纳米氧化锌对白色念珠菌的抗菌作用

中国组织 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 研究 第 16 卷 第 25 期 2012–06–17 出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research June 17, 2012 Vol.16, No.25 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 cn.zglckf.com 4596 1School of Stomatology, 3School of Basic Medical Sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; 2Department of Stomatology, Anning Branch, General Hospital of Lanzhou Military Area Command of Chinese PLA, Lanzhou 730000, Gansu Province, China He Lin-hai, School of Stomatology, Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China Heinhai07@126.com Corresponding author: Wang Xue-mei, Lecturer, School of Stomatology, Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China wangxuemei@ lzu.edu.cn Supported by: Stomatology Support Foundation of Lanzhou University, No. 533000*; Natural Science Foundation of Gansu Province, No. 1010RJ2A112*; 2010 Quality Engineering of Ministry of Education of China-Innovation Experiment Program for University Students, No. 101073038* Received: 2011-12-19 Accepted: 2012-01-05 纳米氧化锌对白色念珠菌的抗菌作用*** 何临海1，孟 松1，柳苗苗1，周迪舜1，李 珊1，罗 梅2，马兴铭3，王雪梅1 Antibacterial effects of nano zinc oxide on Candida albicans He Lin-hai1, Meng Song1, Liu Miao-miao1, Zhou Di-shun1, Li Shan1, Luo Mei2, Ma Xing-ming3, Wang Xue-mei1 Abstract BACKGROUND: As an inorganic antibacterial agent, nano zinc oxide has different antibacterial mechanisms from organic fungicides. OBJECTIVE: To explore the antibacterial effects of nano zinc oxide on the fungus, such as Candida albicans. METHODS: Nano zinc oxide and zinc oxide were prepared as the suspension with concentrations of 100, 75, 50, 25 and 10 g/L respectively. Normal saline served as a negative control. 