下载
加入VIP
  • 专属下载特权
  • 现金文档折扣购买
  • VIP免费专区
  • 千万文档免费下载

上传资料

关闭

关闭

关闭

封号提示

内容

首页 实验二 双水相萃取α淀粉酶分配平衡

实验二 双水相萃取α淀粉酶分配平衡.doc

实验二 双水相萃取α淀粉酶分配平衡

无心的人a
2017-09-19 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《实验二 双水相萃取α淀粉酶分配平衡doc》,可适用于项目管理领域

实验二双水相萃取α淀粉酶分配平衡实验二双水相萃取α淀粉酶的分配平衡实验一、实验目的与要求)掌握双水相萃取技术的基本原理和主要影响因素。)了解目标产物的性质如等电点、电荷和分子量等。)掌握熟悉聚乙二醇(PEG)硫酸铵体系双水相萃取实验操作。)明确PEG分子量、硫酸铵浓度、pH和添加NaCl等因素对α淀粉酶分配系数的影响。二、实验器材和试剂实验器材:低速离心机酸度计涡流混合器分光光度计实验试剂:PEG:(分子量分别为、、、、)、硫酸铵、α淀粉酶、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、考马斯亮蓝G三、实验原理双水相萃取技术在萃取胞内酶中应用广泛最常采用的双水相体系是PEGDex或PEG低分子盐系统其中低分子盐最常采用的是硫酸铵、磷酸钾和硫酸镁。PEG磷酸钾双水相体系相图如上所示。T为上相浓度B为下相浓度,C为系统临界点TCB为临界线或双节线双节线以上为两相区、以下为一相区或均相区。因此两相浓度要足够高才可以形成两相。双水相萃取分配系数K=CC为上相和下相的浓度比。tb双水相系统分配系数的影响因素包括系统本身的因素如系统组成、聚合物分子量、聚合物浓度、盐和离子强度、pH等以及目标产物的性质如疏水作用、电荷、等电点和分子量等。利用双水相技术可以获得特定蛋白质和生物大分子的最适宜分离的相系统和最优分配。相图中TMB为系线其长度由相组成的总浓度决定表征两相差异程度。在临界点附近系线长度趋近于零表示上相和下相的组成相同因此分配系数应为。随着PEG、硫酸铵和盐浓度增大系线长度增加上相和下相相对组成的差别就增加酶在两相中的分配系数会受到极大的影响。本实验采用PEG硫酸铵双水相体系研究α淀粉酶的分配具体研究PEG分子量、硫酸铵浓度、pH和添加NaCl浓度对α淀粉酶分配系数的影响。参考:淀粉酶是广泛应用的生物酶类BSubtilis细菌α淀粉酶是研究和应用较多的α淀粉酶其分子量为KDPI约为最适pH在pH之间稳定。四、实验步骤PEG硫酸铵双水相体系相图绘制(全班都做)配制PEG和硫酸铵原液(没有混合前的液体混合后浓度是相图中最终浓度)分别取gPEG、、、原液(PEG、、密度分别为gmL、gmL、gmL、因此加入g对应体积分别为mL、mL、mL、mL)加入mL水按图流程绘制相图按表记录数据。注意少量多次加入硫酸铵原液系统出现浑浊时记录加入硫酸铵体积计算重量(硫酸铵原液密度为gmL),再加入适量水使体系变澄清计量加入的水再加硫酸铵使系统再次变混浊如此反复操作原液冰箱放置。将数据记录到表中计算系统混浊不同时刻PEG和硫酸铵在系统中的质量百分浓度(或质量体积百分比)绘制PEG和硫酸铵的双水相相图。第组同学做PEG分子量的相图第、、组分别做PEG分子量、和的相图。PEGHOHO记录gml(NH)SO混和ml(NH)SOml数混均浑浊澄清旋涡器图PEG硫酸铵双水相相图绘制流程表PEG硫酸铵双水相体系相图绘制数据次HO加量(NH)SO溶液加量纯(NH)SO溶液累计PEGO()(NH)SO()数(g)累计量(g或mL)总量(g或mL)(mL)(g)不同PEG分子量对双水相萃取α淀粉酶分配系数的影响(第组)按图流程配制PEG、、和和硫酸铵原液混合后双水相体系为PEG(gmL)硫酸铵(gmL)。分别取mLPEG和硫酸铵原液各份一份做上下相空白样加入mL水另一份加入mL淀粉酶用于双水相分配)置于mL刻度离心管中轴向充分混合rmin离心min读出上下相体积计算相比。小心吸取上相mL,加入mL考马斯亮蓝测定nm下的吸光度A值。