兔支气管败血波氏杆菌菌毛粗提物3种抗体检测方法的建立及比较

兔支气管败血波氏杆菌菌毛粗提物3种抗体检测 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 的建立及比较 兔支气管败血波氏杆菌菌毛粗提物3种抗体 检测方法的建立及比较 江苏农业科学2009年第3期--——259--—— 兔支气管败血波氏杆菌菌毛粗提物 3种抗体检测方法的建立及比较 范志宇,王欣,王芳,熊富强,胡波,张则斌,徐为中 (1.江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放 实验室 17025实验室iso17025实验室认可实验室检查项目微生物实验室标识重点实验室计划 /国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014; 2.苏州药明康德新药开发有限公司,江苏苏州215000) 摘要:利用超声波处理结合TritonX一100溶解法制备粗提的菌毛抗原,建立了3种用于支气管败血波氏杆菌的 抗体检测方法:琼脂免疫扩散试验(AGID),玻片凝集试验(SAT),间接血凝试验(IHA).临床检测了458份兔血清样 品,结果显示:HA试验的阳性检出率最高,为73.36%(336/458),AGID试验阳性63.54%(291/458),SAT试验阳性 61.79%(283/458),三者平均阳性为57.20%(262/458);IHA与AGID的符合率为90.17%,IHA与SAT的符合率为 86.68%,AGID与SAT的符合率为89.08%.表明IHA试验更为敏感,可用于支气管败血波氏杆菌的血清学监测. 关键词:兔;支气管败血波氏杆菌;琼脂免疫扩散试验;玻片凝集试验;间接血凝试验;抗体检测 中图分类号:$829.1文献标志码;A文章编号:1002—1302(2009)o3—0259—03 兔支气管败血波氏杆菌(Bordetellabronchiseptica,Bb)常 导致兔的慢性鼻炎,支气管肺炎和脓疱性肺炎,是家免多发性 呼吸道传染病的主要病原之一.由于鼻腔分离物中含有较多 的其他杂菌,而成年兔群对Bb隐性感染具有一定的抵抗力, 致使细菌的分离和鉴定存在较大的困难,Bb检出率偏低.为 此,采用血清学试验检测兔群Bb感染抗体无疑是一种简便 易行的方法….调查支气管败血波氏杆菌的自然感染情况 时,利用Bb抗原是最有效的方法之一,证明Bb能刺激机体 产生良好的凝集抗体.间接血凝试验(IHA),玻片凝集试 验(SAT)和琼脂免疫扩散试验(AGID)均是常用的血清学检 测方法,但这些试验在检测敏感性,操作简便性,试剂经济性 及抗体针对性等方面差异较大.本研究目的是探讨三种 试验方法检测出的兔血清Bb抗体阳性的相关关系及其敏感 性差异,以确定用哪种方法可更好检测兔群的带菌状态和隐 性感染状态. 1材料和方法 1.1材料 兔支气管败血波氏杆菌I相菌株由本实验室分离鉴定并 冻干保存;TritonX一100购自南京生兴生物技术有限公司;兔 大肠杆菌阳性血清,多杀性巴氏杆菌阳性血清,魏氏梭菌阳性 血清,沙门氏菌阳性血清,SPF兔血清和兔支气管败血波氏杆 菌高免血清均由本实验室自行制备并保存. 1.2菌毛粗提物的制备 1.2.1透析袋的处理将约15cm长的透析袋浸没在大体 收稿日期:20o8一ll—l8 基金项目:农业部公益性行业科研专项(编号:nyhyzx07—040). 作者简介:范志宇(1982一),男,山西太谷人,硕士,研究实习员,主要 从事家兔疾病防治与兽医生物技术研究.Tel:(025)84390337; E—mail:zy_ ~n1982@126.corn. 通讯作者:王芳(1972一),女,新疆伊犁人,博士,副研究员,从事畜 禽传染病免疫机理及诊断方法研究.E—mail:rwangfang@126.corn. 积的2%(m/v)NaHCO和1mmolfLEDTA(pH值8.0)中煮 沸10min,然后用蒸馏水彻底漂洗.