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临床生化检验参考方法及其主要分析原理 2OO7年 3月第 30卷第3期 Chin J Lab Med,March 2007,Vol 30,N~3 临床生化检验参考方法及其主要分析原理 陈文祥 申子瑜 杨振华 【摘要】 介绍临床生化检验参考方法的作用、特性和目前生化检验参考方法的主要分析原理, 为参考方法建立和应用工作提供参考。参考方法是参考系统的关键组成部分 ,是临床检验标准化的 重要基础。参考方法需具有明确的、符合特定要求的测量不确定度 ,因而需基于可靠测量原理。对于 有机小分子生化检验项目,其参考方法一般基于仪器分析原理,其中的同...

临床生化检验参考方法及其主要分析原理
2OO7年 3月第 30卷第3期 Chin J Lab Med,March 2007,Vol 30,N~3 临床生化检验参考方法及其主要分析原理 陈文祥 申子瑜 杨振华 【摘要】 介绍临床生化检验参考方法的作用、特性和目前生化检验参考方法的主要分析原理, 为参考方法建立和应用工作提供参考。参考方法是参考系统的关键组成部分 ,是临床检验 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 化的 重要基础。参考方法需具有明确的、符合特定要求的测量不确定度 ,因而需基于可靠测量原理。对于 有机小分子生化检验项目,其参考方法一般基于仪器分析原理,其中的同位素稀释质谱(ID/MS)原理 在理论上最为可靠,是目前国际上所主要采用的参考方法分析原理。但 ID/MS分析成本高,其他仪 器分析原理可能也将在临床检验标准化中发挥重要作用。 【关键词】 参考方法; 同位素稀释质谱 RefeHm0e methods and reference measurement principles in clinical biochemistry CHEN Wen- xiang,SHEN -yu,YANG Zhen-hua.National Center for a n Laboratories,Beijing Hospital,Be ng 100730,China 【Ab~ract】 Characteristics and measurement principles of reference methods in clinical biochemistry were described.Implementation of roference systems is one of tlle most effective approaches to improve tlle accuracy and comparability of clinical laboratory test results.Reference methods are tlle key components of reference systems.Reference method s should have measurement uncertainties tllat meet tlle requirements of the intended use,and thus should be based on reliable measuroment principles. For the wel1.defined biochemistry analytes.reference metllods have been almost all based on instrumental analysis. Isotope dilution nlass spectrometry(ID/MS)is considered most reliable and has been the major analytical principle of the reference methods.ID/MS analysis is accurate but expensive.Use of Otller validated instrumental analylms 8,8 reference measurement principles would be iustifled. 【Key words】 Reference method; Isotope dilution mass spectrometry . 述 评 . 小分子生化检验项 目是一类重要临床检验常规项 目,包括代谢物类和非肽激素类等。