椰子溶磷脂酸酰基转移酶基因克隆及农杆菌介导甘蓝型油菜的遗传转化

椰子溶磷脂酸酰基转移酶基因克隆及农杆菌介导甘蓝型油菜的遗传转化 椰子溶磷脂酸酰基转移酶基因克隆及农杆 菌介导甘蓝型油菜的遗传转化 贵州农业科学2010,38(12):39,42 GuizhouAgriculturalSciences [文章编号]10013601(2010)120810—003904 椰子溶磷脂酸酰基转移酶基因克隆及 农杆菌介导甘蓝型油菜的遗传转化 沈奇,秦信蓉,田恩阔,孙克刚,杜才富 (贵州省油菜研究所,贵州贵阳550008) [摘要]月桂酸是在清洁用品和医药产品中有重要用途的中链脂肪酸.椰子中富含月桂酸特异的溶 磷脂酸酰基转移酶基因,克隆该基因在油菜中表达若可获得含月桂酸的油菜新种质,将具有良好的应用价 值.为获得脂肪酸成分改良的油菜种质资源,从椰子胚乳中克隆出该基因并构建35s驱动的植物表达载体, 通过农杆菌介导法转化油菜子叶柄,在获得的约20株的转化苗中已鉴定有6株转化植株. [关键词]椰子;溶磷脂酸酰基转移酶;甘蓝型油菜;遗传转化 [中图分类号]$565.4[文献标识码]A CloningofLyso—phosphatidicAcidAcyltransferase GeneinCoconutandGeneticTransformationinBrassicanapusby Agrobacterium—mediatedMethod SHENQi,QINXin—tong,TIANEnkuo,SUNKe—gang,DUCai—fu (GuizhouRapeInstitute,Guiyang,Guizhou550008,China) Abstract:Laura1acidisanimportantmedium—chainfattyacidincleaningsuppliesandpharmaeeuticaI products.CoconuthasabundantLyso— phosphatidicacidacv1transferase(LPAAT)geneswithexpression oflauralacid.NewrapegermplasmresourceswithLyso— phosphatidicacidacyltransferasegeneswillhave thegoodapplicationvalue.ThepaperreportsthatLyso— phosphatidicacidacyltransferasegeneiscloned fromcoconutendosperm,theplantexpressionvectorby35SdriveiSbuiltsuccessfully,and6r apeplants withLyso— phosphatidicacidacyltransferasegeneareselectedfrom20genetictransformationrapeplant sby agrobacterium—mediatedmethod. Keywords:coconut;Lyso— phosphatidicacidacyltransferase(LPAAT);Brassicanapus;genetic transformation 月桂酸(Lauralacid)是指脂肪酸碳链为12C的 饱和脂肪酸,属于中碳链脂肪酸(Medium—chainfat— tyacids),其具有氧化稳定性强,黏度小,表面张力 小,溶解性好等优越的理化性质,可广泛作为维生 素,杀菌剂,激素,抗生素,保存料,着色料等各种医 药产品及化妆品的溶剂,因此在清洁用品和医药产 品市场中具有较大需求量l1].常规油料作物,如油 菜储脂中脂肪酸碳链以16C,18C为主,基本不含 12C的月桂酸.目前,月桂酸主要是从椰子(Cocos nucifera)及油棕(Elaeisguineensis)等热带油料作 物中提取.由于资源有限使得月桂酸的供给远远不 能满足目前的市场需求口].研究发现,椰子中富含 月桂酸,主要是由于其含有月桂酸特异的溶磷脂酸 酰基转移酶(Lyso—phosphatidicacidacyltrans ferase,LPAAT).该酶可催化合成的月桂酰基进 入三酰甘油酯中sn一2位点形成种子储脂.油莱 种植广泛,种子含油量高,基因改良历史长,如能将 其作为月桂酸改良的受体植物,在其中表达月桂酸 特异的溶磷脂酸酰基转移酶基因,收获含有月桂酸 的种子油产品,其经济价值将是巨大的.