脉冲场凝胶电泳与多基因聚类分析在铜绿假单胞菌株亲缘性研究中的应用

脉冲场凝胶电泳与多基因聚类 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 在铜绿假单胞菌株亲缘性研究中的应用 【】微生物检测方法 脉冲场凝胶电泳与多基因聚类分析在铜绿假单胞菌株亲缘性研究中的应用 ，，冯伟云许小敏毛联钢 ( ，315010)浙江省宁波市第二医院临床研究室浙江宁波 ,, :。:32 摘要目的了解分离自临床铜绿假单胞菌分子流行病学特性及菌株亲缘性方法对分离自临床的 株铜绿假单Kirby )Baue r ; 。:32 胞菌采用 法测定抗菌药物的敏感性利用脉冲场电泳和多耐药基因聚类分析菌株的亲缘性结果株铜 17 8 ，53, 1% ，8 ( 25% ) ，绿假单胞菌中有 株对 种以上抗生素耐药占 株铜绿假单胞菌对检测抗生素全部耐药为同一耐药 。，3 ; ，2 表型脉冲场电泳聚类分析显示铜绿假单胞菌主要为 个克隆株而多耐药基因聚类分析显示铜绿假单胞菌主要为 ，，3 。:，个簇群二个簇群内已发生衍化存在 个克隆传播结论分离自临床的铜绿假单胞菌耐药严重亲缘性分析中多基因 。聚类分析法分辨率高于脉冲场电泳 ,, ; ; ; 关键词铜绿假单胞菌脉冲场电泳多耐药基因聚类分析亲缘性分析 ,, R378, 99,, A,, 1004 ) 8685( 20110)5 ) 1175 ) 03中图分类号文献标识码文章编号 Application of pulsed field electophoesis and dug ) esistance gene typing on phyloge rrrr-netic analysis of pseudomonas earuginosa FENG Wei )yu n，XU Xiao )m in，MAO Lian )gan g ( Ningbo No, 2 Hospital，Ningbo 315010，China) ,Abstract, Objective: To investigate the characterization of molecular epidemiology and phylogenetic analysis of P, aeruginosa isolated from clinic, Methods: The antimicrobial susceptibility was detectebd y K )B tests; thPhe ylogenetic Analysis of P,ae ruginosa strain were performebdy pulsed field gel electrophoresis ( PFGE) and Drug) r esistance Gene typing, Results: 17 strains( 53, 1% ) werere sistant to atl east 8 different antibacterials in 32 strains isolated P, aeruginosa，8 strains among these were resistant to all 13 different antibacterials，as a resistancepatterns, P, aeruginosa isolated from clinic was identified principally 3 different clones by PFGE and 2 clusters but were derivatized into 3 different clones by Drug )r esistance Gene typing, Conclu- sion: The multidrug resistance in P, aeruginosa is a severeiss ue，drug )r esistance Gene typing had higher discriminatory power thanPFG E in studying on the hpylogenetic analysis of P, Xaeruginosa isolated from clinic, ,Key words, Pseudomonas aeruginosa; Pulsed field gel electrophoresis; Drug )r esistance Genet yping; Phylogenetic analysis ( Pseudomonasr uaeginosa，PAE) ，。铜绿假单胞是医院感染的聚类分析现报告如下，，、 重要病原菌特别是在免疫功能低下的病人常常导致肺炎,1,。，菌血症及尿路感染其感染在临床各科均有报道尤其在 1 材料与方法、ICU 。外科烧伤科及 病房可引起流行近年来由于抗菌药物 1, 1菌株来源 ，的滥用及广谱抗菌药物的大量使用出现了多重耐药铜绿假 32 PAE 2006 ) 2007 1 12 株 菌均分离自 年 月 年 月浙江宁。、单胞菌株快速有效的分型方法是确定病原菌流行病学及 。波市第二医院病人临床标本全部菌株均使用法国生物梅里，菌株亲缘性的重要手段常用的分子生物学分型方法包括脉 ( bioMerieux) VITEK ) 32 。