30 μL suspension with different concentrations was acted on Candida albicans by using Kirby-Bauer disk diffusion method. The culture plate was cultured at a 37 incubator for ℃ 24 hours. The size of inhibition zone was observed and measured. RESULTS AND CONCLUSION: With the increased concentration of nano zinc oxide, the antibacterial effect on Candida albicans was enhanced gradually, and the diameter of inhibition zone was enhanced. There were no obvious antibacterial effects of zinc oxide on Candida albicans. These findings suggest that nano zinc oxide can inhibit the growth of Candida albicans. He LH, Meng S, Liu MM, Zhou DS, Li S, Luo M, Ma XM, Wang XM. Antibacterial effects of nano zinc oxide on Candida albicans. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2012;16(25): 4596-4600. [http://www.crter.cn http://en.zglckf.com] 摘要 背景：纳米氧化锌作为无机抗菌剂，与有机杀菌剂的抗菌机制明显不同。 目的：探讨纳米氧化锌对白色念珠菌等真菌的抗菌作用。 方法：分别配制成 100，75，50，25，10 g/L 的纳米氧化锌与普通氧化锌悬浊液，以生理盐水作为阴性对照，采用 KB 纸片扩散法将 30 μL 不同浓度悬浊液分别作用于白色念珠菌，将培养平板上置于 37 ℃恒温箱培养 24 h 观察并测 量抑菌圈大小。 结果与讨论：随着纳米氧化锌浓度的提高，对白色念珠菌的抑制作用逐渐增强，抑菌圈直径逐渐增大。普通氧化锌的 无明显抑菌作用。证实纳米氧化锌能够抑制白色念珠菌等真菌的生长。 关键词：纳米氧化锌；白色念珠菌；真菌；抑菌圈；抑菌作用；生物材料 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.25.008 何临海，孟松，柳苗苗，周迪舜，李珊，罗梅，马兴铭，王雪梅. 纳米氧化锌对白色念珠菌的抗菌作用[J].中国组织 工程研究，2012，16(25):4596-4600. [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com] 0 引言 白色念珠菌是一种可寄生在人体的口腔、 胃肠道、女性生殖道黏膜及体表潮湿部位的正 常菌群之一，同时又是重要的机会性致病菌[1]。 在正常状态下念珠菌很少引起疾病，如有慢性 局部刺激、过多过度地使用广谱抗生素和激素、 头颈部放射治疗、口腔黏膜上皮发育不良、内 分泌或免疫功能紊乱、恶性肿瘤、不良修复体、 严重的吸烟习惯等机体产生易感染条件时，白 色念珠菌可引致体表或系统的念珠菌病[2]。纳米 氧化锌具有明显的杀菌效果，且随着纳米氧化 锌浓度的提高其杀菌效果随之增强[3]。普通氧化 锌也有一定的抗菌效果，纳米氧化锌与普通氧化 锌相比，抗菌性有很明显的提高[4]。张富强等[5] 在细胞水平 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 其生物相容性良好。马茂才等[6] 根据纳米材料的AMES实验论证了纳米氧化锌 何临海，等. 纳米氧化锌对白色念珠菌的抗菌作用 ISSN 1673-8225 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 4597 www.CRTER.org 兰州大学，1 口腔 医学院，3 基础医 学院，甘肃省兰州 市 730000；2 解 放军兰州军区总 医院安宁分院口 腔科，甘肃省兰州 市 730000 何临海，男，1988 年生，河南省开封 市人，兰州大学口 腔医学院在读本 科。 Heinhai07@ 126.com 通讯作者：王雪 梅，讲师，兰州大 学口腔医学院，甘 肃省兰州市 730000 wangxuemei@ lzu.edu.cn 中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:1673-8225 (2012)25-04596-05 收稿日期：2011-12-19 修回日期：2012-01-05 (20111019013/D·T) 材料的安全性。