关于Western blot的学习汇报
实验的基本步骤如下：
一、提取蛋白质
1、去除培养液，将培养细胞用PBS(磷酸盐缓冲液)洗2次。
2、0.025%胰酶消化细胞至细胞呈疏松状态，倒掉胰酶。
3、PBS吹打细胞，收集离心管。
4、转入EP管内，用PBS洗2次。
5、加入100μl细胞裂解液，打匀，1-2s后即裂解。
6、冰浴20min。
7、10000-14000r/min离心3-5min。
8、吸上清液，蛋白分装后-80°C保存。
注意事项：
1、溶解裂解液，混匀，临用时加PMSF（苯甲基磺酸氟），PMSF终浓度为1mmol/L
2、PMSF有剧毒，不溶于水，但可溶于乙醇等有机溶剂，需保存于4°C
3、根据细胞的类型，应选择合适的裂解液
4、蛋白样品的制备可分为细菌蛋白质样品、酵母的蛋白样品、组织培养的哺乳动物细胞蛋白质以及哺乳动物组织来源蛋白质样品的制备）
二、蛋白质含量的测定（BCA 二喹啉甲酸法）
1、取0.8ml蛋白
标准
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配制液，加入到以管蛋白标准中（20mg BCA），充分溶解配成25mg/ml标准溶液，可-20°C保存。
2、取适量标准溶液，稀释到0.5mg/ml，一般用PBS稀释，可-20°C保存。
3、根据样品数量，按50体积BCA A液+1体积BCA B液配制工作液。
4、将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μL加到96孔板的标准品孔中，加PBS补足到20μL。
5、加适量体积样品到96孔板的样品孔中，加PBS稀释到20μL。
6、各孔加200μLBCA工作液，37°C 20-30min。
7、测定A562 （540-595nm）之间的波长，根据标准曲线算出浓度。
三、电泳
1、配胶准备
根据所需的分离范围确定凝胶的浓度，AP及TEMED待要使用时最后加。
（1）分离胶的配制：在20ml烧杯中，混匀30%丙烯酰胺/0.8%甲叉双丙烯酰胺以及pH8.8的4×分离胶缓冲液和水，最后加入过硫酸铵和TEMED（四甲基乙二胺），摇匀，立即使用。
（2）5ml浓缩胶（3.9%丙烯酰胺）的配制：20ml烧杯中，混匀0.65ml30%丙烯酰胺/0.8%甲叉双丙烯酰胺溶液，1.25mlpH6.8的4×Tris-HCl/SDS缓冲液和3.05ml水，加入25μg10%过硫酸铵和5μlTEMED。
2、灌胶
1、灌胶前将凝胶平衡至室温，真空脱气15min；仪器应平衡一段时间
2、为防止灌入的凝胶泄露，一般常用1%琼脂糖封底和边
3、将分离胶灌入玻璃夹板层中，至距夹层顶部约1.5cm处，配好分离胶后加正丁醇压平，待凝固（室温下聚合30-60min），用ddw吹净并吸干。凝胶的聚合速度可以在紫外下260nm处进行检测。
4、将配置好的浓缩胶用针管加至分离胶上，直至溶液达前玻璃板的顶端，可倾斜插入梳子，梳齿的顶部于前玻璃板的顶部平齐，置凝胶于室温下聚合30-40min。
注意事项：
1、配胶、灌胶的过程中，均应避免混入气泡，应及时处理。
2、10%AP（过硫酸铵）与TEMED在配胶前最后加，且10%AP需现配。
2、上样
1、1ml上样缓冲液（临用时加入DDT（二硫苏糖醇）至0.2mol/L）,另加9μl巯基乙醇(还原剂)；
2、待测样品与上样缓冲液以1:4混合，蛋白质分子量标准与上样缓冲液以1:1混合，分别100°C煮沸5min，使蛋白质变性，后放入冰中迅速冷却至室温，离心15min以除去可能干扰电泳的不溶物；
3、浓缩胶凝固后拔出梳子，电泳缓冲液或去离子水冲洗梳空；
4、将蛋白质分子质量标准参照物和样品（可用上样缓冲液稀释）上样，加样Marker 5-10μL，样品体积按蛋白浓度计算（0.25μg左右），亦需根据方法调整。空置的加样孔需加等体积的上样缓冲液，以防相邻泳道样品的扩散。
5、上样后可用毛细吸管轻轻在其顶部加入少许覆盖物，如去离子水，阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。
3、电泳
1、电泳槽中装满电泳缓冲液，根据溴酚蓝染料的动态，以80v跑浓缩胶，100v跑分离胶，待溴酚蓝至胶边缘即可，回收电泳液。
四、转模（半干式电转移）
1、小心剥离电泳液，量好大小，将胶放入1×transfer buffer（转移缓冲液）中平衡30min。
2、剪去与胶一样大小的PVDF膜（硝酸纤维薄膜）；两叠滤纸，每叠3层。
3、PVDF膜的处理：分别在甲醇中20min——ddw 3min——1×trasfer buffer 10min进行平衡。
滤纸的处理：1×trasfer buffe中平衡30min
4、组装转膜单元：
阳极——纤维垫——3层滤纸——PVDF——凝胶（防短路，在凝胶与膜间边缘封一层封口膜）
负极——纤维垫——3层滤纸（滤纸层间必须赶尽气泡）
5、接通电源转膜：按膜大小选择电流，≤0.8mA/cm2 ，30-40min，以Marker转完为准。
注意事项：
1、在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
2、转移时PVDF膜及滤层不能直接用手拿；滤纸及膜的大小均需与凝胶一样大，否则易引起短路
五、洗膜
转膜结束后，取下PVDF膜，标记正面（可左上角剪切口），放入1×TBS-T清洗，10min 2次，除去Tris、甘氨酸及转膜缓冲液。
注意事项：
1、转膜完毕后应及时洗膜，从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。
六、染色
根据蛋白的不同选用不用的染色方法，如丽春红染色液或考马斯亮蓝快速染色液，即可看到膜上的电泳条带，根据蛋白质分子质量标准参照物，在相应分子质量中间将膜进行裁剪。
七、免疫检测（酶标抗体法）
1、封闭：倒掉TBS-T，将膜放入可热密封的塑料袋中，加入封闭液（5%脱脂奶粉）封闭，在37°C的摇床上摇动30-60min。对于一些背景较高的抗体，可以4℃封闭过夜。
2、一抗孵育：弃去封闭液，加入用封闭液适当稀释后的第一抗体溶液，4°C摇床过夜。、
3、洗膜：取出PVDF膜，以1×TBS-T或洗涤液清洗，振摇10min×3次，如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
4、二抗孵育：将膜放入可热密封的塑料袋内，加入用封闭液稀释的酶标第二抗体，在37°C下振摇1h。二抗需根据一抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的IgG，则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗，如辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216)。
5、洗膜：取出膜，用1×TBS-T 清洗10min×3次，最后一次 15min，浸泡于1×TBS-T中。
八、显像（ECL化学发光）：
1、等体积混合ECL A液及B液，室温备用，现配现用
2、将PVDF膜取出，吸取液体，不得接触蛋白面，至于保鲜膜上。
3、根据膜大小，按10cm2膜加1mL工作液，使工作液均匀覆盖，放置1-2min
4、取膜，吸去液体，放于保鲜膜中，成象。
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