埃公司细菌鉴定仪鉴定菌种 ( PFGE) 、PCR、冲场凝胶电泳随机引物 扩增片段长度多态性 1, 2PCR ( MLST、) 分析以及其他 相关的分型方法多基因聚类分析等试剂和仪器 ,2,。为了解我院烧伤病房分离的铜绿假单胞菌菌株的耐药 特 ABI960 PCR ; GNS ) 448 ABI 扩增仪为美国 公司产品药敏、，32 PAE 性分子流行病学特性及菌株亲缘性关系我们对 株 菌 ( : A171L) ，; 卡批号购自法国生物梅里埃公司药敏纸片均为( PFGE) 44 烧伤病房感染株进行了脉冲场凝胶电泳和 种 βOXOD ; 、PCR I美国 公司产品基因检测试剂盒靶基因 引物序 ) 、、、内酰胺酶基因氨基糖苷类耐药基因利福平磺胺耐药基 DNA 。列和阳性对照 由无锡市克隆遗传技术研究所提供 、、、因多种药物外排泵基因以及质粒转座子? 类整合子遗传 1, 3 实验方法。44 ，标记检测并以该 种基因为分子标记对检测结果作样本 1, 3, 1VITEK )3 2 GNS )44 8 )B K 药敏实验 法配套 及 法 。CLSI ( NCCLS)200 7测定抗菌药物的敏感性并根据美国 原 Spe ( 20U) 37? s，72? 5 min。PCR ，I ，60 35 ，水浴消化过夜限制性内切酶 酶酶切过夜循环 周期最后一个循环 延长至 产 PFGE : 1% ，0, 5 × TBE ，6 V / cm，,50 0 bp PCR : 93? 条件为凝胶缓冲液电压 物长度 者 扩增热循环参数 为预 变 性 电泳 s :15 s，s :45 s，2 min，93? 60 s55? 60 s72? 60 s，20 h，5 10 h，15 35 ， 脉冲参数 电泳时间 然后 循环 周期最后 ??时间 72? 5 min。2% ，10 h，120?，14? 。0, 5 g / ml Godviewl一个循环 延长至 产物经 琼脂糖凝胶电泳出 电压角度 温度 电泳后 μ 。现与阳性对照分子相当的目的条带为阳性min，Bio )Ra d Versa Doc30 min，30 染色 去离子水脱色 公司 3000 。型荧光成像仪读胶分析 1, 3, 4PFGE PCR 统计学分析 分别以 结果和 检测耐药基1, 3, 3 44 耐药基因检测 种抗菌药物耐药基因的检测均采 、、。因及质粒转座子?类整合子遗传标记结果进行聚类分析PCR 。用 法各种靶基因引物序列由无锡市克隆遗传技术研究 。。K DNA 所提供采用蛋白酶 消化法制备 扩增 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 各种靶 ( NIH) ImageJ 1, 41 图象处理使用美国国家卫生研究院的 版本，SAS9, 1 Q ，。软件聚类分析使用 进行 型聚类使用平均距离法 1 PCRP1: 引 物 μ基因扩 增 体 系 均 为每 反 应 体 系 l 2 ( 1, 0 mol / L) 、P2 ( 1, 0 mol / L ) ，dNTPs 2 1 l 结果μ引 物 μμ lμ 2, 1耐药分析 ( 2 mmol / L) ，10 2 l ( KCl 10 mmol / L，( NH4 ) SO倍缓冲液 μ 2 4 32 17 8 ，株铜绿假单胞菌中有 株对 种以上抗生素耐药占8 mmol / L，MgCl2 mmol / L，Tris )H Cl( pH9, 0) 10 mmol / L，NP 2 40 53, 1% ，9，10，11，13，14，16，17，29 13 其中 号菌株对 种抗生素0, 5% ，BSA 0, 02% ( wt / vol) ) ，TaqDN A pol 1 U( ) ，不计体积超 ，，25% (8 /32 ) 。32 全部耐药表现为同一耐药表型占 株铜绿 9 l，5 l，20 l。PCR μ模板液 μ总反应体积 μ扩增热循纯水，1。假单胞菌耐药表型见表 环 : 93? 93? 30 s 55? 30 s 72? 2 min，参数为预变性 然后 ?? 表 1 32 株 PAE 耐药表型 药物1234567891011121314151617181920212223242526272829303132 CXTRRRSRRRRRRRRRRRRRIIIRRRRRRRRRRRR MEMRRSSRSSSRRRRRRRRRSSRRRSSRSSRRRSS IPMRRSIRSRSRRRRRRRRRRSRRRRSRSSRRRSS R R R R R R PIP R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R S S R R R R TZP S S S S S S S S S S R R R R R R R R R R R R R R R R R R I R R R S ATM R R I I R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R S IIS R R S CAZ I I S S S S S S R R R R R R R R R R R R R R R R R I S I I I R S S S S S S FEP R R S I I R R R R R R R R R R R R R R R R SR R R S S S