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荧光光度法测定血清中碱性磷酸酶.doc

荧光光度法测定血清中碱性磷酸酶

周婉泽
2017-09-19 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《荧光光度法测定血清中碱性磷酸酶doc》,可适用于综合领域

荧光光度法测定血清中碱性磷酸酶首席医学网    年月日::Wednesday  ∙中华临床医师杂志征稿∙颅脑解剖技术研修班∙肝病学科新进展研修班∙心律失常现代诊疗会议∙医学类核心期刊征稿∙老年疾病循证应用会议∙小儿心血管疾病会议∙第届国际急诊学大会∙临床检验及设备展览会∙白内障人工晶状体会议∙全国疑难重症肝病大会∙四届长城国际男科论坛∙世界心脏病学大会∙泌尿外科学临床研修班∙股骨头坏死修复论坛作者:张娜边玮玮李耀辉    作者单位:黄山学院化学系黄山 潍坊医学院潍坊 加入收藏夹《航空航天医药》由中华人民共和国科学技术部、中华现代临床护理学杂志征稿吸入性肺炎常规治疗例新生儿溶血病·例肝癌介入术后并发症的观察和护理·型糖尿病患者自主神经病变与血糖控制·浅谈局部压迫治疗小腿淋巴漏的临床体会·穴位埋线配合五官超短波治疗过敏性鼻炎·肝外伤微创治疗临床观察糖尿病治疗对策护理杂志:诚信征稿、发表快幼儿急疹例临床分析干眼症常见因素·写作技巧|如何撰写高质量的医学论文·快讯|国家级医学科技期刊征稿【摘要】  合成了一种新的底物水杨酸磷酸酯(SP)用于荧光光度法测定血清中碱性磷酸酶(ALP)活力。在℃的TrisHCl缓冲液(pH)条件下,碱性磷酸酶作用于荧光底物SP水解生成强荧光产物水杨酸(SA)生成的SA的量与参与反应的ALP的活力成正比。据此建立了荧光光度法测定血清中碱性磷酸酶活力的新方法。测定碱性磷酸酶的线性范围是~UL检测限为mUL。本方法适用于血清中碱性磷酸酶的测定。测定结果与临床上常用的以对硝基苯磷酸酯为底物的分光光度法相比无显著性差异。【关键词】 碱性磷酸酶荧光光度法水杨酸磷酸酯  引言    碱性磷酸酶(ALP,EC)的活性测定是临床上最常见的测定项目之一。血液中的ALP主要来自于肝脏和骨骼因此在这些器官发生病变时血清ALP活力会明显增高。ALP活力测定可作为诊断某些疾病的辅助指标。因此在临床诊断中简单、准确地测定血清中ALP的活性是非常重要的。测定ALP活性的方法主要有分光光度法,,电化学方法,、化学发光法,和荧光法~等。临床推荐使用的检测ALP方法是利用对硝基苯磷酸酯作为底物的分光光度法和磷酸苯二钠作为底物的氨基安替比林比色法,,。通常荧光法的灵敏度较分光光度法高约两个数量级且和分光光度法一样具有所用仪器简单、操作方便及易于实现操作自动化等优点。本实验选择水杨酸磷酸酯(SP)作为荧光底物SP在℃的低温条件下至少可稳定一个月。在实验条件下合成的新底物SP稳定性好荧光背景很低。而SP被ALP水解后生成强荧光产物水杨酸(SA)反应机理如下。   荧光分子SA中含有共轭π键且SA分子取代基之间形成氢键从而加强了分子的刚性结构使其荧光强度增强且生成的SA的量与参与反应的ALP活力呈线性关系。据此建立了荧光法测定ALP活性的新方法。  实验部分  仪器    RF型荧光分光光度计和UV型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)PHSB型酸度计(上海雷磁仪器厂)离心机(上海手术机械厂)。  试剂    水杨酸磷酸酯(SP)参照文献合成并纯化将gSA与gPCl混合使之在室温下反应直到反应平缓下来然后用~℃水浴搅拌加热h。用冰水浴将反应混合物冷却然后依次加入mL苯、mL丙酮和mL水。将混合物冰水冷却min后加入mL苯再放置h。经真空干燥过夜后用丙酮和苯的混合物重结晶可得gSP(产率约)。测得其熔点为~℃与文献报道的~℃基本符合。