继续将透析袋置1 mmol/LEDTA(pH值8.0)中煮沸10min,用蒸馏水将透析袋 清洗干净,4?保存备用. 1.2.2Bb分离培养将冻干保存的BbI相菌株复苏后,用 鲍姜氏培养基满平板划线培养,37?培养36—48h.用灭 菌的含1mol/LNaC1的PBS将Bb菌苔洗下,4000r/min离 心20min,取沉淀,悬浮后再离心,直至上清完全透明,然后将 沉淀继续用上述溶液悬浮并加0.O1%的硫柳汞杀菌. 1.2.3.超声波裂解细菌冰浴下处理20min至菌毛上清透 明,每处理1.5s,间隙1.5s.加入TritonX一100,使终浓度达 0.5%,摇床振荡处理72h.然后将菌毛粗提物的上清液装入 透析袋中,两端扎紧,固定,放进装有水的烧杯中,用磁力搅拌 器作用,调节至合适的转速,每隔一小时换一次水,换2—3次 后可不再换水.为了使透析充分,可在4?过夜.待透析充 分后,用灭菌的含0.5mol/LNaC1的PBS平衡过夜.一20? 保存.菌毛蛋白浓度(mg/m1):1.55×A2..一0.76×A260= 4.79mg/ml. 1.3蛋白质电泳(SDS—PAGE) 将菌毛蛋白加入5×上样缓冲液,煮沸5min,11000 r/min离心2min,取上清20l作为电泳加样用. 1.4琼脂免疫扩散试验(AGID) 1.4.1免疫双扩散试验琼脂(琼扩)板的制备采用1%的 琼脂凝胶,pH值7.2,0.9%NaC1配制琼脂糖凝胶,煮沸融化 20rain,加入0.01%的硫柳汞防腐. 1.4.2抗原抗体最佳作用浓度的方阵 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 将所制得的琼 扩菌毛抗原加入中央孔,Bb阳性抗体加入周边孔,抗原,抗体 分别作1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256 倍比稀释,抗原的每一个稀释度分别与抗体的各稀释度进行 琼扩试验方阵分析,从而确定琼扩抗原,抗体的最佳浓度. 1.4.3AGID的特异性和敏感性试验特异性试验:取最适 稀释度的AGID诊断抗原与支气管败血波氏杆菌阳性血清, 大肠杆菌阳性血清,多杀性巴氏杆菌阳性血清,魏氏梭菌阳性 江苏农业科学2009年第3期 血清及沙门氏菌阳性血清按检测抗体的方法做交叉试验. 特异性阻断试验:为了进一步验证琼脂免疫扩散试验检 测Bb抗原及抗体的特异性,用Bb阳性血清与等量的Bb抗 原混合,37?作用1h,再与Bb菌毛抗原进行琼扩试验观察 结果. 敏感性试验:固定菌毛抗原2倍比稀释抗体,以最大稀释 倍数的阳性血清孔与抗原孔出现沉淀线者判断菌毛抗原的敏 感性. 1.5玻片凝集试验(SAT) 取25l待检血清和等量波氏杆菌菌毛蛋白抗原于玻片 上混合,慢慢旋转混合均匀,促进凝集.室温下反应不超过5 min,观察反应结果. 1.6间接血凝试验(IHA) 1.6.1红细胞的醛化,鞣酸化及致敏取适量健康兔的 红细胞悬液于磁力搅拌器上缓慢搅拌,同时按1:1体积比逐 滴加入戊二醛,醛化时间分别为1,3,5h.之后,用0.1mol/L pH值7.2的PBS洗3次,恢复到原体积,4?保存备用.取 5%的醛化红细胞悬液与等量新配制的1:2000鞣酸混合, 置37?水浴15min,用0.1mol/LpH值6.4的PBS洗3次 后,恢复到原体积.取5%醛化鞣酸化红细胞悬液与等量最 佳浓度的抗原混合,37?水浴作用30min(其间不断轻轻振 荡),3000r/min离心3min,弃上清,用0.1moL/LpH值7.2 的PBS洗2次后,再用此稀释液配成1%的致敏红细胞悬液, 加终浓度0.1L的硫柳汞防腐. 1.6.2最适致敏抗原用量的选择将抗原贮存液在1.5ml EP管中用0.1mol/LpH值6.4的PBS倍比稀释为0.05, 0.10,1.15,0.20,0.25,0.30mg/ml,并分别与5%鞣酸红细胞 致敏后,测定Bb阳性兔血清.. 