纳米氧化锌的抗菌作用研究目 前主要集中于细菌，如金黄色葡萄球菌和大肠 杆菌，且显示了较好的抗菌效果[7]。同时纳米材 料在抗菌过程中仅为催化剂，理论上不消耗， 可永久使用[8]。刘志东等[9]通过体外实验证明纳 米材料对根管内优势菌具有较好的抗菌作用。 余文珺等[10]通过实验证明载银抗菌树脂基托在 体外表现了一定的抗变形链球菌和抗白色念珠 菌的效果。而白色念珠菌等真菌的菌体组成成 分、生物学行为、对药物敏感性、耐药机制等 方面均有别于细菌[11]，纳米氧化锌对白色念珠 菌等真菌是否具有抗菌作用目前尚不清楚，目 前也未见明确报导。本实验通过抑菌圈法研究 纳米氧化锌在不同质量分数下对白色念珠菌的 抑制作用，以及普通氧化锌在同等条件下的抗 真菌作用。 1 材料和方法 设计：材料学观察实验。 时间及地点：于2011-02/09在兰州大学基 础医学院微生物实验室完成。 材料：纳米氧化锌由兰州大学物理学院提 供，粒度直径30~50 nm，通过X射线衍射仪、 透射电镜、静态氮气吸附法等进行纳米表征测 定；普通氧化锌由兰州大学口腔医学院提供。 主要药品及试剂： 方法： 培养基配置： 沙保罗液体培养基(SDA液体)：白胨2.5 g、 葡萄糖10 g、酵母粉2.5 g、蒸馏水250 mL，将 以上成分煮沸溶解，调pH至6.0，121 ℃高压 灭菌30 min，冷却备用。 沙保罗固体培养基(SDA)：蛋白胨2.5 g、 葡萄糖10 g、酵母粉2.5 g、琼脂5 g、蒸馏水 250 mL，将以上成分煮沸溶解，调pH至6.0， 121 ℃高压灭菌20 min，在超净实验台中(已紫 外光照射30 min并有抽风系统)冷却至50℃后 倾制灭菌平板，厚度3.0~4.0 mm，无菌试验合 格后置冰箱内冷藏备用。 细菌增殖：将保存的白色念珠菌菌种用接种 环接种于SDA液体培养基中，置于37 ℃恒温培 养箱增殖18 h后，用生理盐水稀释使菌液密度 与0.5麦氏比浊管一致，此时白色念珠菌处于对 数期[7]，摇匀并装于25 mL离心管中，置入冰箱 在4 ℃下保存，使菌群在对数期保存。 纳米氧化锌与普通氧化锌试剂配置(现配现用)： 在分析天平上称取纳米氧化锌与普通氧化锌各 0.5 g，在紫外灯下照射30 min后加入4.50 mL 无菌生理盐水，制成100 g/L纳米氧化锌溶液， 2 mL 100 g/L纳米氧化锌溶液+2 mL无菌生理 盐水得到50 g/L纳米氧化锌溶液，依此分别配 出100，75，50，25，10 g/L，以及生理盐水 作为阴性对照。 抑菌实验(无菌超净台中)：固体培养基在高压 蒸汽炉中灭菌30 min，在酒精灯旁倒入15 mL 离心管约6 mL将离心管中液态培养基置入直径 60 mm培养皿上制成平板，待其冷却凝固后， 用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液 旋转挤去后在平板上均匀涂布，每旋转平板60° 涂布接种1次，反复3次，最后沿平板边缘涂抹 两周。用注射枪将30 μL不同浓度的纳米氧化锌 与普通氧化锌悬浊液注射于空白药敏纸片上， 将纸片贴附于上述培养平板上，重复实验6组， 置入37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察并用游 标卡尺测量抑菌圈大小。 抑菌效果评价：平均抑菌圈直径(mm)=抑 菌圈直径(实验组1数据+实验组2数据+实验组3 数据+…+实验组n数据)/n(mm)。 2 结果 2.1 纳米氧化锌与普通氧化锌抑菌效果结果 普通氧化锌药敏纸片周围在任何浓度梯度下都 未见明显抑菌圈形成，说明普通氧化锌对白色 念珠菌的抑菌作用不明显，见图1，2。 2.2 氧化锌抑菌圈直径与抑菌效果 在纳米 氧化锌浓度为0时，药敏纸片周围无抑菌圈出 现，为10 g/L时，抑菌圈不明显，随质量分数 的升高抑菌圈直径较快程度扩大，在质量浓度 药品及试剂 来源 白色念珠菌 ( 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 菌株 ATCC10231)、沙保罗 培养基、平板等材料 游标卡尺 生理盐水 兰州大学微生物免疫研究室 提供 北京中诺泰安科技有限公司 兰州大学口腔医院 何临海，等. 纳米氧化锌对白色念珠菌的抗菌作用 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 cn.zglckf.com 4598 www.CRTER.org 为50 g/L时纳米氧化锌的抑菌圈直径达到最大，提示 50 g/L时纳米氧化锌的抑真菌效果最佳，以后随着质量浓 度的提高，抑菌圈直径轻度下降。