S S S S S LEV S I S S S R R R R R R R R R R R R R R R R S S R R SSSSSSSSCIP S R S R S S RRRRRRRRRRRR GMRSISISSSRRRRRRSRRSSRRRRSRSSSRSSS AMKSSSSRSSSRRRSRRSRRSSRSSSSSSSSRSSS CFSRISSRRISRRRRRRSRRSSRIRSIRSIIRSSS 注: CXT: 头孢噻肟; MEM : 美洛培南; IPM : 亚胺培南; PIP: 哌拉西林; TZP: 哌拉西林 / 他唑巴坦; ATM: 氨曲南; CAZ : 头孢他啶; FEP: 头孢吡; LEV: ; CIP : ; GM: ; AMK: ; CFS: / ; R: ; S: ; I: )肟左旋氧氟沙星环丙沙星庆大霉素阿米卡星头孢哌酮 舒巴坦耐药 敏感 中度敏感 2 ，9，10，11，13，14，17 ，2, 2PFGE 为 个簇群为一簇群其余标本为另一簇结果分析 ，2。群结果见图 32 PAE PFGE 9，10，11，13，14，16，17，株 菌 聚类分析显示 20，29 ，15，28，32 ，12，22，25 为同一克隆为同一克隆为同一克 ，1。隆结果见图 图 2 32 株 PAE 多耐药基因检测聚类分析图 ，以耐药基因等为分子标记作检测结果的样本聚类分析 图 1 32 株 PAE 脉冲场凝胶电泳聚类分析图谱 ( cluster) 。，括号内为菌株号二个簇群内均已发生衍化但均存 2, 3 多耐药基因聚类分析。15 ) 18 ，12 )2 2 )2 5 ，13 )1 4 )1 7 在克隆传播号株号株号 44 ，32 PAE 以 种基因为分子标记聚类分析显示株 菌主要 。株为克隆传播 3 ，44 9，10，11，讨论为同一克隆传播而 种耐药基因聚类分析提示 ，PAE 13，14，17 ，，13，14，17 近年来临床分离率和对常用抗菌药物的耐药率均 为一簇群而且该簇群内已发生衍生化仅 ，，PFGE 呈上升趋势常常在医院发生多药耐药铜绿假单胞菌流行或 号株为克隆传播多耐药基因聚类分析比 具有更高的分 ，。。，，暴发流行已成为医院感染防控的难题之一我们的研究显 辨能力近年来多个分子标记分析技术受到关注多个分子 ,9，10,，PAE ) 、示本组 烧伤病房分离株存在严重的 β 内酰胺类氨基 MRSA 。Jn i标记分型法己被证实用于 分型十分有效等认 、。32 PAE 糖甙类喹诺酮类等抗菌药物的多药耐药状况株 菌 PFGE、 为耐药基因多基因聚类分析在分子流行病学研究中比 ,11,13 ，8 没有一株对所检测的 种常用抗菌药物完全敏感对 种以 AFLP 。更有用和对临床治疗有指导意义 17 ，53, 1% ，9，10，11，13，14，上抗菌药物敏感的有 株占 其中 ,,参考文献 16，17，29 13 ，号菌株对 种抗生素全部耐药表现为同一耐药表 。Nikbin 型等报道烧伤病房来源的临床标本与其他来源的临 ,3,，。床标本相比较具有较高的多药耐药率 ,1, Jiang X，Zhang Z，Li M，et al, Detection of extende)ds pectrumβ )， 对不同患者分离的同一种病原菌菌株进行亲缘性分析lactamase sin clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa,J,, Antimi- crob Agents Chemother，2006，50( 9) ): 299 29905, 、是判断医院感染是否存在是散在性感染或暴发流行性感染 ,4,,2, , ,J, , 糜祖煌细菌抗菌药物耐药基因研究中值得注意的问题世 。、的有用方法传统的分型法有抗菌谱分型生物学分型和 ，2006，6( 5) : 498) 499, 界感染杂志，， 噬菌体分型等但由于菌株本身及方法敏感性等因素的影响,3, V, S Nikbin，A, Abdi )A li，M, M Feizabadi et al, Pulsed field gel e- 。20 80 ，往往对不同的菌株无法有效区分世纪 年代起分子生 lectrophoresis ,plasmid profile of Pseudomonas rug ianeosa at twoh os- ，DNA 、物学技术被引入微生物分型出现了质粒 分型脉冲场 pitals in Tehran，Iran,J,, Indian J MedR es，2007，126( 2 ) : 146) ( PFGE) 、PCR 、凝胶电泳分型随机引物 指纹分型扩增片段长 151, ( RAPD) PCR 。度多态性分型以及其他 相关的分型方法等用 ,4, , ,J, , ，2006，6糜祖煌医院感染菌株分子分型方法世界感染杂志 分子生物学技术分析临床分离株有助于研究暴发菌株的流行 ( 3) : 185) 18 6, ,5,，，PFGE PAE 病学意义并确定菌株克隆已被公认为 及其他 ,5, De Vos D，Lim A Jr，Pirnay JP，et al, Analysis of epidemic Pseudo- ,6,。