因此,本研 究从椰子胚乳中克隆LPAAT基因,并通过农杆菌 介导法将其转化油菜,以期获得脂肪酸成分改良的 油菜种质资源. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1试验材料 1.1.1植物材料甘蓝型油菜D4315R由贵州省 油菜研究杜才富研究员提供.椰子购至中国海南. 1.1.2菌株和质粒大肠杆菌DH5a,农杆菌 EHA1O5,植物表达载体pBI121,pCAMBIA1304 由贵州省油菜研究所实验室保藏. 1.1.3酶和化学试剂植物总RNA提取试剂 TRhol购至Invitrogen公司.AMV反转录酶购至 BioFiux公司.PCR相关试剂,质粒小量提取试剂 盒及琼脂糖凝胶回收试剂盒购至天根生物.限制性 内切酶类,克隆载体pMD一19及T4链接酶购至 [收稿日期]2010—09—19;201011-15修回 [基金项目]国家支撑 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目"喀斯特山区油莱,大豆等油料作物新品种(组合)选 育关键技术研究与示范"(20()7BAD59B04);贵州省科 研机构创新能力建设项目"甘蓝型油菜强优势杂交种及新材料的创新能力建设 "[黔科合院所(2009)004];贵州省科学技术基 金项目"油菜多基因聚合的种质资源油脂含量多样性分析及高油分遗传群体的初 建"[黔科合J字(2010)2089] ),女,研究实习员,在读博士,从事油菜抗逆生理及基因工程[作者简介]沈奇(1983, 研究.Email:shenqigz1983@l63.com *通讯作者:杜才富.Email:caifudu@yahoo.corn.cn ? 4O?贵州农业科学 Takara公司.DEPC购至天根生物;其余试剂均为 国产或进口分析纯试剂. 1.1.4合成及测序PCR引物合成及测序由上海 捷瑞公司完成. 1.1.5菌及植物培养基LB培养基:酵母提取物: 10g/L;胰蛋白胨:5g/L;NaC1:10g/L;YEP培养基: 酵母提取物:10g/L;胰蛋白胨:10g/L;NaC1:5g/L; 油菜转化各阶段培养基:油菜种子萌发培养基: 1/2MS预培养基:MS+3mg/I6-BA+1mg/L2,4D; 共培养基:MS;脱菌培养基:MS+3mg/L6-BA+ 0.1mg/LNAA+50mg/LCef;筛选培养基:MS+ 3mg/I6-BA+0.1mg/LNAA+50mg/LCef+ 5mg/LHgy;生根培养基:1/2MS+50mg/LCef. 1.2试验方法 1.2.1目的基因克隆根据NCBI上登陆椰子溶 磷脂酸酰基转移酶基因(LA ppt 关于艾滋病ppt课件精益管理ppt下载地图下载ppt可编辑假如ppt教学课件下载triz基础知识ppt )序列(GenBank序 列号:U29657)设计引物,并在2条引物的5'端分别 添加SpeI酶切位点.引物序列为PrimerF(Bgl 1I):AGATCTGGGAAGTGGGGGATATAT— AGT;PrimerR(SpeI):ACTAGTG八AAC— CTATACTTATGAATTTGAcc.椰子胚乳总 RNA提取依据TRIzol操作说明进行,并以Olige (T)18为引物进行cDNA第一链的合成.反应体 系:1g总RNA力口入2Iolige(T)18,70?保温 5min;冰上冷却后,加入以下试剂:5L5×RT— buffer,1.5LdNTPMixture(10mM),0.5L RNaseInhibitor(40U/uL),1uLM—MIV(200U/ L),加DEPC水补足到25I.简单离心混匀后于 42?保温40min.以反转的cDNA为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 进行基 因PCR扩增.PCR扩增体系(25L):2.5L10× buffer,1"LdNTPMixture(10mM),1MLForward Primer(10uM),1uLReversePrimer(10M), 0.2"LTaq(5U/UL),1"LcDNA模板,ddH2O补 足25L.PCR扩增反应条件:步骤1:94?3min; 步骤2:94?30s;步骤3:62?30s;步骤4:72.C60s; 步骤2,4进行40个循环扩增;步骤5:72?7min. 