重组腺伴随病毒载体介导的hEPO转移及表达

ISSN 0582-9879 生 物 化 学 与 生 物 物 理 学 报 ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYS ICA S INICA 2002, 34( 2) : 176- 180 CN 31-1300/ Q 收稿日期: 2001-09-10 接受日期: 2001-11-02 国家/ 8630高科技发展计划基因治疗重大关键技术资助项目 ( No. 863-Z20-05-02) * 联系人: T el, 010-63581302; e-mail, w uxb0168@ sina. com 重组腺伴随病毒载体介导的 hEPO转移及表达 伍志坚 吴小兵* 王 宏 卢 斌 董小岩 侯云德 ( 中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室, 北京 100052 ) 摘要 为实现人促红细胞生成素( human erythropoietin, hEPO)基因在体内的持续表达, 构建了携带 hEPO 的重 组腺伴随病毒( recombinant adeno-associated virus, rAAV)载体质粒, 建立了稳定携带 hEPO 表达盒的 rAAV 载体细 胞株, 采用/一种辅助病毒感染一个载体细胞株0的 rAAV 生产策略, 制备并纯化了携带 hEPO 的 rAAV ( rAAV- hEPO)。结果表明, rAAV 介导的 hEPO 转移能够使 hEPO 在培养的 BHK-21 细胞中得到有效表达; 用 rAAV- hEPO 对 Balb/ c小鼠进行一次肌肉注射, 可使 hEPO在小鼠体内持续表达 10周以上, 并可明显升高小鼠的红细胞 比容。 关键词 重组腺伴随病毒; hEPO; 基因转移; 基因治疗; 载体 人促红细胞生成素 ( human erythropoiet in, hEPO)是主要产生于肾脏的一种具有激素功能的生 长因子, 它作用于骨髓红系造血前体细胞, 维持其 存活并促进其增殖、分化, 从而促进红细胞的生 成、保持血液循环中的红细胞数量达到生理水平。 采用基因工程技术已成功实现了 hEPO的体外高效 表达。真核细胞表达的 hEPO产品在人体内的半衰 期约为 8~ 9 h, 对于肾性贫血的患者, 在临床上需 要反复注射才能维持疗效。这样的疗法价格昂贵, 有待改进。 采用重组腺伴随病毒( recombinant adeno-asso- ciated virus, rAAV)作载体进行的基因治疗有可能 克服常规疗法的弊端。rAAV 的安全性好, 其介导 外源基因长期表达的特点已为多个实验室所证 实[ 1, 2]。然而长期以来, rAAV 难以大规模制备一 直阻碍着其研究及应用的进程。最近, 本实验室成 功地建立了一种新型的 rAAV 生产及纯化方 法[ 3~ 5] , 该方法简便、高效、适合大规模生产。为 制备携带 hEPO 的 rAAV、探讨 rAAV 介导的基因 转移能否实现在体内的长期稳定表达 hEPO, 我们 进行了以下研究。 1 材料和方法( Materials and Methods) 1. 1 质粒、病毒及细胞株 含 hEPO cDNA(带有信号肽)的质粒 pGEM-3zf (- )-hEPO 为本室保存; 通用型 rAAV 载体质粒 pSNAV 的构建见文献[ 6] ; 具有 AAV 复制和包装 功能的辅助病毒 HSV1-rc/ $U L2 的产生见文献 [ 3] , 在金黄地鼠胚胎肾细胞 BHK-21(购自 ATCC) 上传代。表达绿色荧光蛋白的 rAAV ( rAAV- GFP ) 的制备、纯化见文献[ 4, 5]。 1. 2 质粒的抽提、酶切及 DNA 片段的回收、连 接、转化 参照 Sambrook等[ 7]的方法进行。 1. 3 细胞转染 BHK-21 接种于含 10% 胎牛血清 (购自 Hy- Clone 公司)的 RPMI 1640 培养液中, 37 e 、5% CO2的环境中培养至 50% ~ 60%汇合。DNA 对细 胞的转染按 LipofectAM INE 转染试剂盒 ( Gibco/ BRL 公司) 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 提供的方法进行。24 h后, 换用 含 G418(终浓度为 800 mg/ L)的 RPM I 1640培养 液培养, 直至 10 d后出现阳性克隆。收集阳性克隆 并扩大培养。 1. 4 hEPO的测定 hEPO 的定量检测采用 Boehringer M annheim 公司 ELISA 检测试剂盒( Cat . No. 1693417)进行, 吸光度的测定在 Bio-Rad酶标仪(型号 550)上进行。 根据试剂盒提供的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品及其吸光度值, 采用 CurveExpert3. 1软件绘制标准曲线, 并根据样品的 吸光度值计算出样品的 hEPO浓度。 1. 5 rAAV的制备、纯化及滴度测定 参照文献 [ 4] , rAAV- hEPO 的制备在转瓶 (110 mm @ 240 mm)中进行。纯化方法参见文献 [ 5] , 滴度测定采用点杂交方法进行[ 8]。 1. 6 rAAV介导的基因转移 1. 6. 