见表1，2。 3 讨论 近年来，随着广谱抗生素、皮质类固醇以及免疫抑 制剂的广泛应用，HIV感染、癌症化疗和器官移植引起 的免疫抑制等，特别是持续性免疫缺陷(如艾滋病、中性 白细胞减少)患者， 真菌感染率很高[12]，抗真菌药物在 临床上使用非常广泛。抗真菌药物的大量使用，导致真 菌的耐药性迅速发展[13]。白色念珠菌对于目前临床常用 有机抗菌剂产生了较广泛的耐药性，目前认为真菌的耐 药机制是细胞内药物浓度降低是真菌产生耐药的重要 机制，一方面是因为膜通透性降低使进入的药物减少， 另一方面细胞内的药物外排增强，近来研究表明，药物 外排增强为其主要原因。其次是药物的靶酶(主要是14-α 去甲基酶CYP51) 过度产生或发生突变，CYP51是真菌 麦角甾醇生物合成不可缺少的酶，在念珠菌中由ERG11 基因编码。另外可能是真菌细胞膜对抗真菌剂的通透性 下降，使药物不能进入真菌细胞内。也可能涉及甾醇去 饱和酶的失活。白色念珠菌生物膜的形成对耐药性的影 响[14]。 纳米氧化锌作为无机抗菌剂，与药物抗菌剂的作用 机制不同。目前关于纳米氧化锌的抗菌作用目前研究较 多的是两个方面，一是光催化原理[15]，由于纳米氧化锌 具有极强的表面效应，表面原子数与总原子数之比随着 纳米粒子尺寸的减小而大幅度的增加，粒子的表面能及 表面张力也随着增加，从而引起纳米粒子性质的变化； 同时纳米氧化锌的表面原子所处的晶体场环境及结合 能与内部原子有所不同，存在许多悬空键，并具有不饱 和性质，因而极易与其他原子相结合而趋于稳定，所以 具有很高的化学活性；另外，由于纳米氧化锌的比表面 积较大，表面的键态与颗粒内部的不同，表面原子配位 不全，这就导致表面活性位置增多，形成凸凹不平的原 子台阶，加大了反应接触面。空位在光催化反应中起重 表 1 纳米氧化锌抑菌圈直径 Table 1 The inhibition zone diameters of nano zinc oxide (mm) The diameter of drug sensitive slips is 6.00 mm Group 0 g/L 10 g/L 25g/L 50 g/L 75 g/L 100 g/L 1 6.00 6.00 8.52 11.50 7.82 8.02 2 6.00 7.23 8.64 10.58 9.24 8.88 3 6.00 7.12 8.00 8.06 7.56 7.36 4 6.00 7.56 7.86 8.00 7.90 7.58 5 6.00 7.15 7.96 9.44 8.87 7.93 6 6.00 6.47 7.76 9.65 9.05 8.64 Average 6.00 6.92 8.12 9.54 8.41 8.07 表 2 普通氧化锌抑菌圈直径 Table 2 The inhibition zone diameters of zinc oxide (mm) The diameter of drug sensitive slips is 6.00 mm Group 0 g/L 10 g/L 25g/L 50 g/L 75 g/L 100 g/L 1 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 2 6.00 6.00 6.34 6.46 6.48 6.58 3 6.00 6.00 6.00 6.08 6.12 6.34 4 6.00 6.08 6.16 6.00 6.10 6.18 5 6.00 6.02 6.10 6.00 6.12 6.20 6 6.00 6.00 6.08 6.12 6.10 6.18 Average 6.00 6.02 6.11 6.11 6.15 6.25 Figure 1 Antibacterial effects of nano zinc oxide and zinc oxide 图 1 纳米氧化锌与普通氧化锌抑菌效果 Nano zinc oxide 0 g/L 10 g/L 25 g/L 50 g/L 75 g/L 100 g/L Zinc oxide 0 g/L 10 g/L 25 g/L 50 g/L 75 g/L 100 g/L Figure 2 Antibacterial effects of nano zinc oxide and zinc oxide 图 2 纳米氧化锌与普通氧化锌抑菌效果 Horizontal ordinate: 100, 75, 50, 25, 10 (g/L) The concentration of nano zinc oxide (%) Nano zinc oxide Zinc oxide 12 10 8 6 4 2 0 0 1.0 2.5 5.0 7.5 10 Th e in hi bi tio n zo ne di am et er s (m m ) 何临海，等. 