反应产物经电泳检测后连入克隆载体pMD一19.连 接体系:solutionI:2.5L;pMD一19:0.5L;回收 片段:7L.l6?保温过夜.连接产物采用热激法 转化大肠杆菌感受态.转化菌涂布于LB+50mg/ L氨苄霉素的平板中,37?C培养16h后,挑取单克 隆经PCR确认后,进行序列测定.PCR扩增体系 及条件如上. 1.2.2植物表达载体的构建提取pMD-19一 LPAAT质粒及pCAMBIA1304载体质粒,经内切 酶BglII及Spe工酶切消化后,电泳回收目的片段. 酶切体系为:质粒DNA:16"L;10×Buffer:2/,L; Bgl?:1L;SpeI:1I;37uC保温过夜.回收的 LPAAT片段与pCAMBIA1304载体片段进行连接 反应.连接体系(10"L):10×LigationBuffer: 1/,I;T4DNALigase:1L;目的片段:7.5L;载体 DNA:0.5L.16.C保温过夜.连接产物采用热激 法转化大肠杆菌感受态.转化菌涂布于LB+ 50mg/I卡那霉素,37?培养16h后,挑取单克隆经 PCR检测及测序确认.确认后的菌株大量提取 pCAMBIA1304一FatB重组质粒(定名为pCL),采 用冻融法转入农杆菌EHA105中.转化菌涂布于 YEP+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平的平板 上,培养48h后,挑取单菌落进行PCR鉴定. 1.2.3油菜遗传转化油菜遗传转化采用农杆菌 介导转化法,转化的外植体为油菜子叶柄.含有目 的质粒的农杆菌菌液震荡培养到OD一0.4,0.5. 离心重新悬浮于10倍体积的MS液体培养基.从 6d苗龄油菜无菌苗上切取子叶柄,经3d预培养后 进行转化.菌液浸染的时间为子叶柄5min.浸染 后的油菜子叶柄经2d共培养,6d的脱菌培养后,转 接到筛选培养基上最终获得分化芽苗.筛选培养期 间每隔15d更换1次培养基.直至分化芽苗长到 1,2em高后,切下绿色芽进行生根培养.当根系 发达时,炼苗移栽至花盆中. 1.2.4转基因芽苗PCR检测经筛选获得的转 基因芽苗,取约0.05g叶片提取基因组DNA.油 菜基因组DNA提取采用CTAB法,提取的DNA 采用PCR扩增检测目的基因.检测引物(LPAAT 基因)为PrimerF:TCAGGCAGGGAAACTTG— TAT;PrimerR:CGTCAGCACCATTGGAACTA. 扩增体系如上.扩增体系(25L):2.5L10× buffer,0.5LdNTPMixture(10raM),0.5LFor— wardPrimer(10M),0.5LReversePrimer (10"M),0.2肚LTaq(5U/uL),约100ngcDNA模 板.扩增条件:步骤1:94oC3min;步骤2:94.C30s; 步骤3:58?30s;步骤4:72?30s;步骤2,4:30个 循环扩增;步骤5:72?5min. 2结果与分析 2.1目的基因克隆 以椰子胚乳cDNA为模板扩增椰子溶磷脂酸 酰基转移酶(LPAAT)基因,获得一条约900bp的 主条带及400bp左右的条带(图1).回收900bp的 条带,经测序比对,该序列编码开放阅读框927bp, 编码蛋白质309氨基酸.与GenBank(序列号: U29657)上登录的序列比对完全一致,可确认为 LAPPT的编码基因. 2000bp 1000bp 750bp 500bp 200bo 100bp 图1LAPPT基因PCR扩增电泳图 Fig.1PCRamplificationelectrophoretogramofLAPPTgene 第12期沈奇等椰子溶磷脂酸酰基转移酶基因克隆及农杆菌介导甘蓝型油菜的遗 传转化?41? 10000b0 Aj黜bbp. 