1.6.3特异性,敏感性和重复性试验用该间接血凝诊断抗 原按上述步骤检测Bb阳性血清,大肠杆菌阳性血清,沙门氏 菌阳性血清,巴氏杆菌阳性血清和魏氏梭菌阳性血清,观察是 否有交叉反应. 阻断试验:用Bb阳性血清与等量的Bb抗原混合,37? 作用1h,再与Bb菌毛抗原进行间接血凝试验观察结果. ,用本方法与琼脂免 取lO份免疫兔阳性血清2倍比稀释 疫扩散试验(AGID)同时进行检测,比较其敏感性. 批间重复性试验:用3份不同批次的诊断抗原同时检测 10份阳性血清和3份阴性血清,观察效价的变化情况. 批内重复性试验:取同一批次的诊断抗原检测10份阳性 血清和3份阴性血清3次,观察效价的变化情况. 1.7临床检测 分别从江苏,山东等地兔场随机采集兔血清458份,用建 立的AGID,IHA,SAT方法进行样品检测. 2结果 2.1茵毛蛋白的SDS—PAGE 经超声波处理结合TntonX一100溶解法,SDS—PAGE结 果显示,菌毛蛋白在27.5ku,29.5ku,76ku,112ku和123ku 处有明显特异条带(图1),与文献报道中一致. Ml2 97.4ku———一 2ku———— 66. 43.0ku———— , 123ku , "2ku , 29.5ku , 27.5ku M:蛋白质 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ;l,2:菌毛蛋白 图1菌毛蛋白的SDS.PAGE结果 2.2琼脂免疫琼扩试验(AGID) 2.2.1最佳反应条件支气管败血波氏杆菌菌毛抗原各稀 释孔与阴性抗体各稀释孔均未有白色沉淀线出现,而与阳性 孔出现致密白色沉淀线,一般24h即可出现结果(表1). 表1不同浓度抗原抗体反应结果 l:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 l:128 1:256 由表1可知,与波氏杆菌最高稀释度阳性抗体形成沉淀 的菌毛抗原最高稀释度为1:8作为一个抗原单位,实际检测 时,诊断抗原采用2个抗原单位,即1:4稀释. 2.2.2特异性试验结果取琼扩诊断抗原1:4稀释,与上 述常见的其他4种阳性血清进行琼扩试验,结果表明该四种 阳性血清与诊断抗原均没有形成沉淀线,而Bb血清与菌毛 抗原形成了白色致密的沉淀线,证明该方法是特异的. 2.2.3琼扩特异性阻断试验兔支气管败血波氏杆菌阳性 血清与等体积的菌毛抗原混合,37?作用1h后,与菌毛抗原 进行琼扩,结果为阴性. 2,2.4敏感性试验结果AGID抗原与倍比稀释的阳性血清 进行AGID试验,结果1:16的阳性血清与AGID抗原出现沉 淀线,1:16以上不出现沉淀线,故AGID实验的敏感性为 1:16.对比检测结果IHA试验的敏感性为1:256,表明 范志宇等:兔支气管败血波氏杆菌菌毛粗提物3种抗体检测方法的建立及比较一 261一 AGID试验的敏感性没有IHA试验高. 2.3间接血凝试验(IHA) 2.3.1红细胞醛化的最适条件在磁力搅拌器作用下,醛化 1,3,5h红细胞的效价分别为2,2和2,因此确定红细胞的 最佳醛化时间为5h. 2.3.2IHA抗原最适工作浓度的选择将倍比稀释的浓缩 超声波裂解抗原分别致敏红细胞,与倍比稀释的阳性血清做 IHA试验.结果显示,当抗原浓度为0.05mg/ml时,血凝效 价低,但随抗原浓度提高,血凝效价也提高;当抗原浓度超过 0.15mg/ml时血凝效价不再明显提高.因而确定最适抗原 浓度为0.15mg/ml,用此浓度抗原制备的1%致敏红细胞血 凝效价高,且图像清晰,经反复试用效果稳定. 2.3.3IHA特异性试验用Bb最适浓度抗原与10份Bb阳 性血清反应,结果全为阳性,表明用Bb超声波破碎抗原致敏 的红细胞能检出抗体,而与大肠杆菌阳性血清,沙门氏菌阳性 血清,巴氏杆菌阳性血清和魏氏梭菌阳性血清均为阴性. 2.3.4IHA敏感性试验将Bb阳性血清2倍比稀释,用该 间接血凝诊断抗原检测,1:256(1:2)稀释的检测结果仍为 阳性.