本期杂志发表 3 篇同位素稀释质谱(ID/MS)分析有机小分子检验项目的研究报告,分别是同位素稀释气相色谱质谱(ID. GC/MS)测定血清胆固醇 和血清孕酮 及同位素稀释液相色谱质谱(ID.I.E/MS)或同位素稀释液相色谱 串联质谱(ID-LC/MS/MS)测定血清胆固醇 。ID/MS是公认的最可靠的分析原理之一,上述研究报告将 ID/MS原理用于血清胆固醇和孕酮测定,建立的方法特异、精密,可望用作血清胆固醇和血清孕酮的参考方法。 近年来检验结果的准确性和可比性受到重视,提高和保证检验结果准确性和可比性的有效手段是开展 量值溯源工作,而检验量值溯源的基础是参考系统。临床检验参考系统包括参考方法、参考物质和参考实验 室 ,其中参考方法是关键,因参考物质需由参考方法定值,参考实验室是运行参考方法的实验室。 参考方法的定义是,经过充分研究的方法,其测量值的测量不确定度适合其预期用途,尤其在评价其他 方法的准确性和鉴定参考物质方面的用途。 由上述定义可见,临床检验参考方法的主要作用是建立和评价常规方法的准确性。临床检验方法分参 考方法与常规方法,是由临床检验的特殊性决定的。临床检验与某些领域的化学检验或测量不同,临床检验 样品高度复杂,样品量有限,样品数 目巨大,时效要求高。因此,发展和应用微量、简便、易自动化的方法(常 规方法),是临床检验过去几十年发展的重要特征。常规方法的优势及临床实验室应用常规方法的必要性 是显而易见的,但也确实在有些情况下常规方法结果缺乏足够的准确性和可比性。原因可能有两方面,一方 面是方法的多样化,一项检验指标可以有多种方法(原理),同一种方法又有多种试剂盒;另一方面,某些方 基金项目:863 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 资助项 目(2006AA020909) 作者单位:100730卫生部北京医院 卫生部临床检验中心 维普资讯 http://www.cqvip.com 2007年3月第 30卷第 3期 Chin J LabMed,Mar Q ! Q 法实现简便性的同时在一定程度上降低了可靠性,主要表现为校准f.7题和分析干扰的易感性增加。不可能, 也不应该要求使用同一种常规方法进行临床检验,实现检验结果准确可比的国际共识是使不同方法给出一 致的检验结果,一是要使新的常规方法准确,二是要判断现有常规方法是否准确,或取舍,或改进。建立和评 价常规方法准确性的手段即直接或间接(通过参考物质)与参考方法对比。 由上述定义还可以看出,参考方法与常规方法的区别在于测量不确定度,但不确定度在很大程度上由测 量原理决定。对于有机小分子临床检验项目,常规方法多基于酶化学或免疫化学分析原理。以血清胆固醇 测定为例,一种 目前常用的胆固醇测定常规方法L8 的原理是,用胆固醇酯酶水解血清胆固醇酯,用胆固醇氧 化酶氧化胆固醇为胆甾烯酮同时生成过氧化氢,用过氧化物酶使过氧化氢与某些化学物质反应生成有色物 质,此有色物质多少与血清总胆固醇浓度成比例关系。上述各种酶和化学物质组成单一试剂,胆固醇测定只 需将样品与试剂混合、温育和比色分析,非常简便。但在分析意义上,此种简便的酶法有以下不足或可能影 响因素。首先在校准方面,酶法校准物需作仔细选择和定值,因酶试剂对血清和所选校准物的作用能力可能 会有不同,若定值不当,可引起校准偏差 ;在特异性方面,酶试剂不仅作用于胆固醇,也作用于血清中的非 胆固醇甾醇 。。,如植物甾醇;在分析干扰方面,酶法中的显色反应和比色分析受血清中还原物质、有色物质 及乳糜微粒等的干扰 J。另外,酶试剂中各种酶的性能直接影响检验结果的可靠性 ¨ ,而酶作为一种复杂 的生物物质,其性能或性质的鉴定比一般化学物质困难许多。 临床生化检验参考方法可基于多种分析原理,但与常规方法不同,一般基于仪器分析原理。一种简单的 参考方法原理是分光光度法。再以胆固醇为例。国际影响最大的血清胆固醇测定参考方法是美国CDC改 良的Abell-Kend~U(AK)化学法 ,此法用氢氧化钾水解血清胆固醇酯,用正 己烷提取胆固醇,用化学试剂 使胆固醇显色,用分光光度法测定胆固醇。此法的化学水解和正己烷提取,使胆固醇有效纯化,很大程度上 消除了其他血清物质的干扰,也可直接用一级参考物质校准,因此 AK法比酶法影响因素少,更加可靠。但 在分析化学上,此法仍有两点不足,一是正己烷提取和所采用的显色反应的特异性有限,不能消除结构和性 质与胆固醇相似的非胆固醇甾醇的干扰;二是关键步骤多,方法中的样品量取、提取溶剂加入、提取液转移、 显色剂加入、显色温度和时间控制等都影响分析结果。