底物C、H含量用元素分析仪(美国PE)测定(括号为理论值):测得值为:C(),H()。    工作液的配制:准确称取gSP溶于少量molLTrisHCl缓冲溶液(pH)中并以此缓冲溶液定容至mL容量瓶得mmolL工作液(可稳定一个月以上)。碱性磷酸酶(ALP分析纯Sigma公司Umg)储备液的配制:准确称取gALP溶于少量molLTrisHCl缓冲溶液(pH=)中并以此缓冲溶液定容至mL容量瓶得UmL储备液。使用时以molLTrisHCl缓冲溶液(pH)逐级稀释得工作液。水杨酸(SA分析纯北京化学试剂公司)工作液的配制:准确称取gSA溶于少量molLTrisHCl缓冲溶液(pH)中并以此缓冲溶液定容至mL容量瓶得mmolL工作液。储备液与工作液均需置于~℃的生化培养箱内保存。    molLTrisHCl缓冲溶液(pH)。其余所用试剂均为分析纯所有实验用水均为石英亚沸蒸馏水。  实验方法    于mL比色管中依次加入mLmmolLSP、mLTrisHCl缓冲溶液(pH)和mLULALP以石英亚沸蒸馏水定容至刻度振荡摇匀℃水浴放置min用cm荧光池(附有自动恒温装置)记录其荧光光谱。同时在λexλem=nm测定荧光强度F同时测定试剂空白的荧光强度F。经过酶反应后增强的荧光强度以ΔF(ΔF=F-F)表示。     结果与讨论  SA和SP的荧光光谱    SA溶液、SP溶液和SPALP混合后体系的荧光激发光谱和发射光谱见图。酶反应后所得产物SA分子具有强的共轭π键刚性结构以及给电子基团(OH)因此SA荧光较强。合成的SP将SA分子中的给电子基团(OH)转化为磷酸酯基使得SP的荧光显著减弱。由图可见单纯的SP溶液荧光很弱(曲线)在SP中加入ALP后(曲线)荧光强度显著增强且峰形与SA(曲线)类似。荧光光谱说明ALP能催化SP水解生成SA。 图 荧光激发光谱(a)和荧光发射光谱(b) (略) Fig Fluorescenceexcitationspectrum(a)andemissionspectrum(b) salicylicacid(SA)Salicylphosphate(SP) SPalkalinephosphatase(ALP) Experimentalconditions:×-molLSA,×-molLSP,ULALP,pH,λex=nm。  反应条件的优化  酸度的影响 体系酸度对酶催化反应影响见图。由图可见在pH=~之间体系的ΔF先增大后减小当pH在~范围时体系的荧光强度ΔF变化不大。而在pH~范围内体系的ΔF达到最大且保持稳定故本实验选择pH的molLTrisHCl缓冲体系进行进一步的研究。结果表明加入mL缓冲溶液时ΔF达到最大且保持稳定。  底物浓度的影响 SP的浓度对体系荧光强度(ΔF)的影响见图。由图可知在~μmolL范围内随着底物SP浓度的增大体系的荧光强度(即反应速度)逐渐增大当SP浓度大于μmolL时体系的荧光强度不随底物浓度的增大而变化。米氏动力学方程式V=Vmax·[S]Km+[S]反映了酶反应速率与底物浓度之间的关系。  图 pH值对荧光强度的影响(略) Fig EffectofpHonfluorescenceintensity  图 底物SP的浓度对体系荧光强度(ΔF)的影响(略) Fig EffectofconcentrationofsubstrateSPonenhancedfluorescenceIntensity 通过LineweaverBurk双倒数转换得式():1V=KmVmax×1[S]+1Vmax()式中V为初速度(mol(min/L))Vmax为最大反应速度S为底物浓度(molL)Km为米氏常数(molL)。本研究以ΔF的值相应地代表了酶的反应速率。因此得式():1ΔF=KmVmax×1[SP]+1Vmax(2)所以以1ΔF对1[SP]作图得Km值为×-molL。为了正确测得酶活力所选底物浓度应远大于Km值。因此本研究选择浓度为×-molL。  