ) () Hübner. Entomol . Knowl . , 36 2: 78 - 801 [ 李殿香 , 吴中华 , 吸血后中肠三磷酸腺苷酶活性必然增强 ,以催化血 张志宏 ,赵小凡 , 王金星 ,19991 棉铃虫中肠几种酶的组织化学 食中 ATP 的水解供能 ,以发动如肌肉收缩和激素分 () 研究. 昆虫知识 , 36 2: 78 - 80 泌等生物学过程的进行 。 Liu YP , Tan JA , Shen EL , 20001 The Atlas of Plague and Its Environment in the People’s Republic of China . Beijing : Science Press. 72 - 731 () Shchedrin 等 1978在研究中发现 6 种蚤未吸血 [ 刘云鹏 , 谭见安 , 沈尔礼 ,20001 中华人民共和国鼠疫与环境 帅蚤的磷酸酶分布和酶活性与吸血成蚤一致 ,只有 图集. 北京 :科学出版社. 72 - 73 Qi YM , 19841 Fine structures of the reproductive system of three flea 环缩二亮氨酸氨基肽酶的酶活性比成蚤低 ,而本研 () species : development of male gonads. Acta Entomol . Sin . , 27 1: 究中两种吸血蚤消化道中肠碱性磷酸酶 、酸性磷酸 57 - 631 [ 漆一鸣 , 19841 三种蚤生殖系统发育的细微结构 : 雄 酶和三磷酸腺苷酶的酶活性均较未吸血的新羽化蚤 () 性生殖腺的发育. 昆虫学报 , 27 1: 57 - 63 强 。作者认为差异的产生可能与不同蚤种 、不同地 Qian CN , Zhang XX , Feng YM , 19871 Experimental formation of masses of 理株或不同生理状态有关 ,对此还有待进一步研究 。 plague bacilli in Citellophilus tesquorum altaicus of different () physiological ages. Endemic Diseases B ulletin , 2 2: 37 - 391 [ 钱存 蚤消化道前胃菌栓的形成是其传播鼠疫的特异 宁 ,张晓雪 ,冯玉明 ,19871 不同龄期方形黄鼠蚤阿尔泰亚种菌 ( ) 性机制 。钱存宁等 1987认为 : 新疆方形黄鼠蚤帅 () 栓形成试验. 地方病通报 , 2 2: 37 - 39 蚤和成蚤在菌栓形成率上的差异 ,除吸血量不同等 Shchedrin VI , Beier AP , Loktev NA , Akiev AK , 19751 Morphological and 生理差异外 ,消化道酶系的差异可能是其基本因素 。 ( ) histochemical changes in the flea X . cheopis Roths infected with () 本研究观察到两种吸血蚤 3 种消化道酶的酶活性均 plague bacilli . J . Med . Parasitol . , 44 1: 86 - 891 Shchedrin VI , Briukhanova LV , Lunina EA , 19781 A contribution to the 较未吸血新羽化蚤增强 ,消化道酶在新羽化蚤和吸 () histoenzymatical investigation of flea . J . Med . Parasitol . , 47 1: 89 血蚤确实存在差异 ,这种差异对不同龄期蚤菌栓的 - 911 形成有何影响 ,也尚待进一步研究 。 Xun H , Qi YM , 20021 Histochemistry study on mature process of two species of rat fleas ?: glycogen and PAS substance . J ournal of Guiyang 313 吸血后两种蚤雌性生殖系统酶活性的变化 () Medical College , 27 1: 1 - 31 [ 寻慧 ,漆一鸣 , 20021 两种鼠蚤成 不等单蚤和缓慢细蚤雌性的卵巢管均为无滋式 熟过程中组织化学研 究 ?: 糖 原 和 PAS 物 质. 贵 阳 医 学 院 学 卵巢管 ,营养物质的供给主要靠卵巢滤泡上皮细胞 。 () 报 , 27 1: 1 - 3 吸血后不等单蚤卵巢滤泡上皮细胞与卵母细胞之间Xun H , Qi YM , 20041 Histochemistry study on mature process of two species () of rat fleas ?: protein. Endemic Diseases B ulletin , 19 1: 5 - 71 [ 寻 具有较强的碱性磷酸酶活性 ,卵巢滤泡上皮细胞具 慧 ,漆一鸣 ,20041 两种鼠蚤成熟过程中组织化学研究 ?: 蛋白 有较高的酸性磷酸酶活性 ,很可能与其转运碳水化 () 质. 地方病通报 , 19 1: 5 - 7 合物进入卵细胞的功能相适应 ,从而保证卵黄发育 所需营养物质的供给 ; 同一消化时间的缓慢细蚤卵 巢滤泡上皮细胞主要见酸性磷酸酶活性 。雌性生殖 系统卵母细胞的发育成熟需要很高能量 ,而三磷酸 ()责任编辑 : 黄玲巧 腺苷酶可以水解 ATP 提供能量 , 因此 , 两种蚤吸血 ( )图版 ?说明 Explanation of Plate ? () () 1 - 51 碱性磷酸酶 AKP : 11 新羽化不等单蚤 M . anisus , the newly emerged , ?67 ×; 21 不等单蚤 M . anisus , 24 h , ?66 ×; 31 不等单蚤 M . () () () anisus ,72 h , ?50 ×; 41 新羽化不等单蚤 M . anisus , the newly emerged , ?100 ×; 51 缓慢细蚤 L . segnis ,24 h , ?50 ×. 6 - 101 酸性磷酸酶 ( ) ( ) ACP : 61 新羽化缓慢细蚤 L . segnis , the newly emerged , ?66 ×; 71 缓慢细蚤 L . segnis , 24 h , ?100 ×; 81 新羽化不等单蚤 M . anisus , the () () () newly emerged , ?100 ×9 : 不等单蚤 M . anisus , 24 h , ?50 ×; 101 缓慢细蚤 L . segnis , 24 h , ?50 ×; 11 - 151 三磷酸腺苷酶 ATPase :111 新 () ( ) 羽化不等单蚤 ,对照 M . anisus , the newly emerged ,CK , ?50 ×; 121 新羽化缓慢细蚤 L . segnis , the newly emerged , ?50 ×; 131 缓慢细蚤 L . () () () segnis , 24 h , ?50 ×; 141 不等单蚤 M . anisus , 24 h , ?50 ×; 151 缓慢细蚤 L . segnis , 24 h , ?50 ×. F : 前胃 Proventriculus ; M : 中肠 Midgut ; S : 唾液腺 Salivary gland ; Mu : 肌肉 Muscle ; N : 神经链 Nerve chain ; T : 睾丸 Testis ; O : 未分化卵母细胞 Undifferentiated oocyte ; I : 未成熟卵母细胞 Immature oocyte .