移去上相弃去相界面处液体和少量下相小心吸取下相mL,加入mL考马斯亮蓝测定nm下的吸光度A值。添入表计算分配系数,绘制趋势图。(实验、、、步骤均采用此方法测定上下相吸光度值根据蛋白浓度标准曲线方程计算出酶浓度)标准曲线方程Y=XPEG淀粉酶(NH)SOmLmlmL求相比mL水R=VV上下ml刻度离心试管求蛋白质离心分配系数振摇混和转分K=CC上下(固体溶解)min台称总重mL图不同变量对双水相萃取α淀粉酶分配系数影响操作流程表不同PEG分子量对双水相萃取α淀粉酶分配系数的影响分子量(D)上相酶吸光度上相酶浓度下相酶吸光度下相酶浓度分配系数(添加不同浓度NaCL对双水相萃取α淀粉酶分配系数的影响(第组)分别取mLPEG和硫酸铵原液份按表加入不同NaCl浓度后空白样加入mL蒸馏水样品加入mL淀粉酶置于mL刻度离心管中轴向充分混合rmin离心min读上下相体积计算相比。按步骤测定上下相中淀粉酶吸光度按标准曲线计算浓度和α淀粉酶分配系数。表添加不同浓度NaC时α淀粉酶分配系数NaCl浓度ww上相酶吸光度上相酶浓度下相酶吸光度下相酶浓度分配系数l(g)(g)(g)(g)不同硫酸铵浓度对双水相萃取α淀粉酶分配系数的影响(第组)表不同硫酸铵浓度对α淀粉酶分配系数硫酸铵浓度gmL上相酶吸光度上相酶浓度下相酶吸光度下相酶浓度分配系数取mLPEG份按表分别加入不同浓度硫酸铵原液各份空白样加入mL蒸馏水样品加入mL淀粉酶置于mL刻度离心管中轴向充分混合rmin离心min读上下相体积计算相比。按步骤测定上下相中淀粉酶吸光度按标准曲线计算浓度和α淀粉酶分配系数。不同pH值对双水相萃取α淀粉酶分配系数的影响(第组)取mLPEG份按表分别加入不同pH值含硫酸铵原液各份空白样加入mL蒸馏水样品加入mL淀粉酶置于mL刻度离心管中轴向充分混合rmin离心min读上下相体积计算相比。按步骤测定上下相中淀粉酶吸光度按标准曲线计算浓度和α淀粉酶分配系数。对于PEG(gmL)硫酸铵(gmL)体系按表记录不同pH值时α淀粉酶分配系数。表不同α淀粉酶浓度时α淀粉酶分配系数pH值上相酶吸光度上相酶浓度下相酶吸光度下相酶浓度分配系数五、实验注意事项(加完物料后必须将离心试管沿轴向充分振摇直至固体全部溶解。上下相分离时注意吸管小心吸出上相将多余上相和少量下相弃去换吸管吸出下相。六、思考题(常用双水相体系有哪些,(双水相体系形成的过程,(双水相体系形成的原因,(分析PEG分子量、浓度、pH、添加NaCl和酶浓度等因素对α淀粉酶分配系数的影响。穿实验服、预习实验、不要大声喧哗。下午一点半个班同时到实验室班在,班在统一在讲解后分别做实验。每组任务:相图一个变量对分配系数的影响组分别做步骤、、、为避免分光光度计使用时间冲突每班第组先做变量影响每分钟后轮换下一组使用。每组选组长领药品实验结束后洗干净交回。每班第组值日。签到后检查无误给成绩。准备试剂:(个班)PEG、、和各mLL。(试剂瓶装每个瓶)硫酸铵原液mL,每组分成个小试管分装每管mL。硫酸铵原液Ml,每组分成个小试管分装每管mL。pH值分别为、、、的磷酸盐缓冲液mL(用于配硫酸铵原液每组各mL,共组)NaCl浓度g、g、g、g各份,共组。考马斯亮蓝GmL,每组mL(mg考马斯亮蓝、磷酸Mml乙醇mL,定容至L)α淀粉酶mL(每组份每份mL装在mL离心管中)、、、硫酸铵各mL(每组各mL)玻璃器皿:(按每组算全班组)每组小试管=个。不足可以用mL离心管代替。每组移液管mL、mL各个每组洗耳球个试管架(铝个黄色大试管架个)mL刻度离心管每组个。比色皿每组个每班轮流使用。胶头滴管个。mL量筒个。仪器设备:低速离心机、分光光度计、电子天平各台

用户评价(0)

关闭

新课改视野下建构高中语文教学实验成果报告(32KB)

抱歉,积分不足下载失败,请稍后再试!

提示

试读已结束,如需要继续阅读或者下载,敬请购买!

文档小程序码

使用微信“扫一扫”扫码寻找文档

1

打开微信

2

扫描小程序码

3

发布寻找信息

4

等待寻找结果

我知道了
评分:

/7

实验二 双水相萃取α淀粉酶分配平衡

VIP

在线
客服

免费
邮箱

爱问共享资料服务号

扫描关注领取更多福利