1 rAAV的体外转导 分别用 rAAV- hEPO 以不同的 MOI 感染 6孔培养板中的 BHK-21细胞, 病毒吸附 1 h 后, 洗去, 换成无血清 1640培养液继 续培养至 24 h。取上清, 进行 hEPO 的定量测定。 1. 6. 2 rAAV 的体内转导 ( 1) rAAV- GFP 对 小鼠骨骼肌的体内转导 用纯化的病毒颗粒数约为 5 @ 1010个的 rAAV- GFP 注射 6~ 8周龄雄性 Balb/ c 小鼠(购自协和医科大学实验动物中心)的股四头 肌, 定期处死小鼠, 取注射区肌肉组织, 做冰冻切 片, 在激光共聚焦显微镜下观察 GFP 的表达。( 2) rAAV- hEPO 在小鼠体内的表达 6~ 8周龄的雄性 Balb/ c小鼠共 30只, 随机分成 2组, 每组 15只。 在实验组中, 将 5 @ 1010个病毒颗粒的 rAAV- hEPO 注射小鼠股四头肌。对照组采用等体积 PBS2+ (含 有 Ca2+ 、Mg2+ 的 PBS)注射。每组分别于注射后 2 周、4周、6周、8周、10周各处死 3只小鼠, 取全 血, 肝素抗凝。红细胞比容的测定采用常规方法进 行。抗凝血经 1 500 r/ min 3 min 去细胞后, 用 ELISA试剂盒测定小鼠血清中的 hEPO含量。 2 结果( Results) 2. 1 携带 hEPO的 rAAV载体质粒的构建(图 1) 用 XbaI 和 BamHI 将 hEPO 基因 cDNA从 pGEM-3zf( + )- hEPO 质粒上切下, 装载到通用型 rAAV载体质粒 pSNAV 的 Sal I 和 Bgl II 位点, 构 建成的重组质粒命名为 pSNAV- hEPO。酶切鉴定 的结果表明该重组质粒的结构是正确的(图略)。 2. 2 携带 hEPO表达盒的 rAAV的产生 2. 2. 1 携带 hEPO 表达盒的 rAAV 载体细胞株的 建立 用 LipofectAM INE 将 pSNAV- hEPO 转染 BHK-21细胞, G418 选择培养两周形成抗性克隆 后, 扩大培养, 成为携带 hEPO 表达盒的 rAAV 载 体细胞株, 命名为 BHK/ AV- hEPO。采用 ELISA 试剂盒, 检测到该细胞株每个细胞每天 hEPO的表 达量为 19. 4 @ 10- 9 IU , 而阴性对照 BHK-21 细胞 株上清未测到 hEPO 的表达。该结果说明载体细胞 株 BHK/ AV- hEPO 能够有效地产生 hEPO, 即以 CM V 启动子控制hEPO 表达盒的构建是成功的。 2. 2. 2 采用/一种病毒感染一个载体细胞株0的策 略生产 rAAV- hEPO 采用已报道的/一种病毒 感染一个载体细胞株0的 rAAV生产策略[ 3~ 5] , 将 Fig. 1 Map of pSNAV- hEPO Fig. 2 Detection of the purity of rAAV- hEPO by Coomassie brilliant blue stained SDS-polyacrylamide gel electrophoresis 1, standard protein marker ( Promega) ; 2, VP1, VP2, VP3 from purified rAAV- hEPO . Fig. 3 GFP expression in muscle of Balb/ c mouse af ter rAAV- GFP transduction (A) Tw o w eeks after transduct ion; ( B) Five months af ter t ransduc- t ion. 177Mar. , 2002 伍志坚等: 重组腺伴随病毒载体介导的 hEPO 转移及表达 Table 1 hEPO secretion of BHK-21 cells infected with rAAV- hEPO rAAV- hEPO for infect ion ( part icles) Secretion of hEPO in supernatant ( mIU) 0 0 2. 5@ 109 16. 8 2. 5@ 1010 30. 2 BHK/AV- hEPO 细胞置于转瓶中 ( 110 mm @ 240 mm)扩大培养, 待长满后用具有 AAV 复制和包装 功能的辅助病毒 HSV1-rc/ $U L2 感染 ( MOI 为 0. 1)。对 rAAV- hEPO 进行分离、浓缩和纯化后, 用 SDS-PAGE 检测其纯度, 结果如图 2所示。代表 rAAV 外壳蛋白 VP1、VP2和VP3的 3个特征性条 带非常清晰, 其间的杂蛋白质含量非常少, 经凝胶 扫描图象分析, 杂蛋白质含量< 5% , 即 rAAV- hEPO 的纯度> 95%。用点杂交测定了 rAAV- hEPO 的滴度, 经计算, rAAV- hEPO 的滴度达到 每毫升 0. 5 @ 1012个病毒颗粒数, 一个转瓶所生产 的 rAAV- hEPO 总量为 0. 5 @ 1013个病毒颗粒数。 2. 3 rAAV介导的 hEPO 在 BHK-21细胞中的表 达 rAAV- hEPO 以不同的 MOI 感染 6孔板中的 BHK-21细胞, 至感染后 24 h, 每孔 hEPO 产量见 表 1。与对照(未经 rAAV- hEPO 感染)相比, 经过 rAAV- hEPO 感染的 BHK-21 细胞均低水平分泌 hEPO, 说明 rAAV- hEPO 可以介导 hEPO 在体外 培养的 BHK-21细胞中表达。