取10份免疫兔的阳性血清,倍比稀释后分别用IHA 和AGID检测,血清的AGID效价为(1:21),(1:24);IHA 效价为(1:25)一(1:28).IHA的敏感性为AGID的l6倍, 结果见表2. 表2敏感性试验的检测结果 2.3.5IHA重复性试验批间重复性试验:用3批诊断抗原 对1O份阳性血清和3份阴性血清重复检测3次,每次结果基 本相符(P<0.05).证明本研究制备间接血凝诊断抗原的工 艺流程是稳定的. 批内重复性试验:用同一批次的诊断抗原对10份阳性血 清和3份阴性血清每隔一月检测一次,共检测3次,每次的检 测结果完全相同. 2.4IHA效价与AGID阳性率测定结果 ,每批血 本试验收集到的待检血清样品5批次共458份 清的IHA效价高低不一,每份血清采用IHA与AGID同步检 测的方法,比较IHA效价与AGID阳性率的关系,结果如 表3.由表3可以看出,IHA效价与AGID阳性率呈正相关, IHA效价为1:64以上时,AGID检出的阳性率为100%. 2.5临床检测结果 三种检测方法对458份临床血清样本进行检测,结果共 检出IHA阳性336份,AGID阳性291份,SAT阳性283份. 阳性检出率以IHA试验最高,为73.36%(336/458),其次是 表3IHA效价与AGID阳性率的关系 AGID试验[为63.54%(291/458)]和SAT试验[为61.79% (283/458)],三者平均阳性为57.20%(262/458). 在336份IHA阳性血清中,有SAT阳性279份,有AGID 阳性291份;有122份IHA阴性血清的AGID试验均呈阴性, 其中有4份SAT阳性,IHA与AGPT的符合率为90.17%,与 SAT试验的符合率为86.68%.在291份AGID阳性血清中, 有262份SAT阳性;其167份AGID阴性血清中有SAT阴性 血清146份,AGID与SAT的符合率为89.08%.可见IHA与 AGID有较高的符合率,且IHA具有更高的敏感性;在291份 AGIT阳性血清中,有SAT阳性262份,可见AGID较SAT敏 感性更高. 3讨论 由于支气管败血波氏杆菌存在I,?,?相三种不同的菌 相,而不同的菌相之间凝集性能存在着明显差异.在37?的 反应温度下,BbI相菌对K抗血清的凝集效价达到1:1280; ?相菌和?相菌的凝集效价小于1:10.为此,在制备凝 集诊断抗原时对BbI相菌株的筛选和鉴定是非常重要的. 把超声波处理和TritonX一100溶解结合起来提取菌毛蛋白获 得了理想的结果,该菌毛粗提物中含有丰富的保护抗原,而且 超声波处理使I相菌株的凝集原大量释放,从细菌细胞游离 或暴露,溶解在1mol/LNaC1中,加入TritonX一100分散表面 蛋白和溶解胞浆膜,不会导致蛋白质主要构型的改变或生物 学活性的丧失,所以这种方法是可行的. 根据琼脂扩散试验原理,抗原和抗体浓度比例适当时,即 可出现肉眼可见的反应,但抗原浓度过高,不仅浪费,而且沉 淀线可能偏移甚至影响结果判定.本试验中,与最高稀释 度阳性抗体形成沉淀的菌毛抗原最高稀释度为1:8,但是为 了避免漏检,我们认为菌毛抗原4倍稀释是诊断用抗原的最 佳浓度;特异性试验也证明支气管败血波氏杆菌血清和菌毛 抗原的反应是特异的.虽然其敏感性不甚理想,但该方法对 促进基层支气管败血波氏杆菌的试验诊断与监测以及提高诊 疗水平具有一定的推广价值. 间接血凝试验是常用的血清学检测方法,新鲜红细胞由 于保存时间短,需在使用之前临时致敏,不仅不方便,而且不 同批次,不同动物个体细胞的差异对重复性有影响.本试 验中利用蛋白质凝固剂戊二醛固定红细胞后再做间接血凝试 验,醛化红细胞具有较强的吸附蛋白质抗原或抗体的能力,血 凝反应的效果基本上与新鲜红细胞相似,可在4?