2Ooo 1000bp 2000b0 e 嚣甓 200ob0 Cl 7 0 5 0 O 0 b b . p 500 250bp 100bp 图2pCL重组质粒构建图谱 Fig.2ThechartofpCIrecombinationplasmidconstruction M123456 4 注:A:pCAMBIA1304及pMD19一IAPPT基因SpeI酶切电泳图, 1,2为pCAMBIA1304双酶切条带;3,4为pMD19LAPPT双酶 切条带.M为Marker. B:pCF重组质粒检测,1,6为检测的不同单菌落.M为Marker. C:pCFL重组质粒农杆菌菌液PCR检测,1,5为pCF转化农杆 菌单克隆,","为ddH20,"+"为pMD19LAPPT质粒.M为 Marker. Note:A,RestrictionpatternofpCAMBIA1304andpMD19IAP PT;1,2,DoubleenzymedigestionstripofpCAMBIA1304;3,4, DoubleenzymedigestionstripofpMD19IAPPT.M,Marker. B:pCFrecombinantplasmiddetection,1,6:differentsinglebac terialcolony.M:Marker. C:PCRdetectionofagrobacteriumrhizogenessolutionwithpCF recombinantplasmid,1,5:monoclonalagrobacteriumrhizogenes, "一 " ,ddH2O,"+"pMD19一LAPPTplasmid,M:Marker. 图3pCL重组质粒构建过程 Fig.3TheprocessofpCLrecombinationplasmidcon struction 2.2植物表达载体的构建 pCL重组质粒构建图谱如图2.pMD一19-LAP— PT质粒及pCAMBIA1304载体质粒经Bgl1I及Spe I进行双酶切反应的电泳图见图3A.pCAM— BIA1304载体质粒经酶切获得约10000bp的载体 条带.pMD一19一IAPPT质粒酶切获得2000bp及 约1000bp条带,其中约1000bp为LAPPT的目的 条带.回收LAPPT目的条带及pCAMBIA1304 载体片段进行连接反应.转化及筛选大肠杆菌菌落 进行PCR验证见图3B.挑取的6个菌落中有5个 为含有pCAMBIA1304一LAPPT(定名为pCI)的阳 性菌落.挑选菌落1进行测序确认后,大量提取 pCL质粒,采用冻融法转入农杆菌EHA105中.挑 选转化的5个农杆菌菌株通过PCR验证,均含有 pCL重组质粒(图3C).挑选菌株5进行扩大培养, 用于油菜子叶柄的转化. 2.3油菜子叶柄的遗传转化 采用油菜无菌苗的子叶柄作为外植体进行油菜 注:M:Marker;1,6:转化pCI(35S:LAPPT)的阳性植株DNA 的PCR扩增 Note:M,Marker;l,6:PCRamplificationofpositiveplants transformedpCL(35S:IAPPT) 图4转pCL芽苗PCR鉴定 Fig.4PCRidentificationofseedlingswithtransformedpCI 的遗传转化.子叶柄通过切割,预培养,农杆菌浸 染,共培养,脱菌及筛选等过程,最终获得约2o株的 分化芽苗(见封3). 2.4转基因芽苗pCR检测 分别取转化芽苗的叶片提取DNA,进行PCR 检测.目前,有6株转化芽苗能够扩增到目的条带 (图4),初步可以确认为转pCF(35S:LAPPT)的油 菜芽苗. 3讨论 ,将聚合形 植物种子中储脂通过Kennedy途径 成的脂肪酰基链与结合3一磷酸甘油的骨架形成三 酰甘油的储脂形式.溶磷脂酸酸基转移酶(Iyso— phosphatidicacidacyltransferase,LPAAT)负责催 化3一磷酸甘油的sn2位点整合.].研究发现,常 规油料作物的LPAAT对不饱和脂肪酸的亲和性较 高.但在椰子等富含中碳链脂肪酸的物种中,其sn一 2位点具着较多月桂酸,表明椰子等作物中富含特 异催化月桂酸整合的LPAAT_5].该酶随后被 Knutzon等纯化,并克隆获得其cDNA,与中碳 链一ACP硫酯酶编码基因一起进行油菜转化研究. 本研究根据NCBI上登陆椰子溶磷脂酸酰基转移酶 基因(LAPPT)序列克隆该基因,并构建过表达载 体,进行油菜转化研究,以期获得含月桂酸的油菜新 种质,目前,有6株转化芽苗能够扩增到目的条带, 初步可以确认为转pCF(35S:IAPPT)的油菜芽苗, 进一步的分子验证及该基因转化对油菜脂肪成分影 响检测等工作将在下一步开展. [参考文献] chain r1]BMarten,MPfeuffer,JSchrezenmeir.Medium,triglycerides[J].InternationalDairyJourna,2006, 116:13741382. [2]TVoelker,AJ.Kinney.Variationsinthebiosynthe, sisofseedstoragelipidsEJ].Annurev.plantphysio1. ? 