hEPO 表达水平较低 的原因可能在于, rAAV 感染细胞后, 在 24 h 内由 于绝大部分病毒的单链 DNA 尚未能转变成双链, 因此延迟了进一步的转录和翻译的过程。 2. 4 rAAV介导的 hEPO 在小鼠体内的表达 2. 4. 1 rAAV介导的 GFP 在小鼠骨骼肌中的表达 为验证骨骼肌能否作为 rAAV 介导的外源基因 表达的平台, 采用绿色荧光蛋白( green f luorescent protein, GFP)基因为报告基因, 将病毒颗粒数为 5 @ 1010个的 rAAV- GFP 注射 Balb/ c小鼠的股四头 肌, 定期取肌肉组织, 做冰冻切片, 在激光共聚焦 显微镜下观察 GFP 的表达。结果表明, rAAV- GFP 注射后两周即能观察到 GFP 在小鼠骨骼肌中 的表达[图 3 ( A) ] , 至注射后 5 个月仍可观察到 GFP 的强表达[图( 3B) ]。 2. 4. 2 rAAV介导的 hEPO 在小鼠体内的表达 采用 6~ 8周龄的雄性 Balb/ c 鼠作为实验动物, 分别将 100 LL rAAV- hEPO 注射股四头肌, 即每只 小鼠接受的 rAAV- hEPO 总量为 5 @ 1010个病毒颗 粒。对照组采用 PBS2+ 注射。分别于注射后 2周、4 周、6周、8周、10周处死小鼠, 取全血。用 ELISA 方法测定小鼠血清中的hEPO的含量, 结果见图 4。 接受 rAAV- hEPO 注射的小鼠, 2 周后血清中的 hEPO的含量逐渐升高, 达到对照组的 3倍以上; 4 周后达到高峰, 为 54. 5 IU/ L, 是对照组的 10倍以 上。此后, 血清中的 hEPO的含量有所下降, 至 8 周趋于稳定。我们的实验共进行了 10周, hEPO在 小鼠体内的表达量仍然维持在较高水平( 37. 9 IU/ L)。接受 PBS2+ 注射的对照组小鼠, 血清中的 hEPO含量无明显变化, 均在 5. 5 IU/ L 以下。该结 果表明, rAAV介导的 hEPO 转移可以在小鼠体内 获得持续稳定表达的 hEPO。 2. 4. 3 rAAV 介导的 hEPO 转移对小鼠红细胞比 容的升高作用 小鼠处理方法同结果 2. 4. 2。对 获得的全血测定其红细胞比容, 结果见图 5。在正 常情况下, 小鼠的红细胞比容在 40% ~ 50%之间。 接受 rAAV- hEPO 注射的小鼠, 在 2 周内红细胞比 容尚无明显变化, 但此后急剧升高, 至 4周平均达 到 65. 1% , 其中最高的一只小鼠达到 71. 2%。此 后 , 红细胞比容略有下降, 但在10周内均维持在 Fig. 4 Serum hEPO concentration of Balb/ c mice following rAAV- hEPO administration The data of hEPO con cent rations are the average of three mice. Fig. 5 Hematocrits of Balb/ c mice following rAAV- hEPO administration to skeletal muscle T he data of hematocrit s are the average of three mice. 178 ACTA BIOCH IMICA et BIOPHYSICA SIN ICA Vol. 34, No. 2 60%左右。而接受 PBS2+ 注射的对照组小鼠, 红细 胞比容无明显变化, 均在 50%以下。该结果表明, rAAV介导的 hEPO 转移可以使小鼠体内红细胞数 量明显升高, 并在较长的时期内维持在高水平。 3 讨论( Discussion) 用 rAAV- hEPO 体外转导 BHK 细胞后, 24 h 的细胞上清中 hEPO 的表达量很低; 体内转导小鼠 骨骼肌, hEPO的表达量需要 4 周的时间才达到最 高水平。在用 rAAV- GFP 进行转导时, 转导后 5个 月 GFP 的表达强度高于 2周时的表达强度。以上 这种状况是由 rAAV 本身的表达特点决定的。 rAAV 是一种单链 DNA, 感染靶细胞后必须在细胞 中转变成双链 DNA的形式才能成为具有转录活性 的转录模板。rAAV 感染细胞后的 24 h 内, 只有极 少数细胞中的 DNA 转变成双链形式, 因此能够转 录和表达 hEPO 的细胞很少。在向小鼠骨骼肌进行 体内转导的过程中, 单链的 rAAV DNA在肌细胞 中逐渐转变成双链的形式, 这种过程往往要进行数 周的时间, 才能达到稳定状态, 因此造成了表达高 峰延迟的现象。 需指出的是, 要让 hEPO的基因治疗完全替代 常规的注射基因工程产品 hEPO 的疗法, 必须使 hEPO在体内的水平可以被严格调控, 否则有引起 红细胞增多症的危险。利用可控性的启动子控制 hEPO 表达盒, 采用给药的方式可以控制基因的表 达。目前能够采用的调控系统主要有两种, 一类是 四环素调控系统, 既可用于开放基因表达 ( Tet on) [ 9] , 又可用于关闭基因表达( Tet off ) [ 10] ; 另一 类是 rapamycin 调控系统, 主要用于开放基因表 达[ 11]。采用这类调控系统调控 hEPO 表达的工作 我们正在进行中。 References 1 Xiao X, Li J, Sam ulski R. 