尽管如此,此法相对简便、快速,而且血清中非胆固醇 甾醇含量一般很低,各关键步骤可用高精度器具完成,因此此法具有能满足其预期用途的准确度和精密度。 此法的偏倚约 1.5%D3/,能实现的变异系数(cv)小于 l%。以分光光度法作参考方法或推荐参考方法的检 验项目还有葡萄糖 、胆红素 引、尿素 、甘油三酯 等,但这些方法有的已不常用或被更可靠的方法取代。 另一种简单的参考方法原理是色谱法。色谱法是一种分离分析技术,故一般具有较高的特异性。还以 胆固醇为例,我国曾建立基于 HPLC原理的胆固醇测定候选参考方法[17-1S]。此法同样采用化学水解和正己 烷提取,但在两方面优于AK法,一是色谱过程使胆固醇与其他甾醇分离,消除了绝大部分非胆固醇甾醇的 干扰;二是内标的使用使方法的关键步骤大大减少。此法未见明显的干扰因素,目前能实现的 CV一般小于 0.5%。但此法也有不准确因素,例如,内标与胆固醇结构不同,两者在样品制备过程中的行为可能有一定区 别;内标与胆固醇的色谱保留时间不同,色谱过程的某些因素(如流动相流速、检测器信号等的稳定性)对两 者的作用可能不同;方法的特异性仅依赖于色谱过程,不能排除与胆固醇或内标保留时间相同的物质的干 扰。这些因素,若方法设计严密,对结果的影响一般很小或检测不到,但在理论上有可能存在。气相色谱也 曾用于胆固醇候选参考方法Dg],HPLC还曾用于肌酐推荐参考方法 ]。 一 种更可靠的分析原理是本文开始提到的ID/MS。所谓同位素稀释,即以同位素标记的被测物作内标, 如本期杂志的上述研究报告中,以[3,4_13C:]-胆固醇作血清胆固醇测定的内标n ],以[3,4.¨C:].孕酮作血 清孕酮测定的内标 。由于内标与被测物有相同或非常接近的理化性质和行为,内标与被测物一旦充分混 合,两者的比值基本不受其他因素(如上述 HPLC分析样品制备和色谱过程中的各种因素)的影响。因此同 位素稀释分析是内标法定量的理想情况,其特点是精密度高。同位素稀释分析一般需通过质谱实现(其他 分析技术很难区分内标和被测物)。质谱分析是使物质分子在一定能量作用下按一定规律形成质量不等的 多种离子,再使各种离子在磁场或电场作用下按质量电荷比(质荷比,m/z)排列并测量其强度的过程。在一 定条件下,不同物质的质谱不同,有些离子是某种物质特有的,因此质谱分析具有较高的特异性。利用质谱 进行定量分析,通常选择某种离子,测量其强度(丰度)。在ID/MS分析中,一般选择分别来自被测物和内标 维普资讯 http://www.cqvip.com 2007年 3月第3O卷第 3期 Chin J Lab Me(t,March 2007,Vol 30~No.3 的一对离子,进行测量,通过两者丰度的比值计算待测物浓度。选择检测离子的原则,首先是所选离子为待 测物(及其内标)所特有,一般质量数较大的有关离子特异性较好,因不同物质可产生相同的小m/z碎片离 子;其次是离子丰度较高。例如,ID—GC/MS测定胆固醇H 、孕酮 及ID—LC/MS测定胆固醇 时,分别选择 m/z 368(内标 nl//z 370)、m/z 510(m/z 512)及m/z 399(m/z 401)等作检测离子。 质谱分析同样需要对被测物作足够的纯化,否则有可能引起分析干扰。色谱是有效的分离纯化手段,因 此色谱质谱联用技术逐渐成为有力的分析3-具,目前有机小分子检验项目的ID/MS分析几乎都采用色谱质 谱联用技术。气相色谱质谱联用(GC/MS)出现较早,20世纪70年代早期 已开始用于临床检验参考方法。 GC/MS的优势是,两者连接容易(色谱流出物是气体,向质谱所要求的真空过渡相对容易),技术成熟,性能 稳定,现代毛细管气相色谱也具有强大的分离能力,因而较易实现分析的特异性。GC/MS的不足是,它要求 待测物具有足够的挥发性和热稳定性,因而需对待测物进行衍生,样品制备过程复杂。例如,在胆固醇测定 中需将胆固醇衍生为三甲基硅醚⋯,在孕酮测定中需将孕酮转化为七氟丁酸酯衍生物[2 J;又如,在 GC/MS 测定血清肌酐 中,不仅需对肌酐进行衍生,还需在衍生前用离子交换技术去除肌酸,因肌酸和肌酐给出相 同的衍生物。液相色谱质谱联用(LC/MS)相对困难,但近年 LC/MS技术逐渐成熟。LC/MS的优点是对待 测物性质一般无特殊要求,样品制备简单。再以肌酐测定为例,用 LC/MS测定肌酐 j,可简单提取肌酐后 直接进行分析,无需进行 GC/MS所要求的纯化和衍生。但有时出于检测灵敏度和特异性考虑,LC/MS分析 也需对待测物进行衍生或处理p 。 