42?贵州农业科学 Plantmo1.boil,2001,52:335—361. KDehesh.Howcanwegeneticallyengineeroilseed cropstOproducehighlevelsofmedium—chainfatty acids?[J]Eur.J.LipidSci.Technol,2001,103:[6] 688—697. SNandi,SGangopadhyay,SGhosh.Productionof mediumchainglyceridesfromcoconutandpalmker— neifattyaciddistillatesbylipase—catalyzedreactions [J].EnzymeandMicrobialTechnology,2005,36:725— 728. DSKnutzon,KDLardizaba1.JSNelsen.eta1.Clo ningofaCoconutEndospermcDNAEncodinga1 七七弋七七七七七七七七七七七七七七弋七七七七七弋七七<--七<-- (上接第38页) 量171kg/667m.,比对照(油研10号)增产16.9; 在2005--2006年度贵州省油菜研究所内比较试验 中,平均产量175.7kg/667m,比对照(油研10号) 增产23.1.两年度试验结果表现一致性较好. 2.2.2区域试验中的表现在2006--2008年度 的贵州省油菜新品种区试中,该组合的平均产量为 168.51kg/667m,较对照(油研1O号为159.11kg/ 667m)平均增产5.91,平均比对照增产的点次占 75. 2.2.3生产试验中的表现在2O072008年度 贵州省油菜生产试验B组中的平均产量为 173.0kg/667m,较对照(油研10号)增产3.53 (表3),较对照增产的点次占5O. 表3宝油517在生产试验中的产量 Table3TheyieldofBaoyou517inproductiontests kg/667m. 2.3宝油517亲本田间鉴定结果 经贵州省种子管理总站组织贵州省农作物品种 审定委员会油料专业组的专家对宝油517杂交油菜 新组合及父母本进行的田间鉴定结果认为,该组合亲本来源系谱清楚:1)母本1528A.株叶型基本一 致,茎叶绿色,生长健壮,无明显病斑.田问调查:总 株数511株,不育株252株,可育株259株,不育株 率49.31;无异型株.专家组一致认为:性状基本 稳定一致,不育株率接近1:1的理论值,该隐性核 不育两型系基本稳定,建议扩繁过程中严格质量标 准,控制好亲本种子质量.2)父本17R.田间调查: 株叶型基本一致,茎叶绿色,生长健壮,无明显病斑, 总株数496株,异型株5株,异型株率1.01%.专 家组一致认为:性状基本一致,该恢复系基本稳定, 建议扩繁过程中严格质量标准,控制好亲本种子质 量. 3栽培技术要点 3.1种植时间 9月中旬育苗,1O月中,下旬移栽. 3.2种植密度 移栽种植密度为6000,8000株/667m.,直播 留苗10000,12000株/667m.. 3.3合理施肥 产量在150,200kg/667m,需施纯氮15kg/ 667m.以上;N:P2O5:K2O按1:0.5:0.9配合 施用.注意施用有机肥作底肥,追肥应注意苗重,薹 轻,花期看苗根外补施.追肥方式以尿素对清粪水 浇施最好.特别注意强调施用硼肥:硼砂0.5, 0.8kg/667m.作基肥沟施或对水(结合追肥)作追 肥;亦可用0.3硼砂水溶液在苗,薹,花期作根外 追肥,常年结实差的缺硼土壤,更应强调根外追肥的 应用. [参考文献] [1]杜才富,秦信蓉,高志宏.高油分双低杂交油菜绵新油 19的选育研究_J].贵州科学,2007,25(5):464—469. [2]杜才富,秦信蓉.高油分双低杂交油菜宝油85的选育 [J].贵州农业科学,2008,36(2):17—18. [3]侯国佐,杜才富,侯燕,等."三高两低"杂交油菜油 研1O号的选育_J].种子,2004,23(5):59—62. (责任编辑:杨晓容) ,一一一 一叽,,,,,,,,一一 ,,,,一,一一一一,一一一一一:耋,一一,,一一一一一一一 ]]] 345 [[[