温度对体系荧光强度的影响 同其它酶促反应相似ALP催化SP水解反应受温度影响较大。实验结果表明当温度低于℃时F随温度变化很小当温度高于℃时F随温度上升而迅速增加这是由于底物自身水解的影响所造成反应温度为~℃时ΔF达到最大值且保持不变本实验选择℃进行下一步研究这样既保证了酶活性又与临床应用的生理环境相一致。  图 反应时间对体系荧光强度(ΔF)的影响(略) Fig Effectofincubationtimeonenhancedfluorescenceintensity  反应时间对体系荧光强度的影响 同其它酶促反应相似ALP催化SP水解反应受反应时间影响较大。由图可见随着反应时间增加F基本保持稳定而F和ΔF随之增大。实验结果表明在min内体系荧光强度的增强(ΔF)与反应时间成正比。为了提高分析速度选择孵育时间为min此时已有较强的检测信号和足够的灵敏度。  分析应用  线性范围与检测限 在选定的最佳条件下体系增强的荧光强度与ALP的活性在~UL范围内有良好的线性关系线性方程为ΔF=C相关系数。空白溶液的标准偏差为时(n=)检出限为mUL。 表 人血清中ALP活性的测定(略) Table DeterminationofactivityofALPinserumsamples  人血清ALP活性的测定 取人血清mL按上述实验方法直接测定其中所含ALP的活性同时用标准比色法(以对硝基苯磷酸酯为底物)测定该样品结果见表。由表可知与临床上常用的以对硝基苯磷酸酯为底物的比色法相比本实验方法具有良好的准确度和精密度。一、pH对酶的影响酶的化学本质是蛋白质具有两性电解质的性质在一定溶液中可以发生解离作用。酶在水溶液环境中的解离状态和行为都受到H的影响。酶活性中心功能基团的解离状态随着溶液的pH值改变而改变因此溶液的H浓度对酶催化反应的速度有明显的影响而且其影响机理非常复杂。这是因为在酶分子的活性部位上具有很多的酸性或碱性氨基酸的侧链基团它们可随着pH的变化而发生解离并属于不同的正负高价离子或等电荷状态它们将直接影响到酶的活化以及酶与底物的亲和力。有些酶需要高浓度的氢离子才能活化例如胃蛋白酶原只有在pH左右时才可以活化为胃蛋白酶。绝大多数酶类都可以因酶分子表面极性基团的解离而改变酶活性部位的原有构象或改变辅酶、辅基或活化因子的结合从而导致酶催化反应速度的变化另一方面pH亦影响到酶促反应的进行。总之pH是决定酶催化活性的重要参数之一pH变化能使酶活力提高或下降。在生理生化反应中我们可以通过调控pH值提高某种酶的活力而降低其他酶的干扰作用。在工业生产上特别是利用大型生物反应器时调控反应系统的pH以控制酶活力往往是生产成败的关键。因此研究pH对酶促反应的影响是探讨酶催化作用机理的重要手段之一。 不同的酶氨基的组成不同则酶分子中可解离的基团性质不同这些基团随着pH的变化可以处于不同的解离状态侧链基团的不同解离状态即可以影响底物的结合和进一步的酶催化反应、也能影响酶的空间构象从而影响到酶的催化活性。pH对酶活性的影响主要有以下几个方面: .过酸或者过碱都可以使酶的空间结构破坏而引起酶的变性导致酶活力的下降。这种酸碱的失活作用一般有两种情况可逆的失活和不可逆的失活。当适当地改变溶液的pH值酶活力可以恢复的为可逆的失活(reversibleinactivation)否则为不可逆的失活(irreversibleinactivation)。 .酸或碱影响酶活性中心结合基团的解离状态使得底物不能和酶结合。 .酸或碱影响酶活性中心催化基团的解离状态使得底物不能被酶催化成产物。 .酸或碱影响底物的解离状态或者使底物不能与酶结合或者结合后不能生成产物。 由于上述种种原因每种酶对于某一特定的底物在一定的pH值下均具有最大的反应速度值或者说具有一个最高的酶活力这一特定的pH值就是该种酶的最适pH值(OptimumpH)。 最适pH值不是酶的一个物理特征常数它随着温度所催化底物的种类以及缓冲液的特性和离子强度等综合因素的改变而有所变化应给予足够的重视。