32 PAE 临床分离细菌基因分型的金 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 本研究中对 株 monas raueginosa isolates by isoelectric focusing of pyoverdine and PFGE ，9，10，11，13，14，16，17，20，29 菌株进行 聚类分析显示RAPD )P CR: modertno ols for ani ntegrated anti )n osocmoial infec- t，; 12，22，25 ion strategyin burn woundscen ters,J,, Burns 1997，23( 5) : 379) ，为同一克隆与耐药表型一致为同一克隆与耐药 386, ; 15，28，32 ，表型一致为同一克隆耐药表型具有一定的相似 ,6, Lim K T，Yasin R M，Yeo C C，et al, Genetic fingerprinting and anti- ，，PFGE 。PFGE 性但不完全一致可能是与 分辨不足有关分析 microbial susceptibility profiles of Pseudomonas aeruginosa hospital iso- ，。，1 属于单个分子标记分辨率有限王辉等研究发现从 株鲍 lates in Malaysia,J,, J Microbiol mmunol nfect，2009，42( 3) :197 II、2 曼不动杆菌分离纯化的过程中出现的 种不同大小的菌落 ) 209, ,7,PFGE 。，，图谱一致但对亚胺培南一个敏感一个耐药不仅 ,7, ，，，, 王辉郭萍孙红莉等碳青霉烯类耐药不动杆菌分子流行病学 PFGE、RAPD ，国内学者报告 分辨低近年国外学者类似数据报 ,J, , ，2006，29( 12 ) :中华检验医学杂志 及其泛耐药的分子机制PFGE ，Lee 4 ，告等研究中 株肺炎克雷伯菌呈相同的 谱型但有 1066 ) 1073, DHA )1 ) ， 的携带 型 β 内酰胺酶伴膜孔蛋白编码基因缺失,8, Lee CH，ChuC ，Liu JW，et al, Collateral damage folof moxef therapy: DHA )1 ) 有的不携带 型 β 内酰胺酶无膜孔蛋白编码基因缺 in vivo development of porin deficiency and acquisition of blaDHA ) 1 ,8,，，PFGE 。失质粒图谱也不同这些均提示 分型分辨率低 leading to ertapenemre sistance in a clinical isolate of Klebsiella pneu- monia producing CTX )M ) 3 and SHV ) 5 )la ctamase,sJ,, J An- 在医院感染病原菌的研究中常常会涉及多种耐药基因和 β timicrob Chemother，2007，60( 2) :) 410413, 、。PCR 整合子遗传标记转座子遗传标记等检测耐药基因的 ,9, Shopsin B，Kreiswirth BN, Molecular epidemiology of methicillin )r e- ，检测结果所得数据为二元数据二元数据可以直接进行运算 而sistant Staphylococcus aureus,J,, EmergI nfect Dis，2001，7 ( 2 ) : ，不必再作数据的标准化处理把各种耐药基因检测数据收 集起323 ) 326, ，来组成一个原始数据矩阵作聚类分析即可获得多个耐 药基因,10, Enright MC，DayN P，Davies CE，et al, Multilocus sequencety ping ( ) 。32 PAE 多个分子标记菌株间亲缘性分析结果本文对 株 for characterization of methicillin )r esistant and methicillin )s uscep- 44 菌株进行 种不同类型耐药基因的检测并进行聚类 分析结tibleclones of Staphylococcus aureus,J,, J Clin Microbiol，2000，38 ，32 PAE 2 ，9，10，果显示烧伤病房 株 菌主要为 个簇群 ( 3) : 1008) 101 5, 11，13，14，17 ，。为一簇群与菌株耐药表型一致其余标本归为 ,11,Jin H，Xu XM，Mi ZH，et al, Drug )r esistant gene basedn ogteyping ，。另一簇群该簇群没有第一簇群的亲缘性相关程度高二个 for Acinetobacter baumannii in tracing epidemiological events ando r f，。15，18 ，12，22，簇群内已发生衍化但均存在克隆传播号株 clinical treatment itwhin nosocmoial settings,J,, Chinese Medical J， 25 ，13，14，17 。号株号株为克隆传播多耐药基因聚类分析与 2009，122( 3) : 301) 306, PFGE ，PFGE 9，10，11，13，14，16，17，20，29结果比较发现提示 ( : 2011 ) 01 ) 04)收稿日期