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Gene T her , 1998, 5: 1604 ) 1611 11 Rivera VM, Ye X, Courage NL, Sachar J, Cerasoli F Jr, Wilson JM , Gilman M. Long-term regulate expression of grow th hormone in mice af ter intramuscular gene t ransfer. P roc Natl A cad Sci USA , 1999, 96( 15) : 8657 ) 8662 179Mar. , 2002 伍志坚等: 重组腺伴随病毒载体介导的 hEPO 转移及表达 hEPO Transfer and Expression by a Recombinant Adeno-associated Virus Vector WU Zh-i Jian, WU Xiao-Bing* , WANG Hong, LU Bin, DONG Xiao-Yan, HOU Yun-De ( S tat e K ey L abor atory f or Molecular Vi rology and Genet ic Engineer ing , Inst itute of Vi rology , Chinese Academy of Pr eventi ve Medicine , Beijing 100052, China ) Abstract In order to achieve sustained human erythropoiet in ( hEPO) expression in vivo for the t reatment of anemias , recombinant adeno-associated virus ( rAAV )-mediated hEPO t ransfer w as studied in this report. rAAV vector plasmid carrying hEPO was const ructed, and rAAV vector cell line for production of rAAV was also established. By using the / one helper virus- one vector cell line0 st rategy, w hich we reported previously, rAAV containing the hEPO expression casset te w as produced in large-scale. The results show ed that the hEPO expressed ef fectively by rAAV-mediated hEPO t ransfer into cultured BHK-21 cells. Intramuscular inject ion of rAAV- hEPO to Balb/ c m ice resulted in the in v ivo expression of hEPO for at least ten w eeks, along w ith the signif icant elevation of the hematocrits. This report indicates the potent ial use of rAAV-mediated gene transfer for the t reatment of various anem ias. Key words recombinant adeno-associated virus; hEPO; gene transfer; gene therapy; vector Received: September 10, 2001 Accepted: November 2, 2001 T his w ork w as supported by S tate 863 H igh Technology R&D Project of Ch ina ( No. 863-Z20-05-02) * Corresponding author: Tel , 86- 10-63581302; e- mail, w uxb0168@ sina. com 更正启事 发表于本刊 2002 年 34卷第 1期 57 ) 61 页的论文/人白细胞介素 18 半胱氨酸的定点突变及其对活性的影响0 (作者: 裴 冬生 傅 奕 孙亚锋 赵惠仁, 单位: 徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心) , 实际上是研究简报 , 特此声明。 (裴冬生等) 关于本刊对研究简报的定义 最近, 有不少作者来信询问投研究简报有何要求。现在本刊对研究简报的定义为: 应是具有重要结果, 为争取时间以简 要的形式发表的原始研究工作报告。研究简报发表后, 作者可以再另行发表全文, 但在简报中已经发表过的图、表不能再在 该全文中出现, 作者可以通过在全文中引用该简报加以叙述。有创新结果的研究简报可以酌情提前发表。 5生物化学与生物物理学报6编辑部 180 ACTA BIOCH IMICA et BIOPHYSICA SIN ICA Vol. 34, No. 2