冰箱保存 (下转第262页) 江苏农业科学2009年第3期 安徽省部分地区猪传染性胸膜肺炎的流行病学调查 贺英,赵萍,储岳峰,高鹏程,逯忠新 (中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室 /农业部草食动物疫病重点开放实验室/农业部畜禽病毒学重点开放实验室,甘肃兰州730046) 摘要:用间接血凝检测方法对安徽省部分猪场的猪传染性胸膜肺炎流行情况进行调查研究,结果该地区猪血清 抗体总阳性率为16.6%,其中母猪阳性率偏高,为22.4%. ;传染性胸膜肺炎;调查;血清抗体;阳性率 关键词:猪 中图分类号:$858.282.5文献标志码:A文章编号:1002—1302(2009)03—0262—02 猪传染性胸膜肺炎(Porcinecontagiouspleuropneumonia, PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae, APP)引起的高度接触性呼吸道疾病.它可致各年龄段的 猪发生急性和慢性感染,病猪发热(达42?),呼吸困难,食 欲不振;发病率和死亡率常在20%以上,最急性型的死亡率 高达80%,100%;慢性猪传染性膜肺炎病原潜伏于猪体内, 可使猪生长缓慢,平均日增重下降,饲养报酬降低,给养猪业 造成巨大的经济损失』.同时,急性感染耐过或隐性感染的 猪只将是带菌者,成为本病再次爆发和流行的潜在传染源,是 本病防控和根除的隐患.自1957年Pattison等首次报道猪传 染性胸膜肺炎以来,世界大部分国家(地区)相继报道了本病 的暴发和流行,如欧洲,美国,加拿大,墨西哥,南美,韩国,日 本,中国台湾省,澳大利亚.自2000年以来,猪传染性胸膜肺 炎在国内多处出现暴发性流行,上海,浙江,广东,湖北,湖 收稿日期:2008—11—27 基金项目:国家科技支撑 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 (编号:2006BAD06A01; 2006BAD06A12). 作者简介:贺英(198O一),女,内蒙古乌兰察布人,硕士,研究实习 员,主要从事细菌分子生物学研究.Tel:(0931)8342676; E—mail:heyins6576@163.eom. 通讯作者:逯忠新(1955一),男,甘肃秦安人,研究员,主要从事细菌 分子生物学研究.E—mail:luzhongxin@hotmail.corn. 南,河南等地尤为严重.近年来,我国大多数省市报道有 此病的发生,但不同地区流行的血清型有所差异,主要以1,3 和7型为主. 感染胸膜肺炎放线杆菌的母猪群表现典型的血清学阳性 反应,这些母猪通过初乳传递高滴度的母源抗体给它们的后 代,仔猪大约在4周龄时将失去母源抗体的保护,至9周龄时母源抗体消失,此时仔猪就处于APP的威胁之下.研究表 明,猪胸膜肺炎的发生与APP的感染剂量有关,低剂量仅可 导致血清阳转,而不表现临床症状;较高水平的剂量则可引起 致死性感染.从理论上讲,在一个污染的环境中,胸膜肺 炎放线杆菌的感染剂量与阳性猪群中猪的年龄的关系呈对数 增加.当生长猪遭受到数倍于感染剂量的APP攻击时,胸膜 肺炎就会暴发. 1材料和方法 1.1样品的采集与处理 被检血清:共169份,来自安徽省部分猪场.按照无菌采 血要求,于被调查猪场随机采集血液样本,取血清于56?水 浴30min灭活补体,用于血清学检测. 1.2主要试剂和材料 猪传染性胸膜肺炎正向间接血凝抗体检测试剂盒由中国 农业科学院兰州兽医研究所提供.96孔V型反应板购自海 (上接第261页) 半年以上.在此基础上,将醛化的红细胞进一步用鞣酸处理, 蛋白类的抗原更容易吸附到红细胞上.这样用超声波破碎抗 原致敏时,醛化鞣酸化红细胞比新鲜红细胞吸附的抗原量更 多,使试验结果更加容易观察.IHA试验虽然程序较AGID 和SAT复杂,但是敏感性相对较高,耗时短,凝集图像清晰易 于判定,结果可靠,临床上可用于支气管败血波氏杆菌的血清 学监测. 参考文献: [1]李永明,李建华,徐景峨,等.应用凝集反应检测猪支气管败血波 氏杆菌感染[J].畜牧与兽医,2007,39(8):51—54. 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