在色谱质谱联用中,为了进一步提高特异性,可采用串联质谱技术。串联质谱多见于液相色谱质谱联 用,因液相色谱的分离能力较低(相对于毛细管气相色谱)。一种常用的液相色谱串联质谱(LC/MS/MS)的 检测模式是多级反应监测(MRM)模式,其工作原理是,待测物在离子源形成离子,第一级质谱分离待测物离 子(前体离子或母离子),使之在惰性气体碰撞下裂解,生成碎片离子(产物离子或子离子),第二级质谱分离 产物离子。在 MRM模式下,被检测的是前体离子’÷产物离子转变,如在 LC/MS/MS测定胆固醇口 中的m/z 399--+m/z 381转变,不同物质离子的裂解规律不同,若前体离子可能受其他物质干扰,产物离子仍受干扰的 可能性则会降低,因而 MRM具有比单级质谱更高的特异性。 ID/MS分析的定量方法类似于色谱分析中的内标法。在以内标法定量的色谱分析中,一般向校准物和 样品中加入等量内标,分析后将校准物的待测物/内标信号比对校准物浓度进行线性回归,用回归方程计算 样品的待测物浓度。但在 ID/MS分析中,由于天然同位素的存在,内标信号中会包含一部分待测物,使待测 物/内标信号比与待测物浓度的关系偏 离线性。以胆固醇为例,胆固醇分子(C钾H46 O)的组成元素存在 ⅡC、 H 17O和埔O等天然同位素,其丰度分别为 1.10%、0.015%、0.04%和0.20%,由于它们的存在,胆固醇 可以有386、387、388和389等不同相对分子质量,不同相对分子质量胆固醇的比例可根据天然同位素丰度 计算,若相对分子质量386的胆固醇按 100计,其他3种胆固醇分布分别为29.8、4.5和0.4。若以[3,4一” C:]一胆固醇(相对分子质量388)作胆固醇测定的内标,则约4.5%的胆固醇表现为内标信号,使胆固醇/内标 比与浓度的关系偏离线性。因此,ID/MS分析中常采用的定量方法是包括法,其一般做法是,向样品中加入 适量内标,使待测物/内标比约为 1:1,制备两个校准物,使其中一个的待测物/内标比略低于 1:1,另一个略 高于1:1,利用小浓度范围内的近似线性关系对样品进行定量。这种方法定量准确,也可有效避免样品间的 可能携带污染,本期杂志的孕酮测定 研究即采用此种定量方法。但包括法需预先知道各样品大致浓度, 样品制备过程也非常繁琐。本期杂志的胆固醇测定【1.3j,采用修正标准化曲线法定量,此法比较新颖,其特点 是简便,可能会在ID/MS分析中有一定应用。 ID/MS被认为是最可靠的测量原理之一,国际计量委员会(CIPM)的物质量咨询委员会(CCQM)将 ID/ MS与库仑法、重量法等一起列为一级(或基准)测量原理。临床检验参考方法广泛应用同位素稀释质谱原 理,在“检验医学溯源联合委员会”(JCTLM)2006年2月公布的国际临床检验参考方法列表中,有机小分子 检验项 目57种参考方法的52种基于同位素稀释质谱原理(见http://www.bipm.org/jcflm/)。临床检验领 域 ID/MS分析曾主要采用 GC/MS技术,但最近几年,随着有关技术的成熟,更由于其简便性,LC/MS或 LC/ MS/MS在临床检验参考测量中被迅速采用 圳 。 值得指出的是,ID/MS的可靠性勿容置疑,但其仪器、试剂和运行成本很高。ID/MS的特异性也是相对 维普资讯 http://www.cqvip.com · 248· 2007年 3月第 30卷第 3期 Chin J LabMed,March 2007,Vol 30,Nn 3 的、有条件的,其特异性的实现同样有赖于仔细的方法设计和验证。另外,质谱检测本身的精密度,至少对于 目前常见市售色谱质谱仪器,可能尚低于某些常用色谱检测(如紫外检测)的精密度。本期杂志报告的 GC/ MS和 LC/MS/MS测定胆固醇 的CV略高于HPLC法目前所能达到的CV。 总之,建立和应用参考方法是临床检验标准化的有效途径。参考方法需具有明显低于常规方法的测量 不确定度,低不确定度的实现有赖于可靠测量原理的应用。对于有机小分子生化检验项目,其参考方法一般 基于仪器分析原理,其中的ID/MS原理在理论上最为可靠,是目前国际上所主要采用的参考方法分析原理。 但ID/MS分析成本高,其他仪器分析方法,在其可靠性得到充分论证的情况下,应仍将在临床检验标准化中 发挥重要作用。 参 考 文 献 [1]张江涛,胡翠华,张传宝,等.同位素稀释气相色谱质谱法测定血清总胆固醇.中华检验医学杂志,2007,30:260-263. 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