不同的酶表面构象各有特点其发挥作用的pH范围有差异其最适pH的范围也不相同。有的酶要求偏酸环境例如哺乳动物胃蛋白酶和捕蝇草的蛋白酶作用的pH在最适pH为相当于molLHCl的酸强度。有的酶要求偏碱的环境例如碱性磷酸酶作用的pH在最适pH为。总之各种酶有各自固有的作用pH范围有各自的最适pH值。同工酶的最适pH值也可以有很大的差别如同一物种所产生的磷酸酯酶酸性酶的最适pH值为与碱性酶的最适pH值相差将近。同物种的同性质酶最适pH值也可以有差别胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶的最适pH值与胃蛋白酶的最适pH值相差也达~。一、pH对酶的影响酶的化学本质是蛋白质具有两性电解质的性质在一定溶液中可以发生解离作用。酶在水溶液环境中的解离状态和行为都受到H的影响。酶活性中心功能基团的解离状态随着溶液的pH值改变而改变因此溶液的H浓度对酶催化反应的速度有明显的影响而且其影响机理非常复杂。这是因为在酶分子的活性部位上具有很多的酸性或碱性氨基酸的侧链基团它们可随着pH的变化而发生解离并属于不同的正负高价离子或等电荷状态它们将直接影响到酶的活化以及酶与底物的亲和力。有些酶需要高浓度的氢离子才能活化例如胃蛋白酶原只有在pH左右时才可以活化为胃蛋白酶。绝大多数酶类都可以因酶分子表面极性基团的解离而改变酶活性部位的原有构象或改变辅酶、辅基或活化因子的结合从而导致酶催化反应速度的变化另一方面pH亦影响到酶促反应的进行。总之pH是决定酶催化活性的重要参数之一pH变化能使酶活力提高或下降。在生理生化反应中我们可以通过调控pH值提高某种酶的活力而降低其他酶的干扰作用。在工业生产上特别是利用大型生物反应器时调控反应系统的pH以控制酶活力往往是生产成败的关键。因此研究pH对酶促反应的影响是探讨酶催化作用机理的重要手段之一。 不同的酶氨基的组成不同则酶分子中可解离的基团性质不同这些基团随着pH的变化可以处于不同的解离状态侧链基团的不同解离状态即可以影响底物的结合和进一步的酶催化反应、也能影响酶的空间构象从而影响到酶的催化活性。pH对酶活性的影响主要有以下几个方面: .过酸或者过碱都可以使酶的空间结构破坏而引起酶的变性导致酶活力的下降。这种酸碱的失活作用一般有两种情况可逆的失活和不可逆的失活。当适当地改变溶液的pH值酶活力可以恢复的为可逆的失活(reversibleinactivation)否则为不可逆的失活(irreversibleinactivation)。 .酸或碱影响酶活性中心结合基团的解离状态使得底物不能和酶结合。 .酸或碱影响酶活性中心催化基团的解离状态使得底物不能被酶催化成产物。 .酸或碱影响底物的解离状态或者使底物不能与酶结合或者结合后不能生成产物。 由于上述种种原因每种酶对于某一特定的底物在一定的pH值下均具有最大的反应速度值或者说具有一个最高的酶活力这一特定的pH值就是该种酶的最适pH值(OptimumpH)。 最适pH值不是酶的一个物理特征常数它随着温度所催化底物的种类以及缓冲液的特性和离子强度等综合因素的改变而有所变化应给予足够的重视。不同的酶表面构象各有特点其发挥作用的pH范围有差异其最适pH的范围也不相同。有的酶要求偏酸环境例如哺乳动物胃蛋白酶和捕蝇草的蛋白酶作用的pH在最适pH为相当于molLHCl的酸强度。有的酶要求偏碱的环境例如碱性磷酸酶作用的pH在最适pH为。总之各种酶有各自固有的作用pH范围有各自的最适pH值。同工酶的最适pH值也可以有很大的差别如同一物种所产生的磷酸酯酶酸性酶的最适pH值为与碱性酶的最适pH值相差将近。同物种的同性质酶最适pH值也可以有差别胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶的最适pH值与胃蛋白酶的最适pH值相差也达~。

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