纳米氧化锌对白色念珠菌的抗菌作用 ISSN 1673-8225 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 4599 www.CRTER.org 要作用，在催化反应中，氧缺位越多，催化活性越高。 这些决定纳米氧化锌较强的氧化性，能氧化多种有机 物，从而将微生物杀死[16]。纳米氧化锌等光催化杀菌剂， 通常表现出超过传统抗菌剂(即仅能杀灭细菌本身)的性 能。对于纳米半导体，当粒子细化到纳米尺度时，产生 电子和空穴的氧化还原能力增强。受阳光和紫外线的照 射时，纳米氧化锌抗菌剂在有水分和空气存在的体系中 能自行分解并释放出自由电子(e．)，同时留下带正电的 空穴(h+)，生成的带羟基的自由基•OH和超氧化物阴离 子自由基•O2都非常活泼，化学活泼性很强，能与多种 有机物发生反应(包括细菌内的有机物及其分泌的毒素) 从而将微生物杀灭[17]。纳米氧化锌在阳光尤其是紫外线 照射下，具有极强的化学活性，能与大多数有机物(包括 细菌) 发生氧化反应，从而杀死大多数病菌和病毒[18]。 二是锌离子溶出原理，锌离子会逐渐的游离出来，当它 和细菌体相接触时，就会和细菌体内活性蛋白酶相结合 使其失去活性，从而将微生物杀死[19]。已有研究表明， 纳米二氧化钛对革兰阳性菌及革兰阴性菌均有抑制作 用，对真菌也有抑制作用[20]。 曲敏利等[4]的研究结果表明，纳米氧化锌对细菌的 抑菌半径是普通氧化锌的2倍以上，同时在有光的条件 下，纳米氧化锌的抑菌效果更佳。喻兵权等[7]利用细菌 活菌计数法和液体培养实验法研究结果表明，随着纳 米氧化锌质量分数的提高，菌落数都呈下降的趋势， 与马正先等[3]报道一致。随着纳米氧化锌质量分数的升 高，抑菌率增大趋势逐渐变缓，说明抑菌率和纳米氧 化锌的质量分数不呈线性关系。纳米氧化锌具有极强 的化学活性，能与多种有机物发生氧化反应(包括细菌 内的有机物)，从而发挥抗菌作用。马正先等[3]的研究 结果表明，随纳米氧化锌悬浮液浓度的增大，杀菌率 明显提高，说明杀菌效果越好。在同等条件下普通氧 化锌针对真菌无明显的抗菌作用，随着普通氧化质量 分数的提高，其抗菌作用亦无明显变化。本实验结果 说明，纳米氧化较普通氧化锌对白色念珠菌等真菌具 有良好的抗菌作用。 本实验用不同质量浓度纳米氧化锌的悬浊液抑制 白色念珠菌的生长，由实验结果可知纳米氧化锌对白色 念珠菌等真菌具有较好的抗菌效果。在一定浓度下，随 着纳米氧化锌质量浓度的提高，光催化作用及锌离子溶 出原理增强，二者之间也具有协同或相加作用从而发挥 更强的抗菌作用，但超过一定浓度后，纳米氧化锌的凝 聚作用也增强，使得局部锌离子浓度降低，反而影响了 抗菌作用的发挥，因此在质量浓度50 g/L时，其抗菌作 用较强，质量浓度更高之后其抗菌作用反而出现轻度的 下降。同时，随着纳米氧化锌质量浓度的提高，溶出的 锌离子和自由基的浓度也随之增加，达到一定质量浓度 之后锌离子及自由基达到局部饱和状态，其所发挥的抗 菌作用也达到最大。 普通氧化锌的抗菌作用不明显，其可能原因是普通 氧化锌不具有光催化作用，而锌离子溶出原理被白色念 珠菌的某个耐药机制所拮抗或消除，使得抗菌作用不明 显，这与以往研究关于普通氧化锌对细菌如大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌也具有抗菌作用的报道不符，这也显示 出白色念珠菌等真菌独特的耐药作用。 白色念珠菌对普通氧化锌具体的耐药机制不清 楚。李蓓等[21]添加纳米二氧化钛抗菌剂后，硅橡胶赝 复材料在体外具有抗白色念珠菌的作用。同时纳米氧 化锌在动物模型实验中是否具有良好的抗菌效果需进 一步研究。Adams等[22]认为纳米二氧化钛在无光照时 仍能发挥一定的抗菌作用。纳米氧化锌在模拟口腔环 境、厌氧、避光条件下是否具有较好的抗菌作用有待 进一步实验。 致谢：感谢兰州大学口腔医学院对本课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 的大力支 持，感谢兰州大学物理科学与技术学院磁学与磁性材料 教育部重点实验室胡占江同学提供纳米氧化锌材料，感 谢兰州大学基础医学院免疫学实验室的马兴铭老师对 本实验的悉心指导。 4 参考文献 [1] Sui. 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